反义核酸对肿瘤的治疗作用

鸟氮酸脱羧酶（ODC）是多胺生物合成途径中的限速酶．其活性的异常升高及多胺堆积与恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关。作者构建一个能表达人ODC反义RNA的真核表达质粒pCMV／ODCas，用磷酸钙沉淀法将其导入人肺鳞癌细胞系LTEP-78(L78）经G418筛选，获两株转染细胞系L78／ODCasl和L78／ODCas4。与亲本细胞相比，其生长速度减慢，软琼脂集落形成能力减弱，DNA、RNA及蛋白质等生物合成受到抑制，ODC酶活性降低。经Southern blot及PCR分析，进一步证明了上述变化与ODC反义序列稳定完整地整合到转染细胞基因组中有关。     

ODC反义寡核苷酸对K562细胞的抑瘤作用

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是催化多胺生物合成的限速酶.多胺在维持肿瘤恶性表型中起着重要作用,本室多年的研究表明,控制多胺生物合成可以抑制肿瘤细胞生长,诱导分化,增强对化疗药物的敏感性.近年,我们以ODC为靶基因构建了ODC反义RNA表达载体,以此转染人肺鳞癌细胞,成功地使其恶性表型得到了逆转.进一步说明抑制多胺生物合成     

ODC反义寡核苷酸对K562细胞生长抑制作用

鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是催化多胺生物合成的限速酶.过去的研究表明多胺在维持肿瘤恶性表型中起着重要作用.用ODC不可逆抑制剂抑制多胺生物合成不仅能抑制肿瘤细胞的增殖而且还诱导细胞分化.近年我们采用反义技术,以ODC反义RNA转染肿瘤细胞,通过对ODC表达的封闭,成功地使其恶性表型得到了逆转.提示抑制肿瘤细胞的多胺合成可能是抗癌的有效途径.本文用ODC反义寡核苷酸控制肿瘤细胞的多胺生物合成,观察了其对K562细胞生长特性的影响,以期为ODC反义寡核苷酸在肿瘤临床的应用提供实验依据.     

RAd-ODC／Ex3as对肺癌A-549细胞的抑制作用

鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多胺生物合成途径中的第一个限速酶。据报道，ODC的含量在许多肿瘤中增高，并与肿瘤的复发有一定的关系。为探讨以ODC为靶标进行反义基因治疗的可行性，本实验利用表达ODC第三外显子反义RNA的腺病毒介导的rAd-ODC／Ex3as，将腺病毒介导的ODC反义RNA转入肺癌A-549细胞中，观察其体外抑制肺癌细胞的作用。     

双反义腺病毒载体Ad—ODC—AdoMetDOas对食管癌细胞凋亡及抑制细胞生长影响的研究

目的：探讨双反义腺病毒载体（Ad—ODC—AdoMetDCas）对食管癌Eca109细胞凋亡作用及抑制细胞生长的影响。方法：应用M1Tr法测定不同MOI的腺病毒对肺癌Eca109细胞的基因转染效率，观察Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响；采用Western印迹和HPLC的方法分别检测腺病毒载体对食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用，采用流式细胞术检测腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶反义RNA（Ad—ODCas）和Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞周期分布的影响，同时应用原位末端标记（TUNEL）法观察Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响。结果：MTT法实验表明，Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有显著抑制作用（P〈0．05）。以Ad—ODC—AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞，可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达（P〈0．05）。流式细胞术结果显示感染了Ad—ODC—AdoMetDCas的食管癌Eca109细胞周期阻滞在G。期。HPLC结果显示，食管癌Eca109细胞感染Ad—ODC—AdoMetDCas后，细胞内3种多胺含量均明显降低（P〈0．05）。TUNEL标记检测结果显示，Ad—ODC—AdoMet—DCas可明显引起食管癌Eca109细胞凋亡（P〈0．05）。结论：Ad—ODC—AdoMetDCas能显著抑制食管癌细胞生长，促进细胞凋亡，为探讨食管癌基因治疗的可行性提供实验依据。     

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的：扩增人核糖体蛋白S13（RPS13）编码基因序列，构建其正，反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，利用DNA重组技术的建正，反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，筛选正，反义基因稳定转染细胞，RNA斑点杂交法检测正，反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果：从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA，RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，并经测序证实；目的基因因按正，反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),并经酶切鉴定证实；经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞，反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞，G418筛选获得稳定转染细胞；RNA斑点杂交试验证实；正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调，反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论：成功克隆了人RPS13编码基因序列，并构建了其正，反义真核表达载体，在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞，正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体抑制人食管癌Eca109细胞增殖和侵袭的研究

背景与目的:食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一,对人民的生命和健康危害极大.有研究发现,在食管癌细胞和肿瘤组织中多胺的含量和生物合成明显增高.本研究中我们探讨ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCaa)对人食管癌Eca109细胞多胺合成、细胞增殖和侵袭的抑制作用.方法:采用活细胞计数法和BrdU掺入实验观察Ad-ODC-AdoMetDCas对Eca109细胞增殖的影响;应用Western blot法和HPLC法分别检测腺病毒对Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达的影响,以及胞内多胺合成的抑制作用,采用Matrigel侵袭实验分析腺病毒载体对Eca109细胞侵袭活性的影响,同时检测Ad-ODC-AdoMetDCas对Eca109细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用.结果:活细胞计数法和BrdU掺入实验表明,Ad-ODC-AdoMetDCas对Eea109细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05).Westem blot证实Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制Eea109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达.HPLC结果显示,感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,Eca109细胞内三种多胺腐胺、精脒、精胺含量均明显降低(P<0.05).Matrigel侵袭实验结果显示.Ad-ODC-AdoMetDCas可显著降低Eca109细胞的体外侵袭能力(P<0.05).同时发现,与Ad-GFP相比,Ad-ODC-AdoMetDCas对裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用.结论:ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体具有显著抑制Eca109细胞增殖和侵袭的作用.     

非泛素化蛋白降解体系靶向敲减KRAS癌蛋白的初步研究*

目的:尝试构建能与KRAS癌蛋白相互作用的“RBD+ODC”融合蛋白，经由“鸟苷酸脱羧酶/ 抗酶”系统（onithine decarboxylase/antizyme，ODC/AZ）在蛋白水平直接实现对KRAS癌蛋白的降解。方法:应用分子克隆的方法构建AZ、ODC 、“ RBD+ODC”、突变体“RBD+ODC”、突变体KRAS等真核表达质粒，分别瞬时转染人HEK 293T 和胰腺癌细胞PANC-1，应用Westernblot法在蛋白水平直接检测外源性和内源性KRAS表达水平的改变，应用Co-IP 法检测到“RBD+ODC”能够与KRAS癌蛋白相互作用。结果:成功构建了AZ、ODC 、“ RBD+ODC”、突变体“RBD+ODC”、突变体KRAS等多个真核表达质粒，相较于对照组，“ RBD+ODC”能够在蛋白水平直接实现对外源性和内源性KRAS癌蛋白的“敲减”，并且能够与KRAS有效结合。结论:靶向敲减KRAS癌蛋白的非泛素化蛋白降解体系的构建，为下一步功能试验奠定了基础。      

鸟氨酸脱羧酶反义RNA对人肺鳞癌细胞恶性表型的逆转

在已获两株有鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义序列稳定整合的细胞克隆的基础上，进一步研究发现，反义转染细胞的Ｇ０／Ｇ１期细胞数增多，Ｓ期细胞数相应减少；其软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力均显著下降。核酸杂交结果显示，在反义转染细胞中有ＯＤＣ反义ＲＮＡ表达，ＯＤＣｍＲＮＡ含量明显减少。结果表明，人肺鳞癌细胞恶性表型的逆转与ＯＤＣ反义ＲＮＡ有效控制多胺生物合成有关。     

血管抑素基因转染抑制胆囊癌细胞的实验研究

目的：观察血管抑素基因转染对体外人胆囊癌细胞系GBC—SD细胞株增殖及血管抑素表达和裸鼠致瘤体积的影响，初步探讨血管抑素基因转染抑制胆囊癌细胞生长的可能性。方法：应用pcDNA3．1（＋）-angiostatin基因转染GBC—SD胆囊癌细胞。观察细胞生长情况，制作细胞生长曲线；Western—blot法分析血管抑素的表达情况；裸鼠种植瘤模型观察肿瘤的体积和质量。结果：pcDNA3．1（＋）-angiostatin基因转染的GBC—SD胆囊癌细胞生长明显受到抑制，血管抑素的蛋白表达也明显增加。转染的肿瘤细胞在裸鼠种植瘤明显小于阴性组和空白组。结论：血管抑素基因转染可能具有抑制胆囊癌细胞增殖及生长的作用。     

PAX3-FKHR转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及MyoD表达的影响

目的：研究融合基因PAX3-FKHR对胚胎型横纹肌肉瘤细胞分化及MyoD表达的影响。方法：构建PAX3-FKHR的真核表达质粒，采用脂质体法将MyoD、PAX3-FKHR先后转染人胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞，观察转染前后细胞生物学特性、形态学改变以及肌分化标志蛋白MHC、α-actin的表达。结果：RD细胞在转染PAX3-FKHR后细胞的生长速度、生长方式及MHC、α-actin的表达均无显著的变化；在表达MyoD的RD细胞中转入PAX3-FKHR后，细胞MyoD表达无明显变化，但细胞形态向低分化方向变化，细胞肌球蛋白重链和肌动蛋白α-actin表达显著下降。结论：融合基因PAX3-FKHR转染对培养RD细胞的生物学特性及分化无明显影响，并不影响MyoD的表达，但可抑制MyoD对RD细胞促分化的作用。     

ULBP3基因转染提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性

目的 观察ULBP3基因转染对人外周血NK细胞对Saos-2细胞杀伤活性的影响。方法 用RT-PCR方法从人成骨肉瘤组织中提取ULBP3基因，构建pcDNA3真核表达质粒，以Lipofectamine为载体转染人成骨肉瘤Saos-2细胞，用percoll密度梯度离心法分离人外周血NK细胞作为效应细胞，以Saos-2细胞和转染ULBP3基因的Saos-2细胞作为靶细胞，进行体外杀伤实验，比较两组的特异性杀伤率。结果 在效靶比为30:1时人外周血NK细胞对转染ULBP3基因的Saos-2细胞的特异性杀伤率明显高于对照组。结论 ULBP3基因转染能提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

AnnexinI基因转染对BEP2D细胞生长的影响

研究ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因ｃＤＮＡ转染对生化人支气管细胞系ＢＥＰ２Ｄ生长的影响。方法：ｐＴ７Ｔ３Ｄ质粒经ＮｏｔⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切获得 人ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因ｃＤＮＡ片段，亚克隆至真核表达载体ｐＣＩ－ｎｅｏ，构建人ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因真核表达载体ｐＣＩ－ＡＸＩ。通过采用脂质体介导转染技术，将ＡｎｎｅｘｉｎⅠ的真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入永生化人支气管管细胞系ＢＥＰ２Ｄ；合成ＡｎｎｅｘｉⅠ反应寡     

体内IL—2基因转染小鼠腹腔巨噬细胞的抗肿瘤作用

目的：研究ＩＬ２基因体内转染小鼠腹腔巨噬细胞，探讨基因的表达，抗肿瘤作用及其机理。方法：采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法，将ｐＲＥＰ８ＩＬ２真核表达质粒直接注射至小鼠腹腔，转染腹腔巨噬细胞。结果：ＩＬ２基因可成功地转染腹腔巨噬细胞（ＭФ），并表达基因产物，能有效地抑制肿瘤的生长，转基因ＭФ及其表达产物可使脾ＮＫ活性和内源性ＬＡＫ活性增强，能增加腹腔ＭФ细胞毒活性并使ＭФ分泌ＴＮＦ、ＩＬ１和ＮＯ的水平增加。结论：本实验能有效地激活机体的非特异性免疫功能，从而发挥抗肿瘤效应。     

siRNA介导的Bcl-xL基因沉默诱导人乳腺癌细胞凋亡的研究

目的研究siRNA(small interfering RNA)对MCF-7细胞株Bel—xL基因表达的抑制作用及对癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。方法体外转录法合成特异针对人Bel—xL基因的siRNA；荧光标记法标记Bel—xL siRNA；脂质体法将siRNA转入MCF-7细胞株；流式细胞术检测siRNA的转染效率；半定量RT—PCR法检测siRNA对Bcl—xL基因表达的抑制作用；MTT法检测siRNA对细胞生长增殖抑制作用；荧光染色法观察siRNA诱导细胞凋亡的作用。结果siRNA的转染效率在一定剂量范围内随浓度的增加而增加，siRNA转染组Bcl—xL mRNA表达水平可下调约72％，在对照组内mRNA表达水平无明显改变。细胞生长增殖抑制率在一定范围内具有剂量依赖性和时间依赖性。荧光显微镜下观察肿瘤细胞发现，siRNA50、100、200nmol／L转染组出现典型的凋亡形态学变化。结论脂质体法对siRNA的瞬时转染效率较高，体外转录合成的siRNA能特异有效下调Bel—xL基因的表达，瞬时转染Bel—xL siRNA能有效抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡。低剂量Bcl—xL siRNA对瘤细胞显示了显著的抗增殖作用。     

转染癌胚抗原基因的人树突状细胞疫苗表达的研究

目的 探索使用质粒转导制备转基因DCs疫苗的方法。方法 采用细胞因子rhIL-4和rhGM—CSF诱导培养法制备人外周血树突状细胞，用Lipofectine向人DCs转染含人CEA真核表达质粒。结果 转染组DCs培养上清CEA含量明显高于末转染组培养上清CEA含量。结论 人CEA真核表达质粒转染DCs可内源性表达CEA。     

p21~(waf1)基因转染对乳腺癌细胞增殖活性的影响

目的 探讨p21waf1基因转染对人乳腺癌细胞增殖活性影响及意义.方法 应用脂质体介导法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染入人乳腺癌MCF-7细胞系,并得到稳定的表达.通过荧光定量PCR、Western blot法分别检测p21waf1基因表达及蛋白表达情况, MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 p21waf1基因转染后乳腺癌细胞生长显著受抑制,细胞周期停滞于G1期,转染组G1期、S期和G2/M期细胞比例分别为(70.52±3.21)%、(16.38±1.17)%、(9.42±0.98)%,未转染组则为(49.84±1.58)%、(36.83±1.36)%、(15.64±1.09)%,二者相比差异有统计学意义.结论 p21waf1基因转染能够抑制人乳腺癌细胞周期演进和增殖活性,进而阻止乳腺癌的发生、发展,为乳腺癌治疗的一种新手段.