反义核酸对肿瘤的治疗作用

鸟氮酸脱羧酶（ODC）是多胺生物合成途径中的限速酶．其活性的异常升高及多胺堆积与恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关。作者构建一个能表达人ODC反义RNA的真核表达质粒pCMV／ODCas，用磷酸钙沉淀法将其导入人肺鳞癌细胞系LTEP-78(L78）经G418筛选，获两株转染细胞系L78／ODCasl和L78／ODCas4。与亲本细胞相比，其生长速度减慢，软琼脂集落形成能力减弱，DNA、RNA及蛋白质等生物合成受到抑制，ODC酶活性降低。经Southern blot及PCR分析，进一步证明了上述变化与ODC反义序列稳定完整地整合到转染细胞基因组中有关。     

裸鼠高致瘤性K562-n细胞系代谢相关基因表达变化的研究

目的　探索K5 6 2和K5 6 2 n细胞在裸鼠体内致瘤性不同的分子生物学机制。方法　应用基因芯片技术 ,检测K5 6 2细胞和K5 6 2 n细胞的差异表达基因。结果　在被检测的 12 80 0个基因中 ,一些与细胞物质代谢和物质转运有关基因的表达在高致瘤性K5 6 2 n细胞与K5 6 2细胞之间有显著的变化。K5 6 2 n细胞表达上调的基因包括Dihydrodiol脱氢酶基因、肝Dihy drodiol脱氢酶基因、NAD依赖的亚甲基四氢叶酸脱氢酶 /环化脱水酶基因、人胎盘特异性ATP结合盒转运蛋白基因 ,表达下调的基因包括溶血磷脂酸酰基转移酶基因、线粒体异柠檬酸脱氢酶基因、精氨琥珀酸裂解酶基因、核糖核苷酸还原酶M1亚基基因、焦磷酸法尼酯合成酶基因、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶基因、细胞粘附蛋白SQM1基因等。结论　K5 6 2 n细胞的裸鼠高致瘤性等生物学特性与一系列细胞物质代谢酶和物质转运蛋白基因的表达变化有关。     

肿瘤相关基因SNC90 cDNA真核细胞表达型重组质粒的构建及其转染研究 *

目的:构建肿瘤相关基因SNC90哺乳动物细胞表达型载体并进行转染研究.方法:肿瘤相关基因SNC90cDNA片断亚克隆至哺乳动物细胞表达型质粒pREP9中,并运用脂质体和电穿孔法将重组质粒pREP9-SN90转入3株人大肠癌细胞中,用G418筛选抗性细胞克隆.结果:重组体pREP9-SN90对SW1116,COLO205和SW620肠癌细胞株克隆形成均有一定的抑制作用,抑制率分别为72.2%,74.2%和59.7%.结论:这提示肿瘤相关基因SNC90对肠癌细胞生长起负性调节作用.     

野生型p53基因对人胆囊癌细胞生长及致瘤性的抑制作用

目的:研究野生型p53(wtp53)基因对人胆囊癌细胞生长及致瘤性的影响.方法:应用免疫细胞化学染色、PCR产物直接测序方法分析细胞系遗传背景,在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53,导入GBC-SD细胞中.用G418筛选,建立转染克隆细胞系.以PCR,RT-PCR和蛋白印迹证实外源p53基因的整合与表达;以细胞生长曲线和集落形成实验反映细胞增殖状况;以裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响.结果:GBC-SD细胞P53蛋白过表达;直接测序发现第5外显子126位密码子存在TAC→AAC的碱基突变.外源p53基因已整合入转染后的GBC-SD细胞并获稳定表达.表达外源wtp53的GBC-SD-wtp53细胞生长速率减慢、集落形成能力下降及裸鼠致瘤性受到显著抑制.结论:野生型p53基因可有效抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体内、外生长.     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

细胞因子基因转导的人肿瘤细胞免疫原性及致瘤性研究

用鼠抗人XHLA-A，B，C单抗W6／32及HLA-DR单抗HB55与细胞因子基因修饰肿瘤细胞结合，PAFITC兔抗鼠k为二抗，间接免疫荧光法流式细胞仪测定了HLA-Ⅰ，Ⅱ类抗原表达．与未修饰及空白载体修饰肿瘤细胞相比，基因修饰肿瘤细胞的HLA-Ⅰ，Ⅱ类抗原表达有明显增加，其中IFN-γ作用最强，     

多药耐药相关蛋白反义RNA对耐阿霉素人小细胞肺癌细胞株GLC4/ADR耐药性的调节

目的 构建表达多药耐药相关蛋白（MRP）反义RNA的真核表达载体,转染耐药细胞株,初步探讨其影响多药耐药（MDR）的作用机理。方法 以MRPcDNA为模板,应用PCR扩增MRPmRNA5′端（含起始子密码）及MRP mNRA3′端（含终止子密码）片段,通过定向克隆方法,构建表达MRP反义RNA的两个重组载体。通过Lipofectamine将其导入小细胞肺癌（SCLC）耐阿霉素（ADR）的细胞株GLC4／ADR中,经G418筛选,得到分别含pcDNA3空载（MO）、MRP mRNA5′端为靶区的反义RNA（Ma),MRPmRNA3′端为靶区的反义RNA（Mb)的3个细胞克隆。检测细胞内ADR的蓄积改变以及荷瘤裸鼠对ADR的敏感性。结果 经RT－PCR检测,外源片段可获稳定表达。Ma细胞及Mb细胞中,MRP表达分别抑制约14．0％和83．0％,且胞内ADR蓄积量均有一定程度的增加;对ADR的耐药倍数与对照细胞MO相比,分别下降9．5％和28．4％。虽然,MRP反义RNA对细胞的生长、细胞周期及ADR诱导的早期凋亡均无明显影响,但可提高荷瘤裸鼠对ADR的敏感性。结论 MRP反义RNA能抑制MRP蛋白的表达,并使转染细胞内ADR浓度增加,从而逆转MRP介导的MDR。对于配合化疗,提高MRP高表达患者的疗效,具有潜在的应用意义。     

Survivin反义RNA/HSP70双基因转染对HepG2细胞的影响

目的:探讨survivin反义RNA/HSP70双基因转染对肝癌细胞系HepG2的影响.方法:将已成功获得的双基因载体(pIRES2-ECFP-survivin反义RNA/HSP70)用脂质体介导转染肝癌细胞系HepG2,转染72小时,收集各组细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过RT-PCR、western-blot检测转染后细胞中survivin mRNA、survivin蛋白及HSP70蛋白表达的变化.结果:转染双基因载体与转染空载体的肝癌细胞系HepG2于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光;转染双基因载体的HepG2细胞与转染空载体的HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高.结论:Survivin反义RNA与HSP70双基因转染成功;survivin反义RNA能干扰HepG2内源survivin的表达,HSP70能上调HepG2细胞HSP70蛋白的表达.     

人钠碘转运体基因转染人大细胞肺癌介导~(131)I治疗的实验研究

背景与目的肺癌是严重危害人民生命和健康的常见病。目前世界上倾向于将两类生物学行为不同的肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞性肺癌     

细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA在急性髓细胞性白血病中的表达及与患者临床特征的关系

目的 探讨细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA(ANRIL)在急性髓细胞性白血病(AML)中的表达及与患者临床特征的关系.方法 选取82例AML患者,作为观察组,依据患者病情分为初治组(n=53)、缓解组(n=19)和复发组(n=10),另选取31例非血液病健康者,作为对照组.采用实时荧光聚合酶链反应(PCR...     

Af116609基因对胃癌细胞系SGC7901/VCR耐药性的影响

目的 研究Af116609基因转染胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR后,对胃癌细胞耐药性的影响。方法 采用RT-PCR法克隆Af116609基因,用Northern blot检测其差异表达,以基因转染技术调节其表达,通过体外药敏实验观察其对胃癌耐药表型的影响。结果 从胃癌耐药细胞SGC7901／VCR中克隆到Af116609基因的CDS序列327bp,该序列与GenBank登录的一致。Northern blot结果显示,该基因在耐药细胞高表达。体外药敏实验发现,转染正义真核表达载体的药敏细胞中该基因上调,对长春新碱、5-氟脲嘧啶和阿糖胞苷的耐药性增加,而对阿霉素的抗性有损害,对氨甲喋呤的抗性无明显影响;转染反义真核表达载体的耐药细胞中该基因下调,对上述5种药物的抗性均减弱。结论 Af116609基因与胃癌MDR表型相关,可作为逆转胃癌MDR的候选靶分子。     

人α1抗胰蛋白酶基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的克隆人α1抗胰蛋白酶(α1-AT)基因并在真核细胞中表达。方法以人α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)基因的总RNA为模板，采用反转录PCR法得到α1-AT的编码区cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-α1-AT，在脂质体介导下转染非洲绿猴肾细胞系COS-7，经G418压力筛选建立稳定转染人α1-AT的细胞系，用Western印迹检测其在COS-7细胞中的表达。结果获得的人α1-AT cDNA序列与文献报道的核苷酸序列一致，Western印迹证实稳定转染人α1-AT的COS-7细胞系中有α1-AT的表达。结论构建了人α1抗胰蛋白酶的真核表达载体，并在COS-7细胞中获得稳定表达。     

转染IkBα基因抑制NF-KB活性对A549细胞侵袭行为的影响

背景与目的:近年来的研究显示核因子-KB(nuclear factor-kB, NF-kB)的活化能够调节肿瘤细胞的侵袭和转移.本研究探讨抑制NF-kB的活性对A549细胞侵袭能力的影响及其可能的机制.方法:构建表达NF-kB抑制物a同分异构体(inhibitor of NF-kB, α isoform, IkBα)的真核表达重组质粒pcDNA3.1( )/IkBα.体外培养A549细胞,分为未转染组(不转染质粒)、转染pcDNA3.1( )组、转染pcDNA3.1( )/IkBα组,分别转染相应的质粒.应用RT-PCR、Western blot检测各组细胞IkBα的表达情况,应用凝胶电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)检测各组细胞NF-kB的活性,应用Transwell侵袭小室检测各组细胞的侵袭能力,应用RT-PCR方法检测各组细胞MMP-2、MMP-9的mRNA水平,应用明胶酶谱法检测各组细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的活性.结果:酶切鉴定结果显示pcDNA3.1( )/IkBα质粒构建成功.RT-PCR和Western blot检测结果表明构建的pcDNA3.1( )/IkBα质粒能够在A549细胞中表达IkBα.转染pcDNA3.1( )/IkBα组A549细胞NF-kB活性、侵袭细胞数目、MMP-2活性及MMP-9活性均低于未转染组和转染pcDNA3.1( )组(P值均<0.05),而转染pcDNA3.1( )组与未转染组之间的差异均无统计学意义(P值均>0.05).结论:转染IkBα基因能够抑制A549细胞中NF-KB的活性.NF-kB的活性下降能够抑制A549细胞的侵袭能力,其机制可能与MMP-2、MMP-9表达下调有关.     

沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的构建H-ras靶向短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)质粒,研究其对人涎腺腺样囊性癌裸鼠成瘤的抑制作用及其对移植瘤细胞增殖活性及细胞凋亡率的影响.方法构建含H-ras靶向特定序列的真核表达质粒pHRAS,稳定表达pHRAS质粒的细胞为实验组,未处理的SACC-M细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型,计算成瘤率;移植瘤原代培养检测质粒表达及瘤细胞增殖活性;免疫组织化学法检测瘤内H-ras蛋白表达;采用组织学观察、流式细胞术及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况.结果pHRAS质粒转染组成瘤率及肿瘤体积显著低于对照组,原代培养可见大量瘤细胞表达绿色荧光.实验组瘤内H-ras蛋白表达量明显减少,实验组肿瘤细胞凋亡率为(41.55±4.25 )%,明显高于对照组的(4.73±1.35) %(P＜0.05).结论shRNA沉默H-ras基因能抑制SACC-M细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,在体内有效下调H-ras蛋白的表达,且对肿瘤细胞具有促凋亡作用.     

RNAi介导的survivin基因沉默对PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响

目的:研究survivin基因表达沉默后对PC-3细胞的裸鼠体内成瘤率,瘤体生长速度,以及平均瘤重等方面产生的影响.方法:使用RNA干涉技术,用构建的pSilencer 3.1-SVV1、pSilencer 3.1-SVV2、 pSilencer 3.1-SVV3 siRNA表达质粒和阴性对照质粒pSilencer 3.1-NC转染PC-3 细胞,使PC-3 细胞的survivin 基因表达沉默,随后将细胞接种于裸鼠皮下,观察转染了各质粒的PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率,瘤体生长速度,以及平均瘤重等方面的变化.结果:pSilencer 3.1-SVV2和pSilencer 3.1-SVV3质粒转染组的裸鼠肿瘤成瘤率明显下降,裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer 3.1-NC质粒转染组(P＜0.01).实验终止时,肿瘤平均体积与瘤重与未转染组和pSilencer 3.1-NC质粒转染组相比减少50%-55%.结论:RNAi 介导的survivin 基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力及瘤体生长速度.