肿瘤抗原多肽诱导的CD8~+CTL的体内外抗瘤效应

利用海绵移植模型,将Friend小鼠白血病病毒gag编码的二个多肽CCLCLTVFL(gPr80 gag 85-93)和RSPTNLAKV(Pr65 gag P30 131-139)分别注入正常或经FBL-3肿瘤细胞免疫过的C57BL/6小鼠皮下的植入海绵中,10天后,收集海绵中浸润淋巴细胞,在体外用免疫肽周期性刺激培养扩增。实验结果表明:用多肽体内免疫正常或经FBL-3免疫的B6小鼠均能诱导出对免疫多肽特异的CD8~ CTL。其中,P85-93多肽诱导的CD8~ CTL除能杀伤该多肽致敏的同系靶细胞外,还能特异性杀伤FBL-3瘤细胞.抗原多肽诱导的CD8~ CTL在体外经用免疫多肽致敏的同系小鼠脾细胞作周期性刺激并在低浓度IL-2的条件下培养,可长期生长并大量扩增。用体外培养扩增的P85-93多肽特异性CD8~ CTL过继转输治疗FBL-3荷瘤小鼠,能有效治愈FBL-3白血病荷瘤小鼠。上述结果表明,用肿瘤抗原多肽替代肿瘤细胞体内免疫动物可诱导特异性抗瘤效应的CD8~ CTL,并可在体外扩增用于肿瘤过继性免疫治疗。     

体外扩增的脐血细胞移植BABL/c小鼠的实验研究

目的探讨体外扩增后脐血单个核细胞(CBMC)的应用价值。方法随机分组的BABL/c小鼠经亚致死量照射后,每组分别由尾静脉注入新鲜CBMC悬液、不同细胞因子组合(TPO+FL+IL-6、TPO+FL+IL-6+IL-3)扩增后的CBMC悬液、脐血全血和生理盐水。比较各组小鼠的存活率及造血恢复情况,并应用PCR和免疫组化方法观察小鼠体内人源细胞植入情况。结果扩增前后CBMC均可在BABL/c小鼠体内植入并重建造血功能,且存活率与植入率无显著性差异(P>0.05)。实验组造血恢复情况优于对照组。含IL-3的细胞因子组合对CBMC的扩增效果(8.96±0.52倍)优于不含IL-3者(6.28±0.16倍)(P<0.01)。结论体外扩增后CBMC数量显著增加,且保持了其重建造血功能及植入潜能,比新鲜的CBMC有更大的应用价值。     

脐血造血干/祖细胞体外扩增实验研究

目的:探讨人脐血造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSC/HPC)在适合临床移植条件下体外扩增以获得理想的造血干/祖细胞数量的最佳细胞因子组合及扩增时间,为脐血经体外扩增后成为高体重受者克服脐血移植细胞数量不足及缩短植入时间提供客观指标。方法:采集脐血4份,分离单个核细胞(mononuclear,MNC),免疫磁珠分选(MiniMACS)CD+34细胞,分别在细胞因子组合为A:SCF+FL+TPO、B:SCF+FL+TPO+IL蛳3及C:SCF+FL+TPO+G蛳CSF支持的无血清、无基质的液体培养基中扩增培养14 d,收集扩增前、扩增后7 d及14 d的细胞进行细胞表型分析、半固体集落培养及端粒酶活性分析。结果:在含细胞因子IL蛳3组扩增培养7 d及14 d,均获得了总有核细胞数(total nucleated cells,TNC)及集落形成细胞(colony蛳forming cell,CFC)最大的扩增倍数。扩增7 d,IL蛳3组的CD+34细胞扩增倍数为(10.11±7.21 )倍,较其他两组稍低,但无统计学意义;三组CD+33细胞、CD+41细胞、CD+71细胞也得到了较大程度的扩增,IL蛳3组高于其他两组;3组扩增后的细胞端粒酶活性均上调,7 d时A值达最高,IL蛳3组低于G蛳CSF组(P =0.008)。随着扩增时间的延长,扩增后的细胞端粒酶活性下降;CD+34细胞占TNC的比例也明显下降,部分定向祖细胞的比例也出现先升高后     

肿瘤特异性γ δ T细胞扩增体系的建立及其抗肿瘤活性研究

目的:建立一种体外诱导肿瘤细胞特异性γ δ T细胞的培养体系.方法:从人外周血中分离单个核细胞(PBMCs),用不同浓度的磷酸抗原(IPP)与rhIL-2联合刺激γ δ T细胞增殖,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后 CD3+Vγ9+的 γ δ T 细胞数量以及比例,并计算其扩增效率.结果:经15天扩增培养后,高浓度组10μg/ml 的IPP联合500IU/ml rhIL-2刺激得到的γ δ T细胞的扩增效率最高,且扩增培养至第9天的γ δ T细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤活性.结论:适宜浓度磷酸抗原(IPP)联合rhIL-2能有效体外诱导具有较强抗肿瘤活性γ δ T细胞的扩增.     

比较不同磷酸抗原体外扩增前列腺癌患者外周血γδ T细胞的效率

目的:研究唑来膦酸(Zoledronate acid)和异戊烯焦磷酸(IPP)体外扩增前列腺癌患者外周血中γδ T细胞的效率.方法:密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞(PBMCs),分别加入5.0 μmol/L Zol 或10.0 μg/ml IPP联合1 000 IU/ml的rhIL-2于含10%自体血浆的AIM-V培养体系培养,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后 CD3+Vγ9+的γδ T细胞数量和比例,并计算其扩增效率.结果:经14天扩增培养后,两种磷酸抗原均能在体外扩增前列腺癌患者外周血中的γδ T细胞,Zol组的γδ T细胞在淋巴细胞中最高含量达64.7%,IPP组最高达55.9%,且扩增培养至第9天的γδ T细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤活性,但Zol组的扩增效率以及细胞的杀伤活性均明显强于IPP组(P<0.05).结论:Zol具有与IPP体外扩增外周血中γδ T细胞的能力,Zol刺激法可能成为体外扩增前列腺癌患者外周血中γδ T细胞更为经济安全的选择.     

诱导体外扩增的小鼠骨髓CD34+造血细胞分化为树突状细胞

诱导体外培养扩增后的小鼠骨髓ＣＤ３４＋造血细胞分化为树突状细胞（ＤＣ）。方法Ｃ５７ＢＬ／６ｊ小鼠骨髓ＣＤ３４＋细胞采用血管内皮细胞共培养方法进行体外扩增，扩增后的ＣＤ３４＋细胞经磁性细胞分选技术纯化，并用ＧＭ┐ＣＳＦ等细胞因子诱导其向ＤＣ分化。结果小鼠骨髓ＣＤ３４＋造血细胞不论是否经过体外培养均可被诱导分化为ＤＣ，后者具有典型的树突状形态特征，表达高水平的ＭＨＣⅠ、Ⅱ类抗原和ＣＤ８６共刺激分子，在混合白细胞反应（ＭＬＲ）中能有效地刺激静息期Ｔ淋巴细胞增殖。结论小鼠骨髓ＣＤ３４＋细胞经体外培养扩增后仍然具有向ＤＣ分化的能力，通过骨髓细胞体外培养扩增可以显著提高ＤＣ产量。     

头颈部鳞癌TIL细胞制备的方法学研究

从实体肿瘤中分离到的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在体外经IL2激活后可大量扩增，并对肿瘤细胞有高度杀伤活性。本文对6例头颈鳞癌本院实体标本用直接法和酶消化法分离培养，并对两种培养方法进行细胞表型及活性测定，靶细胞为自体瘤细胞及K562细胞。结果显示：分离细胞数，     

联合应用IL-2和IL-7对增强T细胞体外增殖及功能的作用

应用体外诱导扩增的抗原特异性T细胞治疗恶性肿瘤及某些病毒性疾病已成为一种有效的临床免疫治疗方法，这一方法常规需要用特异性抗原(灭活的肿瘤细胞或提纯抗原)以及抗原递呈细胞作周期性刺激诱导，并在含特定细胞因子，如IL-2的培养系统中扩增以获得具有足够治疗剂量的功能性T细胞。     

体外扩增肾癌患者自体NK细胞及其对人肾细胞癌786-O细胞的杀伤

目的:探究IL-15、4-1BBL基因修饰的人白血病K562细胞(modi-K562细胞)联合IL-2体外高效扩增肾细胞癌患者自体自然杀伤(natural killer,NK)细胞的方法,研究扩增前后NK细胞对肾癌细胞株786-O的杀伤作用。方法:10例肾癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)与modi-K562细胞在含不同浓度IL-2培养液中共育14 d,采用流式细胞术、Calcein-AM释放实验检测NK细胞的扩增情况、免疫表型及对肾癌786-O细胞的杀伤作用。结果:modi-K562细胞联合IL-2可有效扩增NK细胞,300 U/ml IL-2培养14 d时,NK细胞扩增(202.4±12.8)倍。在效靶比为20∶1时,扩增后NK细胞对786-O细胞的杀伤率为(72.0±4.3)%,显著高于扩增前NK细胞的杀伤率(34.2±3.6)%(P<0.01)。结论:IL-15、4-1BBL基因修饰的K562细胞联合IL-2在体外能有效扩增肾细胞癌患者NK细胞,扩增后NK细胞对肾癌786-O细胞的杀伤作用显著增强。     

恶性黑色素瘤冷冻瘤苗激活的TIL在体外抗肿瘤活性的研究

目的 寻求提高肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的抗肿瘤活性。方法 通过应用恶性黑色素瘤冷冻瘤苗来激活TIL，观察其抗肿瘤活性的改变。结果 经冷冻瘤苗激活的TIL在培养扩增10、20、30和40d的体外对自体恶性黑色素瘤细胞的杀伤率均有明显提高，其中以培养扩增30d时为最高。结论 经恶性黑色素瘤冷冻瘤苗激活的TIL具有更高的体外杀伤自体恶性黑色素瘤细胞的能力。     

两种不同成分培养基制备CIK细胞的生物学特征

目的:采用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK cell)培养基(含低浓度IL-2、IFN-γ、IL-12和anti-CD3)和NK培养基(含高浓度IL-2和anti-CD3)体外刺激诱导CIK,分析CIK细胞的扩增、表型和细胞因子分泌情况。方法:健康自愿者来源的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),分别加入CIK培养基和NK培养基进行诱导培养,24 h后,换用含IL-2的1%自体血浆培养基继续诱导培养2周。在培养的第6天和第10天检测培养上清中IFN-γ的分泌情况,在培养的第10天以流式细胞术检测两组培养细胞表面CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达情况。结果:CIK培养基和NK培养基均可使培养细胞在第7天时开始明显扩增,第10天时可扩增至200倍。其中,CIK培养基获得的细胞扩增倍数明显高于NK培养基,其IFN-γ分泌明显高于NK培养基组[(724.7±434.8)vs(108.9±60.6)pg/ml,P<0.01];而以NK培养基培养的细胞,CD3-CD16+CD56+细胞比例高于CIK培养基[(6.27±3.33)%vs(2.88±1.88)%,P<0.05]。结论:不同成分的CIK培养基和NK培养基均可促进CIK细胞的扩增和成熟,但呈现不同的生物学特征。     

无血清培养法分离并鉴定胰腺癌细胞系BxPC-3中肿瘤干细胞

[目的]从人胰腺癌细胞系BxPC-3中分离并鉴定胰腺癌干细胞。[方法]用无血清培养基培养人胰腺癌BxPC-3得到肿瘤细胞球。将肿瘤细胞球传代扩增,观察各传代后细胞成球能力;并用含血清培养基诱导促使其分化;蛋白印迹法测定肿瘤干细胞特异性转录因子OCT-4蛋白表达情况,并将肿瘤细胞球细胞植入NOD/SCID小鼠皮下,观察移植瘤的形成。[结果]在无血清培养基中,BxPC-3细胞能形成少量肿瘤细胞球,具有很强的自我更新能力,成球能力随着球体细胞传代次数的增加而增加。在含血清环境中,球体细胞逐渐分化而呈贴壁生长。肿瘤细胞球OCT-4蛋白表达明显高于BxPC-3贴壁细胞。1×104个球体细胞即能在NOD/SCID小鼠皮下成瘤。[结论]无血清培养能够有效的分离和扩增人胰腺癌细胞系BxPC-3的肿瘤干细胞。     

细胞因子扩增脐带血CD_(34)~+细胞中LTC-IC的变化

目的 :探讨脐带血造血干细胞的体外扩增及移植最佳时机。方法 :免疫磁珠法分离纯化脐带血 CD+ 3 4细胞 ,在细胞因子 FL T3配体、血小板生成素作用下 ,进行体外扩增 ,流式细胞仪检测培养体系中 CD+ 3 4 细胞数量的变化 ,甲基纤维素法检测 CFU - GM、长期培养起始细胞 ( L TC- IC)。结果 :经过 2周的培养 ,有核细胞扩增 ( 2 1± 5 )倍 ,CD+ 3 4 细胞扩增 ( 9± 3 )倍 ,CFU- GM扩增 ( 164± 5 1)倍 ,L TC- IC扩增 ( 6.5± 3 .1)倍 ,随着体外培养时间的延长 ,有核细胞、CD+ 3 4 细胞和 CFU- GM得到进一步扩增 ,但培养体系中已缺少 L TC- IC。结论 :FL T3配体联合血小板生成素能扩增具有造血干细胞特征的 L TC- IC细胞 ,培养时间以 2周为佳     

脐血造血细胞的体外扩增及分化特性 *

了解造血生长因子的不同组合对人脐血CD34 +细胞的扩增效应及分化特性。方法： 采用人脐血单个核细胞(MNC)经rhIL-1,rhIL-3,rhIL-6,rhG-CSF,rhGM-CSF和rhSCF的不同组合进行体外扩增培养, 动态观察了不同细胞因子组合对有核细胞总数的扩增数量,应用流式细胞技术(FACS)动态分析了造血细胞的表面标志, 并对液态扩增后造血细胞的粒 巨噬集落形成率(CFU-GM)进行了动态观察。结果:经上述6种细胞因子培养20 d, 有核细胞总数增殖44倍, 液态扩增培养8 d后, CFU-GM比原代MNC增加14.74倍, 扩增18 d后, CFU-GM明显减少, 仅为原代MNC的6.42倍, 且集落小于前者。扩增培养至6～8 d时, CD34+细胞总数是原代MNC的127.79～196.40倍, 18 d时下降至101.51倍。结论： 外源性造血生长因子可使脐血CD34+细胞及CFU-GM产生明显的扩增效应。     

肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。     

FL联合TPO体外培养AC133+细胞表面标记的变化

目的:探讨脐血造血干/祖细胞的体外扩增.方法:免疫磁珠法分离纯化脐血AC133+细胞,在细胞因子FLT3配体、血小板生成素作用下,体外扩增,检测有核细胞扩增的倍数.采用流式细胞仪分析细胞表面标志的变化.结果:FLT3联合血小板生成素体外培养2周.有核细胞扩增(18±8)倍.CD34细胞扩增2.8倍,AC133+未获扩增,CD34细胞纯度由(56±23)%下降到(8±1)%,AC133+细胞由85%下降到(0.1±0.1)%.随着体外培养时间延长至4周,有核细胞,CD34+进一步扩增.分别扩增475倍和17倍.但细胞随之发生分化,CD34+细胞占有核细胞中的比例下降至2%,AC133+细胞消失.CD45细胞上升到1.3%.结论:FL联合TPO长期培养AC133+细胞能使CD34细胞扩增.     

CD3抗体激活的杀伤细胞实验性抗喉癌作用的研究

基于CD3抗原广泛存在于成熟T细胞表面的理论基础,我们应用CD3单克隆抗体与IL-2在体外成功诱导出了具有较好增殖活性的CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3AK细胞),并对其抗喉癌作用进行了观察和研究.结果表明:与常规培养的LAK细胞相比,以健康人新鲜外周静脉血单个核细胞为前体、经CD3单抗(4μg/ml)和IL-2(1000U/ml)诱导产生的CD3AK细胞具有集落形成率高、体外扩增能力强、存活时间长、抗瘤作用持久稳定等优势.在培养初期,CD3AK细胞的扩增情况与LAK细胞相似,但CD3AK细胞生长后劲明显,于培养8～10天达增殖高峰,平均扩增18.5倍,并可维持体外长期存活达两周之久,而同期培养的LAK细胞1周时平均仅增5.5倍,且多于1周后逐渐死亡,二者相比有非常显著性差异;同时,CD3AK细胞在体     

自体TIL治疗癌性腹水的疗效观察

在肿瘤生物治疗中，TIL是肿瘤(AIT)中最为有效的抗肿瘤免疫活性细胞，而且越来越引起人们的重视。1986年Rosenberg等报道，TIL在体外经rIL-2培养扩增后．具有比LAK细胞更强的抗肿瘤效果。TIL可渗入到组织中，对肿瘤细胞具有高效、特异性的杀伤作用。近年来，我室对几种肿瘤过继免疫疗法进行了较为系统的研究，     

四种NK细胞体外扩增方案的比较

目的： 通过对4种NK细胞体外培养方案扩增后产物的细胞免疫表型、扩增倍数以及杀伤活性进行比较,确定一种高效的NK细胞体外扩增方案。 方法: 建立4种NK细胞体外培养方案：方案1为经典的NK细胞体外扩增方案(IL-2+IL-15);方案2为IL-2+IL-15+IL-18;方案3为IL-2+IL-15+IL-7;方案4为新型NK培养基（IL-2+OKT3）。收集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年2月至2012年4月间10例晚期实体瘤患者的PBMC,按照4种方案进行体外扩增。在体外扩增的0、5、10、15 d,采用流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群（尤其是NK细胞）的比例;比较各方案体外扩增15 d后的NK细胞的扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化,并采用LDH法检测各方案扩增产物对人白血病K562细胞的杀伤活性。结果： 上述4种NK细胞培养方案体外扩增15 d后,细胞总数分别扩增（40.1±20.00）、（44.08±22.09）、（44.82±23.67）、（46.82±2502）倍,其中NK细胞的扩增倍数分别为（75.86±28.57）、（93.32±32.16）、（88.66±24.94）,（58.88±41.53）倍。NK细胞比例由0 d的（20.44±2.23）%分别扩增至15 d的（48.30±13.90）%、（54.72±12.25）%、（55.94±12.70）%和(54.5±14.93)%;各培养方案组在总细胞扩增倍数、NK细胞扩增倍数上的差异均无统计学意义（P>0.05）。前3种培养方案体外扩增产物的杀伤活性明显高于方案4\[（63.40±500）%、（77.30±9.40）%、（62.17±5.60）% vs （37.39±10.42）%,均P<005\],而方案1、2、3之间体外扩增产物杀伤活性的差异则无统计学意义（P>0.05）。 结论： 细胞因子组合对于体外大规模培养NK细胞有着一定的优势,但不同的细胞因子组合（方案1中是否加入IL-18或IL-7）对NK细胞体外大规模扩增的影响差异并不显著;但前3个方案扩增产物对K562细胞的杀伤活性明显强于方案4。     

急性髓性白血病细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的:研究急性白血病细胞体外培养的方法及其在体外培养过程中生物学特性的变化.方法:分别收集10例急性髓性白血病细胞,用含细胞因子无血清液体培养基进行培养2～4周,并对培养前后细胞进行细胞计数,流式细胞仪检测CD33、CD13、CD34及CD14表面抗原鉴定细胞分化,半固体培养法对培养前后的白血病细胞进行集落形成能力检测.结果: 含细胞因子无血清液体培养基能有效支持AML细胞进行体外短期培养及增殖, 14 d时细胞得到明显增殖,达(25 1±11 7)倍,优于培养前,P<0 05;培养28 d时细胞数较前明显减少,P<0 05.集落形成单位培养14 d后与培养前比较差异无统计学意义,P>0 05;但培养28 d后显著低于培养前,P<0 05.在体外悬浮培养14 d时,CD33、CD13、CD34及CD14的表达率与培养前差异无统计学意义(P>0 05),但至28 d时,CD33、CD13及CD14的表达率高于培养前,而CD34表达率比培养前降低,P<0 05.结论: 含细胞因子无血清液体培养基能有效支持急性髓性白血病细胞短期体外培养并维持其生物学特性.