HBsAg和GM-CSF融合表达质粒的构建

目的：构建乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒，借助GM—CSF的免疫佐剂作用，提高乙型肝炎DNA疫苗的免疫效果。方法：用PCR方法分别从pEcob6和pCD-hGM—CSF中扩增出基因S和GM-CSF，克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )中，构建pcDNA3．1-S及融合表达质粒pcDNA3．1-GM-CSF-S，然后以重组质粒转染真核细胞，研究重组质粒体外表达。结果：经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒构建正确，细胞转染试验表明重组质粒能在COS-7及HepG-2内表达。结论：乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒构建成功，重组质粒能在真核细胞内表达。     

利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换

目的 以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(glypican-3,GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗.方法 以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板,应用重延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因HBsAg/GPC3,将其插入pBSSK+载体中,构建出pBSSK/GPC3载体.利用DNA重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,将真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,构建表达CTL表位EYILSLEEL的DNA疫苗.结果 酶切和测序的结果显示序列无错配,获得了完整表达EYILSLEEL表位的真核质粒pcDNA3-HBsAg/GPC3.结论 成功将EYILSLEEL表位替换HBsAg的内源性CTL表位,构建了pcDNA3-HBsAg/GPC3真核表达质粒.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒pGEM-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒,然后,再用PCR方法,从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70,将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接,构建HBsAg和HSP70融合表达质粒pcDNA3。1－SHSP70,结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确,结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。     

EGFP-Cre重组酶真核表达重组质粒的构建及表达

目的 构建噬菌体P1 Cre重组酶真核表达重组质粒,检测其在体外的表达情况和生物学活性.方法 利用分子克隆技术,将cre编码序列克隆到真核表达质粒pIRES2-EGFP上,构建为重组质粒pCMV-Cre-EGFP.行菌液PCR、BamHⅠ酶切及测序鉴定,用FuGENE 6介导转染293T细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析Cre重组酶的表达和重组效应.结果 经菌液PCR、酶切及测序等鉴定分析,证实已将目的片段cre插入pIRES2-EGFP的多克隆位点上;建立Cre( )组(pCMV-Cre-EGFP和含Loxp-CMV-RFP-Loxp的pCSilencer质粒)和Cre(-)组(pIRES2-EGFP和pCSilencer),转染293T细胞,48 h后荧光显微镜下可见2组均表达绿色荧光和红色荧光,Cre( )组的红色荧光少于Cre(-)组;流式细胞仪检测荧光蛋白表达率,统计学分析显示2组细胞的红色荧光蛋白表达率存在显著性差异(P＜0.01).结论 成功构建噬菌体P1Cre重组酶表达重组质粒,并能在体外表达具有活性的Cre重组酶.     

带有6肽组氨酸的HBV S/S145真核表达载体的构建及应用

目的 构建稳定表达带有6肽组氨酸的HBV S/S145蛋白的真核载体.方法 应用PCR技术及体外基因重组技术,将S基因和nt587突变的S基因插入带有his-tag的pxF2RH载体中,扩增6个组氨酸和S/S145基因,最后与经Nhe I、Sal I双酶切的线性载体pCI-neo连接,构建成带有6肽组氨酸的稳定表达S/S145的真核表达载体(简称pCI-his-SY/S145).用脂质体转染的方法将质粒转至人宫颈癌细胞,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中抗原的分泌情况.用Western-blot方法检测细胞中外膜蛋白的表达情况.结果 真核表达载体pCI-his-SY/S145的测序结果与预期大小一致.ELISA方法可检测到细胞上清中的野生型表面抗原,但检测到145突变抗原表达水平低.应用Western-blot方法可以同时检测到野生型和G145R突变的外膜蛋白表达.结论 带有his-tag的重组质粒pCI-his-S/S145可以在Hela细胞中成功表达融合蛋白,且组氨酸可作为检测蛋白的标志.     

大鼠EPO真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建表达大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的真核表达质粒pEGFP-NI/EPO,并检测其在体外的表达.方法 从大鼠肾脏获得EPO基因片段并用RT-PCR方法 扩增,将其连接于真核表达质粒pEGFP-NI,测序鉴定后,用脂质体包裹转染大鼠骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cels,MSCs),采用免疫组化和RT-PCR检测EPO的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染大鼠MSCs细胞后可表达EPO蛋白.结论 成功构建的pEGFP-NI/EPO重组质粒能在体外表达EPO蛋白.     

基因Ⅳ型HEV ORF3真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建基因Ⅳ型HEV ORF3的真核表达栽体.方法 从患者血清中提取HEW RNA,利用RT-PCK技术扩增HEV ORF3基因,EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFPC2真核表达载体,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPC2-OPF3.将重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,Western blot分析鉴定EGFP-ORF3融合蛋白的表达.结果 真核表达质粒转染HepG2细胞,Western blot在39.8kD左右有一条强的棕色条带.结论 成功构建pEGFPC2-ORF3真核表达质粒,在HepG2细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础.     

人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性.方法 全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性.脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达.结果 正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达.结论 采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达.     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH...     

丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达简

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原（HBs）嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定。方法采用重叠拼接PCR法,将HCVAR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H—AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV—HA载体中,构建pCMV-HA-AR3-s真核表达质粒。脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Western blot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况。结果PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCVAR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1118bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24HAR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1128bp的AR3-S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA—AR3-S构建正确,Westernblot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3-S重组蛋白。结论成功构建pSVB-24H—AR3和pCMV—HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立 ＨＢＶ复制状态模型。方法体 外连接 ＨＢＶ（ａｙｗ亚型） ＤＮＡ获得 ６．４ ｋｂ的双拷贝 ＤＮＡ片段,然后将其插入 ｐｃＤＮＡ３载体的 ＥｃｏＲＶ位点。结果通过 聚合酶链反应（ＰＣＲ）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝ＨＢＶ全基因重组真核表达质粒。结论成功构建了ＨＢＶ 全基因重组真核表达质粒。     

IL—12提高DNA疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤的免疫研究

目的 观察ＩＬ－２真核表达载体（ｐＷＲＧ３１６９）对ＨＢＶ－ＳＤＮＡ疫苗（ｐＣＲ３．１－Ｓ）诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ）成瘤性的影响。方法肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ活性。结果 对照组、ｐＣＲ３．１－Ｓ及共同免疫     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

乙型肝炎病毒前S2/S与重组人GM-CSF融合基因的分子克隆及鉴定

目的为探讨乙型肝炎病毒前S2(preS2)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)对乙型肝炎疫苗的免疫增强作用,构建S2／S(preS2 HBsAg)与GM—CSF融合基因真核表达载体。方法采用PCR技术分别扩增出S2／S大小约846bp的编码基因片段和带有15个甘氨酸接头序列的GM—CSF约450bp编码基因片段,经T-A克隆后分布克隆至载体PcDNA3．1中,获得PcDNA3．1-S2／S-GM-CSF融合基因表达载体,利用酶切、PCR和DNA序列测定进行鉴定插入片段的大小和方向。结果经过鉴定该融合基因全长约1300bp,证实为S2／S-GM-CSF融合基因。结论乙型肝炎病毒(HBV)S2／S和GM—CSF融合基因真核表达载体构建成功,为进一步研究其表达和生物学活性奠定了一定基础。