低频超声选择性开放血肿瘤屏障的实验性研究

目的 探讨低频超声对血肿瘤屏障通透性的影响.方法 试验用80只健康成年Wister大鼠.采用1MHz超声探头、功率12mW,对移植肿瘤部位照射时间为20s,按照射与否及照射后时间分为正常对照组、肿瘤对照组及实验组,测定血一肿瘤屏障通透性的改变,透射电镜观察微血管内皮细胞紧密连接及神经元超微结构改变.结果 1MHz超声照射大鼠移植瘤部位后,血-肿瘤屏障通透性先增加后恢复至正常水平,即在3h达到峰值,12h恢复到照射前的水平.透射电镜超微结构显示超声照射后引起照射部位微血管内皮细胞的紧密连接开放;同时观察到照射后胶质瘤细胞呈现不同时期凋亡的改变,而正常神经元仅有膜结构的轻微改变.结论 低频超声可以选择性、可逆性开放血肿瘤屏障,其机制可能与紧密连接的开放有关.     

中枢神经系统隐球菌感染发病的分子机制

中枢神经系统隐球菌感染在中枢神经系统真菌感染中最为常见，且病死率长期以来居高不下，目前其发病机制尚不十分明确。因隐球菌主要通过血运播散，透过血-脑脊液屏障进入中枢神经系统，因此如何透过血-脑脊液屏障是其致病机制的研究热点。血-脑脊液屏障是介于血液和脑组织之间紧密连接的网状结构，由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞共同组成。     

肿瘤坏死因子-α在缓激肽开放血肿瘤屏障过程中的作用

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在缓激肽(BK)开放血肿瘤屏障(BTB)过程中的作用。方法:缓激肽处理C6细胞和胶质瘤大鼠后,放射免疫法动态监测培养液和脑胶质瘤组织内TNF-α浓度。利用伊文思蓝连续监测缓激肽/TNF-α处理后的C6恶性胶质瘤大鼠血肿瘤屏障的通透性,同时电镜观察血肿瘤屏障的病理学改变。结果:缓激肽可增加C6细胞培养液和胶质瘤大鼠肿瘤组织内的TNF-α含量,且两者均于给予缓激肽后15min时达高峰(与对照组相比有显著统计学意义,P<0.01)。TNF-α与缓激肽单独作用于C6动物后,均可引起胶质瘤大鼠的血肿瘤屏障紧密连接开放及通透性增加。且肿瘤坏死因子-α对肿瘤模型动物血肿瘤屏障通透性的影响与C6细胞培养液中TNF-α含量相一致。结论:缓激肽开放血肿瘤屏障过程中,可能是通过某种机制引起肿瘤组织内TNF-α增加,增加的TNF-α进而引起了血肿瘤屏障的开放。     

糖尿病酮症酸中毒兔血-脑脊液屏障的变化

目的　探讨糖尿病酮症酸中毒的血脑脊液屏障损伤机制。方法　新西兰家兔随机分模型组(n=6 )和生理盐水对照组 (n=6 )。模型组从耳缘静脉注射四氧嘧啶和链脲佐菌素各 15 0 mg/ kg,对照组给予等量生理盐水 ,72 h后检测血糖、尿酮体。两组静脉内均注射伊文氏蓝 ,6 h后检测动脉血气 ;处死动物 ,取脑组织用紫外分光光度计测定伊文氏蓝吸光度 (A) ,并观察光镜、超微结构、碱性磷酸酶细胞化学及诱导型一氧化氮合酶 (i NOS)免疫组织化学结果。结果　 72 h后模型组 :血糖全部大于 17mm ol/ L,尿中出现酮体 ;伊文氏蓝 A值略增高 ,和对照组相比无显著性差异。组织学和超微结构观察模型组脑血管周围水肿 ,内皮细胞损伤 ,神经元变性、坏死。碱性磷酸酶细胞组化显示血管内皮上酶活性明显弱于对照组。免疫组化可见脑实质内血管壁上 i NOS染色阳性。结论　在四氧嘧啶和链脲佐菌素诱发的糖尿病酮症酸中毒动物模型中出现脑水肿 ,其产生与血脑脊液屏障的破坏及一氧化氮 (NO)参与有关。     

磷酸二酯酶抑制剂调节脑微血管内皮细胞屏障功能的研究

目的研究两种磷酸二酯酶(PDE)抑制剂对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞屏障功能的影响及机制。方法以原代方法培养大鼠脑微血管内皮细胞并传代,将第5代细胞随机分为对照组、西洛他唑组、双嘧达莫组、西洛他唑联合蛋白激酶(PKA)抑制剂H89组、双嘧达莫联合H89组,共5组,各组均模拟"缺血再灌注"过程,之后分别添加相应的药物,分析内皮细胞纤维肌动蛋白分布、紧密连接蛋白5的表达、对白蛋白和葡聚糖的通透性,以确定各种药物对大鼠脑微血管内皮细胞屏障特性的作用。结果西洛他唑和双嘧达莫改变了纤维肌动蛋白的分布。西洛他唑增加了紧密连接蛋白5的表达,免疫印迹定量显示为对照组的(218.2±39.3)%(P0.01)。西洛他唑和双嘧达莫降低了内皮细胞对白蛋白的通透性,分别为(0.869±0.15)×10-6cm/s(P0.05)和(0.65±0.11)×10-6cm/s(P0.01);蛋白激酶抑制剂H89可基本逆转西洛他唑对白蛋白通透性降低的作用(P0.05);西洛他唑、西洛他唑联合H89降低了内皮细胞对葡聚糖的通透性(P0.05),而双嘧达莫不能(P0.05)。结论西洛他唑和双嘧达莫两种PDE有增强大鼠脑微血管内皮细胞屏障特性,但具体作用及可能的机制不同,其中PKA介导下的西洛他唑作用更明显。     

血管生成素1对大鼠血-脊髓屏障功能的增强作用

目的:探讨血管生成素1(Ang1)对大鼠血-脊髓屏障功能的增强作用,及表皮生长因子受体通路底物8(Eps8)在此增强过程的作用。方法:分离、培养大鼠脊髓微血管内皮细胞(SCMEC),建立体外血-脊髓屏障模型。以Ang 1处理的SCMEC为Ang1处理组,未处理的为对照组。于Ang1处理后于不同时间点(0 h、4 h、8 h、12 h)测定各组跨内皮电阻(TEER)值,比较2组Eps8蛋白的表达水平。再将SCMEC分为对照siRNA组、对照siRNA+Ang1组、Eps8 siRNA组及Eps8 siRNA+Angl组,分别给予siRNA干扰Eps8表达及Ang 1处理,比较不同组间Eps8蛋白的表达水平与TEER值。结果:Ang1处理组4 h、8 h、12 h SCMEC的TEER值均明显高于对照组(P0.05),Eps8蛋白的表达水平均高于对照组(P0.05)。Eps8 siRNA组SCMEC中Eps8蛋白的表达水平明显低于对照siRNA组(P0.05),而与Eps8 siRNA+Ang1组间差异无统计学意义(P0.05);Eps8 siRNA组不同时间点TEER值均明显低于对照siRNA组(P0.05);Eps8 siRNA+Ang1组与Eps8 siRNA组间TEER值差异无统计学意义(P0.05)。结论:Ang1可增强大鼠血-脊髓屏障的功能,其机制可能与Eps8有关。     

丁苯肽对慢性低灌注大鼠血-脑脊液屏障保护作用的研究

目的:观察慢性低灌注大鼠血-脑脊液屏障(BBB)通透性的变化及丁苯肽对其通透性的影响。方法:Wistar大鼠144只,双侧颈总动脉结扎方法制作慢性低灌注模型,随机分为假手术组,缺血组和丁苯肽组,各48只,于术后7、14、306、0 d(每时间点12只)比较各组大鼠脑组织BBB通透性。结果:伊文思蓝染色显示缺血组7 d亚组大鼠脑组织伊文思蓝含量显著高于假手术组(P0.01),高于丁苯肽组(P0.05),缺血组14 d亚组大鼠脑组织伊文思蓝含量高于假手术组和丁苯肽组(P0.05),30 d、60 d亚组大鼠脑组织伊文思蓝含量在各组间差异无统计学意义。结论:慢性低灌注状态下,大鼠的BBB通透性增高,丁苯肽可缓解BBB通透性的增高。     

表皮生长因子受体抑制剂对氧糖剥夺/复氧诱导的血脊髓屏障损伤的保护作用研究

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂PD168393对体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的血脊髓屏障(BSCB)损伤的保护作用及其可能的机制。方法:体外培养大鼠来源的脊髓微血管内皮细胞和混合胶质细胞,应用transwell培养体系建立体外BSCB模型;将培养的细胞分为3组:对照组(正常培养)、损伤组(OGD/R处理)和治疗组(OGD/R后给予10 nM PD168393干预)。损伤组和治疗组复氧3 h、6 h和12 h后,应用荧光素渗漏实验及内皮细胞跨膜电阻值(TEER)测定来评估各组BSCB通透性变化;应用免疫荧光、Western Blot技术检测各组内皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达的差异;应用ELISA法检测各组细胞分泌致炎因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的差异。结果:损伤组在各个时间点的荧光素渗漏量均高于对照组(均P0.05),而治疗组荧光素渗漏量均低于损伤组(均P0.05);损伤组TEER值显著低于对照组(均P0.01),而治疗组TEER值显著高于损伤组(均P0.05);损伤组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量低于对照组(均P0.05),而治疗组ZO-1和Occludin的表达量较损伤组显著提高(均P0.05);损伤组分泌的致炎因子IL-6、iNOS、TNF-α均显著高于对照组,治疗组在各时间点致炎因子IL-6、iNOS、TNF-α的分泌均低于损伤组(均P0.05)。结论:EGFR抑制剂PD168393有助于维持OGD/R损伤后BSCB的完整性;其机制可能与抑制致炎因子的表达及减少BSCB紧密连接蛋白的破坏有关。     

小脑顶核电刺激对大鼠脑缺血后基质金属蛋白酶-9表达的影响

目的观察小脑顶核电刺激预处理对大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠脑组织基质金属蛋白酶（MMP-9）表达的影响。 方法选择雄性Wistar大鼠，随机分为对照组、小脑顶核刺激组（FNS组）及假FNS组。采用线栓法建立大鼠MCAO模型，观察时间点为MCAO后第3，6，12，24，及72小时。对照组行假手术，并不栓塞大脑中动脉。FNS组大鼠预先电刺激小脑顶核1 h，24 h后行MCAO。假FNS组仅将针电极置入大鼠小脑顶核，但不予通电。采用干湿重法测定脑含水量，Evan蓝法测定血-脑屏障（BBB）通透性，免疫印迹法测定MMP-9的表达。 结果与对照组比较，假FNS组MCAO后各时间点缺血侧脑含水量增加，BBB通透性第6小时后增高，MMP-9表达增强；与假FNS组比较，FNS组大鼠MCAO后各时间点缺血侧脑含水量明显下降，BBB通透性第6小时后明显降低，MMP-9表达明显减弱（P<0.05）。 结论预先电刺激小脑顶核，可抑制缺血区脑组织MMP-9的表达，从而抑制BBB通透性的增高，改善缺血区组织水肿。     

血神经屏障和Claudin-1蛋白在大鼠慢性神经病理性疼痛中的作用

目的:观察慢性神经病理性疼痛大鼠坐骨神经的血神经屏障(BNB)变化,并探讨紧密连接蛋白Claudin-1在其中的作用.方法:健康雌性SD大鼠分为3组:对照组(Control组)、假手术组(Sham组)和慢性坐骨神经压迫损伤组(CCI组).对照组不做处理;Sham组仅分离暴露大鼠右侧坐骨神经,不结扎;CCI组暴露大鼠右侧...     

自由落体致大鼠脑损伤后血脑屏障变化的研究

目的 用IgG免疫组化染色方法研究大鼠自由落体脑损伤后血脑屏障的变化。方法 复制大鼠自由落体脑损伤模型．在外伤后1h、6h、24h及7d时取脑组织．分别进行光镜、电镜检查，同时用IgG免疫组化染色方法观察血脑屏障的变化，并对免疫组化结果进行半定量分析。结果 大鼠自由落体脑损伤后，损伤部位出现片状出血及明显水肿，电镜观察显示有毛细血管内皮细胞损伤及星形细胞肿胀，免疫组化染色显示IgG在脑损伤后1h即有漏出，6h漏出最严重，持续至24h，7d时降低。结论大鼠脑损伤后出现血脑屏障通透性改变；IgG免疫组化染色是研究血脑屏障功能变化简单、敏感的方法。     

创伤性脑损伤后AQP4表达与血脑屏障通透性的关系

【目的】研究创伤性脑损伤（TBI）后水通道蛋白04（AQP4）的表达变化与血脑屏障（BBB）通透性之间的关系。[方法】健康成年Wistar大鼠,随机分成TBI组和假手术（S0）组。自由落体硬膜外撞击方法致重度脑创伤模型。S0组除不予以撞击外,其余操作与TBI组相同。分时段取脑,观察以下指标：①测创伤脑组织中伊文氏蓝（EB）外渗量;②透射电镜下观察创伤后BBB和细胞的超微病理改变;③免疫组化和原位杂交检测AQP4蛋白及其mRNA的表达变化;④氯化三苯四唑染色后,用图像分析软件测定每张脑片的面积和坏死区面积。【结果]BBB通透性、超微病理变化和坏死区体积百分比在s0组中变化不大。脑损伤后,BBB通透性增加,其增加有两个高峰,分别在TBI后12h和TBI后3d,以后者更明显。透射电镜下可见血管及其周围神经元、胶质细胞的超微结构有明显改变,在TBI后3d改变最明显。脑损伤后脑组织坏死区体积百分比增加,最大值也在TBI后3d。免疫组化和原位杂交显示,脑损伤后AQP4在脑组织中的表达逐渐上调,1d达高峰,持续至3d后下降,7d接近S0组水平。【结论】大鼠TBI后BBB通透性的增加与脑水肿的形成密切相关;TBI后BBB通透性增加,可能与AQP4表达上调有关,两者的变化影响TBI后脑水肿的发生、发展。     

罗格列酮对家兔脑出血模型病灶周围内皮素-1表达 及血脑屏障通透性的影响

目的:探讨罗格列酮对家兔脑出血(ICH)模型血肿周围脑组织内皮素1(ET-1)表达及血脑屏障通透性的影响。方法:45只健康家兔随机分为正常对照组(NC组)、模型对照组(MC组)及罗格列酮灌注组(RSG组),各15只。自体血注入法制备基底核区ICH模型。造模后6 h,RSG组给予罗格列酮病灶区灌注,各组分别在处理后1、3和7 d处死,每时间点5只。处死前行Purdy神经功能评分,伊文思蓝法判断血脑屏障通透性,比较血肿周围脑组织ET-1表达,分析ET-1表达水平与血肿周围脑组织伊文思蓝含量及Purdy神经功能评分相关性。结果:与NC组比较,MC组和RSG组出现显著神经功能损害(P<0.05),病灶周围ET-1表达、血脑屏障通透性均显著增加(P<0.05);与MC组比较,RSG组神经功能损害减轻,病灶周围ET-1表达、血脑屏障通透性均降低(P<0.05);血肿周围脑组织ET-1表达水平与血脑屏障通透性及Purdy神经功能评分呈显著相关性(P<0.01)。结论:ICH后血肿周围脑组织ET-1表达及血脑屏障通透性增加,罗格列酮灌注治疗可降低血肿周围脑组织ET-1表达及血脑屏障通透性,减轻神经功能损害。     

Blood-nerve barrier dysfunction contributes to the generation of neuropathic pain and allows targeting of injured nerves for pain relief

The blood-nerve barrier (BNB) is a selectively permeable barrier that creates an immunologically and biochemically privileged space for peripheral axons and supporting cells. The breakdown of the BNB allows access of blood-borne (hematogenous) cells and molecules to the endoneurium to engage in the local inflammatory cascade. This process was examined in a mouse model of trauma-associated neuropathic pain. The impact of nerve injury–triggered opening of the BNB in the development of chronic pain behavior was investigated. Partial ligation of the sciatic nerve led to a long-lasting disruption of the BNB distal to the site of injury. Vascular endothelial growth factor (VEGF) was expressed by resident macrophages after nerve injury. Intraneural injection of VEGF decreased mechanical thresholds while opening the BNB. Serum from nerve-injured or lipopolysaccharide-treated animals elicited mechanical allodynia in naive animals, when allowed to bypass the BNB by intraneural injection. Intraneural injection of fibrinogen, a clotting protein in plasma that was found to deposit in the nerve after nerve injury, also produced a decrease in mechanical thresholds when introduced into naive nerves. These results demonstrate that blood-borne molecules may play a role in the generation of neuropathic pain, suggesting that pain may be driven from infection or injury, at a distance from the nervous system. Furthermore, the breakdown of the BNB in neuropathic conditions was exploited to permit the entry of analgesic molecules that typically cannot pass the BNB, such as ProToxin-II, a BNB-impermeable Nav1.7 inhibitor. Therapeutics utilizing this mechanism could have selective access to injured nerves over healthy tissues.     

Focused Ultrasound and Microbubble Treatment Increases Delivery of Transferrin Receptor-Targeting Liposomes to the Brain

The blood-brain barrier (BBB) is a major obstacle to treating several brain disorders. Focused ultrasound (FUS) in combination with intravascular microbubbles increases BBB permeability by opening tight junctions, creating endothelial cell openings, improving endocytosis and increasing transcytosis. Here we investigated whether combining FUS and microbubbles with transferrin receptor-targeting liposomes would result in enhanced delivery to the brain of post-natal rats compared with liposomes lacking the BBB-targeting moiety. For all animals, increased BBB permeability was observed after FUS treatment. A 40% increase in accumulation of transferrin receptor-targeting liposomes was observed in the FUS-treated hemisphere, whereas the isotype immunoglobulin G liposomes showed no increased accumulation. Confocal laser scanning microscopy of brain sections revealed that both types of liposomes were mainly observed in endothelial cells in the FUS-treated hemisphere. The results demonstrate that FUS and microbubble treatment combined with BBB-targeting liposomes could be a promising approach to enhance drug delivery to the brain.     

可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU对大鼠局灶脑缺血后血脑屏障的保护作用

目的:研究可溶性表氧化物水解酶抑制剂(sEHi)TPPU对脑缺血/再灌注损伤所致血脑屏障(BBB)破坏的作用。方法:线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型;45只大鼠随机分为3组,假手术组、模型组(制作MCAO模型)、TPPU组(于MCAO术前24 h、缺血再灌注后0、24及48 h经大鼠尾静脉注射TPPU),各15只。Garcia评分法评估神经功能缺损及恢复情况;TTC法检测大鼠脑梗死体积;干湿重法评估脑水肿程度;伊文氏蓝(EB)法检测BBB通透性;免疫荧光染色、western blot等方法检测BBB相关蛋白含量的变化。结果:与模型组比较,TPPU能够改善大鼠脑梗死后神经功能缺损症状(P0.01),减小脑皮质梗死体积,减少EB向脑组织渗漏,减轻血管性脑水肿,减轻MCAO后BBB紧密连接蛋白的丢失(均P0.05)。结论:TPPU能够保护MCAO大鼠BBB完整性,减轻脑水肿,减小脑梗死体积,减轻神经功能缺损症状。     

低频超声破坏微泡造影剂开放血脑屏障的实验研究

目的探讨不同强度的低频超声经颅诱导微泡造影剂破坏对大鼠血脑屏障的影响。 方法股静脉注入微泡造影剂后，采用频率43kHz，声强分别为1．2．1．5．1．8．2．3w／cm。的连续超声波经大鼠颅骨照射3min，荧光显微镜观察伊文思兰的渗出。 结果注射微泡造影剂后，声强1．2w／cm^2时超声波即可以开放血脑屏障，随声强的增加脑组织损伤加重。 结论低频超声诱导微泡造影剂破坏可以靶向开放血脑屏障。     

缺氧缺血对体外血脑屏障通透性的影响及其机制的研究

目的：探讨血脑屏障紧密连接（BBB-tight junction，BBB—TJ）蛋白和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在缺氧缺血诱导的体外血脑屏障（BBB）模型通透性增加中的作用及相互关系。方法：ECV304与原代培养的星形胶质细胞共培养建立体外BBB模型。实验分为正常对照组（C组）、缺氧缺血组（H／I组）、BB-1101预处理组（P组）3组。透射电镜分别观察各组BBB-TJ变化；通过吖计数仪测定核素标记牛血清白蛋白（^125I-BSA）通透量检测BBB屏障功能。直接免疫荧光观察细胞骨架蛋白Actin分布的改变，Westemblot检测Actin、Occludin、ZO-1和MMP-9表达量的改变。结果：电镜观察见C组内皮细胞间形成光滑、连续、较高密度的紧密连接，免疫荧光检测见细胞骨架蛋白Actin主要分布在细胞膜及细胞核周边。形成肌动蛋白丝带，轮廓内包含大量柬状排列有序的微丝结构，细胞间连接紧密。缺氧缺血后．H／I组细胞间连接开放，形成裂隙，而胞膜及胞核周边肌动蛋白丝带模糊、部分断裂，并有应力纤维形成，出现细胞间裂隙，BBB对岱I—BSA通透性明显增高，与C组和P组比较，差异有显著性（P〈0．01），同时ZO-1的表达量显著减少，MMP-9的表达显著增多，而Occludin和Actin的表达量无改变。BB-1101预处理后，P组细胞BBB-TJ破坏减少．周边肌动蛋白丝带重新出现，细胞间裂隙较少，岱I-BSA通透量较H／I组明显下降（P〈0．01）．MMP-9的表达较H／I组也明显减少（P〈0.01）。结论：（1）缺氧缺血能促使BBB—TJ的开放进而导致BBB通透性增加；（2）BBB-TJ的开放可能与BBBActin的重组及ZO-1的表达量降低有关；（3）缺氧缺血能增加MMP-9的表达：（4）MMP-9与缺氧缺血时BBBActin的重组及ZO—1的表达减少相关。     

Evaluation of Dose Distribution of Molecular Delivery After Blood-Brain Barrier Disruption by Focused Ultrasound with Treatment Planning

The permeability of the blood-brain barrier (BBB) can be enhanced by focused ultrasound (FUS) in localized regions with applications of ultrasound contrast agent (UCA). The purpose of this study was to evaluate the dose distribution of Evans blue (EB) in the targeted brain by sonication with treatment strategy. FUS exposure was applied with an ultrasound frequency of 1 MHz, a 5% duty cycle and a repetition frequency of 1 Hz. Single sonication with two doses of UCA and two sonications at the same location or an interval of 3 mm to induce BBB disruption for assessing dose distribution. The permeability of the BBB was measured quantitatively based on EB extravasation. Gadolinium deposition was monitored by contrast enhanced MR imaging for dose distribution of the focal plane. Hematoxylin and eosin staining was performed for histologic observation. No significant difference was found for EB in the focal regions between the single sonication with UCA at a dose of 300 μL/kg and repeated sonication with UCA at a lower dose of 150 μL/kg. There was a sharper dose distribution in the brain with repeated sonication at the same location, compared with the brain receiving two sonications at an interval of 3 mm. Compared with a single sonication with UCA at a dose of 150 μL/kg, the histologic evaluation of the sonicated regions indicated that more erythrocytes were seen in the brain treated with single sonication at a higher dose of 300 μL/kg or repeated sonication at a dose of 150 μL/kg. This study demonstrated that the dose distribution of molecular delivery could be regulated by sonication with treatment planning.