含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

外源性人分化抑制因子3在A549／DDP细胞中的表达及意义

目的:Id 蛋白即分化抑制因子(Id),在人类多种肿瘤中异常表达,并参与肿瘤细胞的增生、分化和凋亡等.文中旨在探讨人分化抑制因子3(Id3)基因体外转染在人肺腺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达及意义. 方法:构建人Id3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体Id3/pEGFP,采用脂质体介导的转染技术将Id3融合基因(Id3-EGFP)导入A549/DDP细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP的表达情况;半定量RT-PCR检测Id3表达的改变;MTT法观察Id3对细胞的增殖抑制情况. 结果:成功构建人Id3/pEGFP真核表达载体并转染A549/DDP细胞,倒置荧光显微镜下转染的A549/DDP细胞发出强绿色荧光,转Id3/pEGFP质粒的细胞其荧光主要表达于细胞核;RT-PCR结果显示Id3 mRNA在转染后的A549/DDP细胞能有效表达;MTT法结果表明,与对照组相比,转染Id3重组质粒的细胞增殖被抑制. 结论:转染的Id3/pEGFP融合基因在A549/DDP细胞能有效表达,外源性Id3基因能抑制该细胞的增殖.     

人CD40L真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞膜上的表达

目的：扩增人CD40L基因并在细胞膜上表达,建立一种不需蛋白纯化获得人CD40L的简单方法,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用及机制奠定基础。方法：利用梯度RT-PCR从Jurkat细胞中扩增CD40L基因,测序证明序列正确后构建pcDNA3.1-40L真核表达载体,转染NIH3T3细胞,流式细胞仪检测目的基因的表达。结果：从Jurkat细胞内成功扩增人CD40L基因,筛选到一个序列无误的克隆;成功构建pcDNA3.1-40L真核表达载体;经转染NIH3T3细胞和G418初步筛选,流式细胞检测证明约41％的NIH3T3细胞膜上有CD40L基因表达。结论：利用RT-PCR技术可以从Jurkat细胞内扩增CD40L基因,利用pcDNA3.1表达载体可以实现人CD40L基因在NIH3T3细胞膜上的表达。     

超声辐照与丁酸钠对腺相关病毒转染大鼠视网膜色素上皮细胞的影响

目的 探讨超声辐照与丁酸钠在携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中的应用价值.方法 大鼠RPE细胞接种于24孔板中,分别以rAAV2-EGFP(对照组)、rAAV2-EGFP+超声辐照(超声辐照组,辐照时间60 s,声强0.5、1 W/cm2)、rAAV2-EGFP+不同终浓度丁酸钠(丁酸钠组)转染大鼠RPE细胞.转染后48 h,倒置荧光显微镜观察转染细胞EGFP表达情况,流式细胞仪检测细胞转染效率(EGFP阳性细胞百分率);转染后24 h,MTS法检测细胞增殖.结果 流式细胞仪检测结果显示:超声辐照组和丁酸钠组EGFP阳性细胞百分率显著高于对照组(P＜0.05),丁酸钠组转染效率提高的百分率显著高于超声辐照组(P＜0.05).细胞增殖检测结果显示,超声辐照组转染细胞的吸光度值显著高于丁酸钠组(P＜0.05).结论 丁酸钠和超声辐照均能提高rAAV2-EGFP对大鼠RPE细胞的转染效率,其中丁酸钠的效果显著,而超声辐照对细胞增殖的抑制程度较轻.     

构建人补体衰变加速因子真核载体并转染NIH/3T3成纤维细胞

目的：构建人补体衰变加速因子（DAF）真核表达载体pSecTag2／HygroB-DAF，并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体，转染小鼠NH／3T3成纤维细胞。方法：应用PCR方法，从DAF—pGEM—T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB—DAF真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH／3T3细胞，并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果：DAF基因大小为1049bp，与基因序列数据库中记载的人DAF cDNA序列结果完全一致；利用壳聚糖-DAF纳米微粒转染NIH／3T3细胞24h后，免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论：成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NH／3T3细胞。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

成纤维细胞中hEra-EGFP融合蛋白的表达定位

目的：研究人era基因在体外培养细胞中的定位。方法：将era基因克隆入带绿色荧光蛋白（EGFP）荧光标签的真核表达载体pSMEGFP,使其位于EGFP的N端，转染NIH3T3细胞，于转染后24和36h分别用荧光显微镜观察。结果：成功构建了EGFP－hEra融合蛋白的表达载体，转染细胞后可见融合蛋白位于细胞的胞质近核膜处。结论：用EGFP融合蛋白的方法初步将hEra定位于胞质内。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

目的构建p38丝裂原激活蛋白激酶基因(MAPK)重组慢病毒载体并建立表达外源性p38基因的人前列腺癌稳定细胞株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接等方法,将EGFP/p38融合基因插入慢病毒载体pTYF-EF1α-IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达

目的: 构建HIV-1辅受体的配体-趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表达.方法: 从重组质粒pCMV-R-K-S-K中获取RANTES-KDEL-SDF-KDEL基因片段,构建RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体pLNCX-R-K-S-K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共沉淀法转染包装细胞Bing, G418筛选克隆细胞,制备重组病毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF-1的表达.结果: pLNCX-R-K-S-K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可表达于转染细胞.结论: HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体构建成功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV-1感染实验打下了基础.     

Oct4对鼠-猪异种核移植胚胎早期发育的影响

目的进行脂质体长春新碱(Liposome Vincristine,L-VCR)的动物体内药代学研究、体内抗肿瘤药效学研究以及毒理学研究,探讨L-VCR的作用特点及其可能的作用机制。方法Wistar大鼠接种Walker256肿瘤,用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV),测定其体内以及肿瘤内的血药浓度,用药动学计算软件拟合处理得药动学参数;小鼠接种B16黑色素瘤,静脉给予L-VCR,计算其肿瘤抑制率以及去瘤体重;测定L-VCR小鼠的LD50。结果与游离长春新碱(Free Vincristine,F-VCR)相比,L-VCR血浆以及肿瘤内浓度增高,维持时间明显延长,AUC0-t增加约121倍;L-VCR能明显减轻小鼠B16黑色素瘤模型的瘤体重量,并呈现一定的量效关系;L-VCR小鼠的LD50明显高于游离药物。结论L-VCR可显著延长VCR半衰期,增大药时曲线下面积,药效明显高于F-VCR,且毒性明显降低。其作用可能是通过脂质体包裹,增加肿瘤中的药物量,延长VCR的作用时间,药物释放缓慢,从而减轻VCR的毒性而达到的。     

Retroviral transduction of a mutant erbB-2 gene into human CD 34+derived dendritic cells

Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ (ＤＣｓ)ｈａｖｅｄｒａｗｎｗｉｄｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ ,ｂｅｃａｕｓｅｔｈｅｙａｒｅｔｈｅｍｏｓｔｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｓ (ＡＰＣ)ｉｎｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｎａｉｖｅＴｃｅｌｌｓｏｆｂｏｔｈＣＤ4 ａｎｄＣＤ8 ｔｙｐｅｓ ＴｈｉｓａｂｉｌｉｔｙｏｆＤＣｓｔｏｐｒｅｓｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｓｔｏＴｃｅｌｌｓａｎｄｔｏｉｎｉｔｉａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｈａｓｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｕ…     

联合抗Fas核酶和CD80-免疫球蛋白G 融合蛋白阻断小鼠急性粒-单核白血病细胞逃逸T细胞杀伤

目的研究抗Fas锤头状核酶下调细胞毒T细胞(CTL)的Fas表达,以及CD80-免疫球蛋白G(CD80-IgG)融合蛋白增加急性粒-单核白血病细胞表面的CD80分子表位对CTL杀伤急性粒-单核白血病细胞能力的影响.方法构建可有效切割Fas mRNA的锤头状核酶真核质粒,通过电穿孔法导入小鼠脾脏T细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹检测T细胞Fas的表达;同时构建pcDNA/CD80-IgG融合基因真核表达载体,采用脂质体技术导入中国地仓鼠卵巢细胞株(CHO)细胞中,并采用免疫亲和层析法纯化CHO细胞上清中的CD80-IgG融合蛋白,用其孵育急性粒-单核白血病细胞株(WEHI-3)后,与上述转染Fas mRNA锤头状核酶的T细胞进行同种异体白血病细胞和淋巴细胞混合培养;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)检测T细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝微量反应比色法(MTT法)检测T细胞增殖和CTL体外杀伤WEHI-3细胞的能力.结果凝胶图像分析小鼠脾脏T细胞Fas 蛋白电泳条带的灰度比值显示以对照组为1,空载体(pEGFPC1)和Fas核酶RZ596重组真核表达载体(pEGFP-RZ596)转染组分别为0.98和0.45(P＜0.01);当转染pEGFP-RZ596的小鼠脾脏T细胞与高表达Fas配体的(64%±3%)WEHI-3细胞混合培养后,T细胞凋亡率为37%,对WEHI-3细胞的杀伤活性为67%,而对照及转染pEGFPC1小鼠脾脏T细胞组的凋亡率和对WEHI-3细胞的杀伤活性分别为88%、84%(P＜0.01)和32%、31%(P＜0.01).WEHI-3细胞表面CD80表达率仅为5.1%±0.4%,经CD80-IgG融合蛋白预孵育后增至27.4%±2.2%(P＜0.01);小鼠脾脏T细胞对CD80-IgG融合蛋白预孵育和未孵育的WEHI-3细胞杀伤率分别为64%和49%(P＜0.01).转染Fas核酶的小鼠脾脏T细胞对CD80-IgG融合蛋白预孵育的WEHI-3细胞杀伤率增至82%(P＜0.01).结论联合抗Fas核酶和 CD80-IgG融合蛋白能使小鼠CTL免于FasL-Fas途径的凋亡;并显著增强其杀伤急性粒单核白血病细胞的效应.