人成骨蛋白-1成熟肽在大肠杆菌中的克隆、表达和诱骨活性测定

目的：扩增、克隆人成骨蛋白-1(human osteogenie protein-1，hOP-1)成熟肽eDNA基因，并利用大肠杆菌表达hOP-1成熟肽。方法：PCR扩增hOP-1成熟肽cDNA基因，将其克隆入受控于含有PR；PE启动子的温控型人肠杆菌表达载体pDH，构建成的重组质粒pDOPm以大肠杆菌DH5α为宿主菌进行温度诱导表达，表达产物纯化和复性后，以小鼠肌袋模型检测诱骨活性．结果：扩增得到hOP-1成熟肽基因；含重组质粒pDOPm的工程菌经42℃诱导后在SDS-PAGE上出现一条新蛋白条带，分了量约为16ku，表达量占菌体总蛋白的21％，以包涵体形式存在，经纯化和复性处理，得到纯度高于85%、具有良好的异位诱导成骨活性的hOP-1成熟肽。结论：成功克隆出hOP-1成熟肽基因，并在大肠杆菌中得到高效表达，复性后具有诱骨活性。     

人成骨蛋白-1成熟肽在大肠杆菌中的克隆、表达和诱骨活性测定

目的:扩增、克隆人成骨蛋白-1(human osteogenic protein-1,hOP-1)成熟肽cDNA基因,并利用大肠杆菌表达hOP-1成熟肽.方法:PCR扩增hOP-1成熟肽cDNA基因,将其克隆入受控于含有PRPL启动子的温控型大肠杆菌表达载体pDH,构建成的重组质粒pDOPm以大肠杆菌DH5α为宿主菌进行温度诱导表达,表达产物纯化和复性后,以小鼠肌袋模型检测诱骨活性.结果:扩增得到hOP-1成熟肽基因;含重组质粒pDOPm的工程菌经42℃诱导后在SDS-PAGE上出现一条新蛋白条带,分子量约为16ku,表达量占菌体总蛋白的21%,以包涵体形式存在,经纯化和复性处理,得到纯度高于85%、具有良好异位诱导成骨活性的hOP-1成熟肽.结论:成功克隆出hOP-1成熟肽基因,并在大肠杆菌中得到高效表达,复性后具有诱骨活性.     

人骨形态发生蛋白4(2b)成熟区cDNA的克隆和序列分析

目的 研究人骨形态发生蛋白 4(2b)(BMP-4)成熟区 cDNA的克隆方法 ,并进行测序及序列分析。方法 采用异硫氰酸胍一步法从人骨肉瘤细胞株 U-2OS中提取总 RNA，通过逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)扩增为 BMP-4成熟区 cDNA基因片段。将此基因片段经适当酶切后克隆入载体 pUC19中，获得重组质粒 pUC19/BMP-4。采用 Sanger双脱氧链终止法双向测定核苷酸序列。结果 通过 RT-PCR方法获得了 BMP-4成熟区的 cDNA，并经核苷酸测序证实。计算机检索 Genebank,选择其中已发表的 BMP-4 DNA序列 (D30751)作为参考，经 DNA SIS软件分析显示， rhBMP-4成熟区 cDNA和 Genebank中 D30751 BMP-4成熟区（ 963～ 1 310 bp）的核苷酸和氨基酸序列同源性均为 99％。 rhBMP-4成熟区 cDNA中有 2个碱基发生突变，一个位于第 1 154(201)位的 G C，但它不引起缬氨酸（ Val）密码子改变，故为无意义突变；另一突变位于 1 222(269)位的 C T，其密码子亦随之发生改变，即由丙氨酸 (Ala)变为缬氨酸。结论 获得克隆的 BMP-4基因成熟区，该基因在骨关节系统的损伤与修复及疾病治疗中具有重要的临床应用价值。     

BMP－1融合蛋白在大肠杆菌中的表达

本研究采用ＤＮＡ重组技术，构建ｐＭＳ３２Ｃ／ＢＭＰ－１表达载体，在工程细胞Ｅ．Ｃｏｌｉ中高效表达了人ＢＭＰ－１融合蛋白，ＭＷ６６ＫＤ，表达量占细菌总蛋白２０％，用制备性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯化后免疫小鼠获得人ＢＭＰ－１融合蛋白多克隆抗体，免疫血清学鉴定证明表达的融合蛋白具有ＢＭＰ的抗原性，为ＢＭＰ研究打下了基础。     

骨形态发生蛋白2和4在前列腺癌中的表达

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMPs)在前列腺癌(PCa)中的表达及与临床分期、病理分级之间的关系。方法:应用W estern印迹法检测48例PCa组织中BMP-2、BMP-4的表达情况。结果:BMP-2在G leason评分6~8分(A值为9 657.4±2 010.4)和≥9分者(A值为1 2467.7±2 496.7),与正常前列腺组织(6 540.2±1 874.8)相比,差异均有显著性(P均<0.01),并且与G leason评分≤5分者(7 547.1±1 964.1)相比差异亦有显著性(分别为P<0.05,P<0.01)。BMP-4中G leason评分6~8分(5 940.3±1 587.4)和≥9分(6 332.1±1 647.8)者,与正常前列腺组织(4 636.0±1 359.3)相比,差异均有显著性(P均<0.05)。T1~T2期和T3~T4期的BMP-2在PCa中的表达(A值分别为8 003.4±1 889.2,12 385.5±2 506.7),与正常前列腺组织相比,差异均有显著性(分别P<0.05,P<0.01);而且T3~T4期与T1~T2期相比,差异亦有显著性(P<0.05)。T1~T2期的BMP-4在PCa中的表达(5 267.4±1 464.2)与正常前列腺组织相比,差异无显著性(P>0.05);T3~T4期的BMP-4在PCa中的表达(6 543.7±1 668.5)与正常前列腺组织相比,差异有显著性(P<0.05)。BMP-2在有骨转移PCa中的表达明显高于无骨转移PCa中的表达,两者相比差有非常显著性[(12 847.5±2 547.1)vs(8 424.5±2 002.5),P<0.01]。结论:BMP-2和BMP-4蛋白表达与正常前列腺相比表达增加,表达随临床分期、G leason分级增高而升高。BMP-2在有骨转移PCa表达增高明显,BMP-2增高预示预后不良。     

人骨形成蛋白-7成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

目的：利用大肠杆菌高效表达人骨形成蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）成熟肽。方法：将编码hBMP-7成熟肽cDNA的基因片段克隆入受控于PRPL启动子的温控型大肠杆菌表达载体pDH，构建成的重组质粒pDHB-7m以大肠杆菌DH5a为宿主菌进行温度诱导表达。结果：含重组质粒的工程菌经42℃诱导表达后在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显现出一条新蛋白区带，分子量约为16ku，表达量占菌体总蛋白的20％～25％，以包涵体形式存在，经简单纯化处理，得到纯度高于80％的人骨形成蛋白-7成熟肽。结论：hBMP-7成熟肽在大肠杆菌中得到高效表达，为深入研究其生物学活性和临床应用奠定了基础。     

实时荧光定量聚合酶链反应筛选重组人骨形态发生蛋白-2诱导比格犬骨髓基质干细胞成骨分化差异表达的miRNAs

目的 利用实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)方法筛选骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)诱导比格犬骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的miRNAs,探讨过表达miRNAs对成骨分化的影响.方法 选取4只比格犬分离BMSCs原代,取培养至第3代BMSCs分为2组:对照组(用基础培养基培养)和实验组(在基础培养基中加入rhBMP-2培养7d,诱导细胞成骨分化).采用碱性磷酸酶染色法验证细胞成骨分化情况,采用Q-PCR法筛选成骨分化细胞与对照组细胞差异表达的miRNAs;随机选择其中一种低表达miRNA(miR-125b),采用Lipofectamine2000进行转染,其中实验组1转染miR-125bmimics以过表达miR-125b,其阴性对照实验组2转染mimics-NC,验证过表达miR-125b 7 d后对rhBMP-2诱导的比格犬BMSCs成骨分化的影响. 结果 成功建立比格犬BMSCs培养方法;rhBMP-2诱导比格犬BMSCs成骨分化7d后,进行Q-PCR筛选,获得表达差异相对于对照组达到2倍以上的miRNAs 41个,其中表达上调的有13个,表达下调的有28个;实验组1相对于实验组2,细胞中miR-125b表达上调4.13倍(P＜0.05).转染7d后,ALP染色结果显示:实验组1细胞质中深蓝色粗大颗粒明显少于实验组2. 结论 采用Q-PCR方法筛选比格犬BMSCs成骨分化的miRNAs系统高效、准确.筛选获得的miRNAs中,miR-125b过表达能够显著抑制比格犬BMSCs的成骨分化.     

骨形态发生蛋白基因表达及应用的研究进展

骨形态发生蛋白１～１２的ｃＤＮＡ克隆要继被报道。在大肠杆菌和真核细胞均表达出有诱骨活性的骨形态发生蛋白，随着基因重组技术和基因转移技术的发展，外源性骨形态发生蛋白基因的直接或间接转移和表达，将会对局部骨缺损修复产生重要意义，为骨形态发生蛋白的临床应用开辟新的途径。     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSc),检测外源基因的表达.方法常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达.结果原位杂交和免疫组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现.结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达.     

骨形态发生蛋白在异体骨段移植愈合中的表达及临床意义

目的：研究骨形态发生蛋白（BMP）在异体骨段移植愈中的表达及临床意义。方法：采用新西兰大白兔股骨中段切除1．5cm骨干和骨膜实验动物模型。方法：36只兔随机分实验组和对照组。实验组植入深低温保存的异体骨,对照组植入自体新鲜骨,均用髓内针固定,分别于术后第1、2、3个月用免疫组织化学染色法观察BMP在异体骨愈合过程的表达情况,结果：深低温保存的同种异体骨移植愈合BMP表达与体骨相似,移植骨段BMP表达阴性,新生骨及其周围类基质表达阳性。新生编织骨BMP表达活跃,成熟板层骨BMP表达减弱（P＜0．01）。结论：异体骨移植愈合中骨吸收和骨诱导是同时,骨诱导在异体骨愈合早期发挥了重要作用。     

实验性肝纤维化基质分解素1基因的表达

目的探讨实验性肝纤维化基质分解素1基因表达的动态变化。方法建立四氯化碳中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型，采用逆转录定量PCR方法，测定肝纤维化不同阶段基质分解素及基因表达水平。结果正常大鼠肝组织有基质分解素1的基因表达。在肝纤维化的发生、发展过程中，肝组织基质分解素1（MMP_3）基因表达逐渐增强；到肝硬化阶段MMP_3基因表达较肝纤维化阶段下降；在肝硬化的自发逆转过程中MMP_3基因表达保持在明显高于正常对照的水平。结论基质分解素1在肝纤维化的发生、发展和逆转过程中可能起重要作用。     

骨形态发生蛋白-2对椎间盘细胞软骨特异性基因 mRNA的调节作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2对椎间盘细胞软骨特异性基因Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的调控作用.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测BMP-2对培养的人椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因 mRNA表达的调控作用.结果在BMP-2浓度为100 μg/L(0.149±0.006,P<0.05)和1 000 μg/L(0.163±0.006,P<0.01)时,其对椎间盘细胞中Sox9基因 mRNA可起到显著的正向调控作用;在此浓度下,它也可以对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因mRNA起到正向调控作用.结论 BMP-2可以按照剂量依赖方式正向调控椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达.     

负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的制备及异位成骨活性研究

目的 制备负载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的壳聚糖纳米微球,并考察其成骨活性. 方法 应用离子交联法制备空白壳聚糖纳米微球和rhBMP-2壳聚糖纳米微球,应用透射电镜观察微球的形态,激光粒径分析仪测定其粒径的分布,检测其载药量、包封率及累积释药率.取24只SD大鼠,随机分为4组,每组6只.以无菌手术分别在大鼠左侧股部建立肌袋.A组大鼠肌袋内植入rhBMP-2壳聚糖纳米微球(含rhBMP-2 1 mg),B组大鼠肌袋内植入rhBMP-2 1 mg,C组大鼠肌袋内植入空白壳聚糖纳米微球,D组大鼠肌袋内不做任何处理.评估rhBMP-2壳聚糖纳米微球的成骨活性.结果离子交联法制备的壳聚糖纳米微球球形规整、分散均匀,微球平均粒径为230.0 nm,分布较集中,包封率为66.87％±4.58％,载药率为(33.44±2.29) μg/mg.A、B、C、D组的ALP活性平均分别为(1.94±0 35)、(1.48±0.56)、(0.20±0.07)及(0.18±0.06) kat/g,差异有统计学意义(F=42.959,P=0.000),A、B组明显高于C、D组,且A组高于B组.4组钙含量平均分别为(5.20±1.42)、(3.80±1.40)、(0.19±0.08)、(0.20±0.08)μg/mg,差异有统计学意义(F=39.242,P=0.000),A、B组明 显高于C、D组,且A组高于B组. 结论 离子交联法可成功制备出均一的rhBMP-2壳聚糖纳米微球,该微球具有良好的载药性能和缓释性能,且其骨诱导活性优于单纯rhBMP-2.     

重组BMP-4对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用原核细胞基因工程方法生产出有活性的骨形态发生蛋白-4(bonemorphoge-neticprotein-4,BMP-4),观察其对骨髓基质干细胞生物学行为的影响。方法利用RT-PCR技术,从成熟的人胎盘组织中扩增出长0.34kb编码人BMP-4成熟肽的基因序列,装入表达载体pET-22b( ),转化大肠杆菌BL-21菌株,并诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE检测表达蛋白。获得的蛋白制品经小鼠异位成骨测活证实后,诱导培养的兔骨髓基质干细胞,观测细胞形态变化、碱性磷酸酶和骨钙素的含量。结果大肠杆菌中目的蛋白表达量达菌体蛋白的15%,该蛋白可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,形成钙结节,碱性磷酸酶和骨钙素的含量也明显增加。结论大肠杆菌可表达出有活性的BMP-4,该蛋白可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。     

Ectopic bone formation of human bone morphogenetic protein-2 gene transfected goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells in nude mice

onemorphogenetic proteins (BMPs)haveapowerfulcapacitytoelicitnewboneformation .ThereareseveraldeliverymethodsofBMPsintreatingbonedefects ,oneofwhichisgenetherapy .Retrovirus,adenovirusandadeno associatedvirushavebeenutilizedtodeliverBMPgene .1,2 Sincethedirectuseofthesevectorshasseveraldisadvantages ,wehavedevelopedexvivo genetherapytechniquewhichinvolvestheisolationandcultivationofautologousbonemarrow derivedmesenchymalstemcells (MSCs) ,transfectionofthecellsinvitroandimplantationofthesec…     

pcDNA3-hBMP2基因转染成纤维细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性hBMP2基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 将hBMP2的cDNA连入真核表达载体pcDNA3,形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,在脂质体介导下,将其导入小鼠成纤维细胞株（NIH3T3）。通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养4周,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。结果 经原位杂交和免疫组织化学证实,转染 pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。结论 在脂质体介导下,hBMP2基因能够导入成纤维细胞内并在其内获得稳定表达。