脐血、健康人及慢粒患者外周血来源的DC介导的抗白血病免疫效应研究

目的：观察脐血、健康人及慢性柱细胞性白血病(CML)患者外周血3种不同来源的树突状细胞(DC)及其抗白血病效应。方法：分离3种来源的单个核细胞(MNC)并在细胞因子(GM-CSF IL-4 TNF-α)作用下诱导培养DC。观察DC形态，流式细胞技术检测DC免疫表型(CD1α、CD80、CD83、HLA-DR)；将所得DC经CML细胞可溶性抗原负载后和其同源T细胞混合诱导抗原特异性CTL，MTT法检测其杀伤活性。结果：3种来源MNC在细胞因子作用下均可获得形态典型的DC，且高表达CD1α、CD80、CD83、HLA-DR，经抗原负载后的DC诱导的CTL对CML靶细胞的杀伤活性也较强。结论：脐血、健康人及CML患者外周血均为理想的DC来源；有较好的诱导CTL杀伤白血病细胞效应；应用DC瘤苗免疫治疗白血病必将成为一种崭新的肿瘤免疫治疗方法，有十分诱人的发展前景。     

抗原负载树突状细胞介导肝癌患者肿瘤杀伤细胞功能状态研究

目的:探讨肝癌细胞抗原负载树突状细胞激活肝癌患者外周血细胞毒性T细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TI1)的抗肿瘤作用.方法:以细胞计数、间接荧光表型测定分析肝癌患者DC功能状态;MTT法测定肝癌细胞抗原负载DC介导肝癌患者外周血CTL、TIL对肝癌细胞的杀伤活性.结果:肝癌患者DC表达CD1a、CD80、CD83和HLA-DR等分子水平,DC介导的CTL、TIL对肝癌细胞的杀伤活性明显低于健康对照组(P＜0.05,P＜0.01).结论:肝癌患者存在DC功能缺陷,致使其介导的CTL、TIL对肝癌细胞的杀伤作用明显降低.     

肿瘤源性血管内皮细胞RNA转染树突细胞体外诱导特异性CTL的研究

目的:探讨转染肿瘤血管内皮细胞RNA的树突细胞(DC)能否诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法:采用肿瘤细胞的培养上清诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖,从而制备肿瘤源性血管内皮细胞(Td-EC)。用RT-PCR检测肿瘤内皮标志1(TEM1)在Td-EC上的表达。制备Td-EC的总RNA,转染从人外周血中扩增的未成熟DC,用流式细胞仪检测DC表型的变化,用LDH法检测DC诱导的CTL对Td-EC、HUVEC和人脐静脉内皮细胞株CRL-1730的杀伤率。结果:Td-EC特异性表达TEM1。转染RNA的DC组CD83、CD86表达率分别为(85.22±7.73)%和(88.38±8.02)%,而未成熟DC组CD83、CD86表达率分别为(51.58±9.49)%和(61.77±2.91)%,两组差异有统计学意义,P<0.05。在效靶比为20∶1、10∶1和5∶1时,CTL对Td-EC的杀伤率分别为(34.15±1.14)%、(27.02±1.31)%和(13.12±1.63)%;CTL对HUVEC杀伤率分别为(11.35±0.97)%、(8.24±0.37)%和(5.30±0.73)%;CTL对CRL-1730杀伤率分别为(13.24±1.76)%、(8.41±0.91)%和(5.31±0.94)%;CTL对Td-EC杀伤率均显著高于对HUVEC和CRL-1730的杀伤率,P<0.05。结论:转染Td-EC RNA的DC可在体外诱导CTL特异性地杀伤Td-EC。     

树突状细胞疫苗与食管癌免疫治疗

随着树突状细胞(DC)体外扩增技术和肿瘤抗原制备、负载体系等DC疫苗制备技术的发展,与食管癌治疗相关的多种DC疫苗相继出现,包括多肽负载DC疫苗、食管癌细胞-DC融合疫苗、核酸负载DC疫苗、自体肿瘤抗原负载DC疫苗等,其中多肽负载DC疫苗及凋亡的自体肿瘤细胞负载DC疫苗等在临床应用中已取得较好疗效.     

肝癌细胞对重组人HSP70联合肝癌组织冻融抗原修饰树突状细胞的免疫应答

目的:研究重组人热休克蛋白70(rhHSP70)联合肝癌组织冻融抗原修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导对肝癌细胞的免疫杀伤效应.方法:外周血单个核细胞经粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4 (IL-4)诱导生成DC,负载冻融抗原的同时加入rhHSP70,不同分组致敏的DC激活淋巴细胞生成肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cells,CTL),四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及3H-TdR法检测DC刺激淋巴细胞增殖能力, MTT法检测CTL对肝癌细胞的体外杀伤活性,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞因子的分泌,流式细胞术(FCM)检测DC表型变化.结果:冻融抗原致敏的DC可明显促进淋巴细胞增殖,能有效呈递肝癌冻融抗原,诱导产生抗原特异性CTL,联合rhHSP70能进一步增强CTL对肝癌细胞的杀伤作用.结论:肝癌冻融抗原联合rhHSP70修饰的DC诱导CTL对肝癌细胞能产生高效杀伤作用.     

DC-CIK对急性髓细胞白血病干细胞的杀伤作用

目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)联合同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)对急性髓细胞白血病细胞株KG-1a中白血病干细胞(leukemic stem cell,LSC)的体外杀伤和诱导凋亡作用。方法:分离健康人外周血单个核细胞,贴壁细胞用GM-CSF和IL-4诱导培养DC,悬浮细胞用IL-2、IL-1、IFN-γ和CD3 mAb诱导培养CIK。将KG-1a细胞冻融物作为抗原负载DC(即Ag-DC),与CIK共培养作为实验组(Ag-DC-CIK),无抗原负载的DC与CIK共培养作为对照组(DC-CIK),单独CIK作为空白对照组,与KG-1a共育后流式细胞术检测各组细胞中CD34+CD38-CD123+白血病干细胞的比例。DC-CIK与KG-1a细胞共培养,流式细胞术检测各组细胞中KG-1a细胞与CD34+CD38-CD123+细胞的凋亡率。结果:外周血单个核细胞成功诱导DC。CIK组、DC-CIK组及Ag-DC-CIK组中CD3+CD56+细胞比例为(17.36±4.44)%、(28.22±3.66)%和(36.16±5.88)%,依次升高(P<0.05)。与对照组相比,Ag-DC-CIK组与DC-CIK组细胞中CD34+CD38-CD123+细胞比例显著降低[(8.78±0.62)%vs(3.95±0.53)%、(3.03±0.62)%,P<0.01〗。DC-CIK可诱导KG-1a细胞凋亡,凋亡率由(2.34±0.74)%上升至(12.27±1.01)%,但对其中CD34+CD38-CD123+细胞无明显的诱导凋亡作用。结论:DC联合CIK能杀伤急性髓细胞白血病干细胞,但无明显的诱导凋亡作用。     

髓系抑制性细胞对神经母细胞瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞体外增殖和杀伤抑制作用北大核心CSCD

目的探讨髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)对神经母细胞瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)体外增殖和杀伤活性的影响。方法体外培养神经母细胞瘤SK-N-SH细胞、自BALB/c小鼠分离培养树突状细胞(dendritic cell,DC)和CD3+T细胞,制备DC诱导的神经母细胞瘤抗原特异性CTL。分离纯化小鼠MDSC,将CTL与MDSC混合培养,采用CFSE荧光染色和流式细胞学方法,检测MDSC对CTL增殖抑制情况。将CTL与SK-N-SH、MDSC混合培养,ELISA法检测不同组CTL对SK-N-SH杀伤率及上清液中IL-2和IFN-γ分泌情况。结果磁珠分选纯化后Gr-1+CD11b+MDSC细胞比例为84.6%。负载抗原的CTL细胞上清液中IL-2和IFN-γ含量较单纯培养T细胞上清液中IL-2和IFN-γ含量明显增高(P<0.05)。与MDSC共培养的CTL细胞增殖明显受抑;而单独培养CTL随时间延长细胞增殖明显。MDSC+CTL+SK-N-SH组杀伤率较CTL+SK-N-SH组明显降低(t=6.506,P<0.001);两组上清液中IL-2和IFN-γ分泌量差异亦有统计学意义(均P<0.01)。结论 MDSC可抑制神经母细胞瘤抗原特异性CTL的体外增殖和活性而产生免疫耐受,抑制CTL对神经母细胞瘤细胞的杀伤作用。     

热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞体外刺激细胞毒T细胞活性比较

目的:比较热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞(dendritic cell,DC)体外刺激细胞毒T细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)的活性。方法:分别制备热休克诱导凋亡胃癌细胞株和肿瘤细胞冻融裂解物,同时分离12例胃癌患者外周血单核细胞体外诱导DC进行负载,并以两种不同方式负载的DC进行淋巴细胞增殖反应及CTL杀伤实验,比较其刺激淋巴细胞增殖及激活的淋巴细胞杀伤靶细胞能力的差异。结果:负载热休克胃癌细胞的DC与负载反复冻融肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞CTL活性,但前者的CTL活性显著高于后者(P<0.05)。结论:用热休克肿瘤细胞负载DC是一个更为有效的负载方式,为临床应用提供了一种可选择的负载方式。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因修饰的树突状细胞疫苗增强体外抗肿瘤免疫效应

目的 研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰树突状细胞(DC)后形态、表型及功能的变化,以及增强DC疫苗对肿瘤细胞的体外杀伤作用.方法 小鼠尾静脉注射趋化因子配体3(CCL3),分选得到B220- CDllc+细胞,经细胞因子培养诱导分化DC.在体外用含GM-CSF基因的重组腺病毒(AdGM-CSF)转染DC,酶联免疫吸附试验(ELJSA)检测转染后GM-CSF的水平.通过细胞形态学观察、表型分析及混合淋巴细胞反应(MLR),检测GM-CSF基因修饰前后DC的变化.反复冻融法制备胃癌可溶性抗原,将其与GM-CSF基因修饰的DC共同培养,制备DC疫苗,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测活化的T淋巴细胞在体外对小鼠前胃癌细胞(MFC)的杀伤作用,ELISA法检测干扰素γ(INF-γ)的分泌情况.结果 CCL3注射后,外周血中B220- CD11c+细胞明显增加,48 h达到高峰[占外周血单个核细胞的(13.88±1.10)%].AdGM-CSF转染后,培养液上清中GM-CSF浓度升高,当感染复数(MOI)为1:100时达到高峰[(130.00±12.61)pg/m1].经GM-CSF.基因修饰的DC在形态上更趋成熟,MHCⅡ类分子、CD80、CD86等细胞表型明显上调,具有更强的刺激T细胞增殖的能力.荷载胃癌抗原的DC激活的T淋巴细胞对MFC细胞具有特异性杀伤作用,并产生高水平的INF-γ[(1245.00±13.75)pg/ml].结论 GM-CSF转染DC后,能大量表达GM-CSF,DC形态及细胞表型更趋成熟,刺激T细胞增殖能力明显增强.GM-CSF基因修饰的DC在体外可诱导出针对靶肿瘤细胞的特异性杀伤作用.     

树突状细胞体外高效诱导白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞生成

[目的]研究体外诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)及其抗白血病反应.[方法]应用mGM-CSF及mIL-4细胞因子从小鼠骨髓细胞扩增出成熟树突状细胞(DC),使其负载冻融法制备的白血病细胞相关抗原(TAA),通过观察DC诱导的白血病特异性CTL的免疫表型,MTT分析其对于L7212细胞的抑制率,利用ELISA评价IL-2和IL-4水平.[结果]骨髓单个核细胞经mGM-CSF、mIL-4的联合作用7天后光镜及扫描电镜下观察到大量成熟DC生成.经负载TAA的DC活化后T细胞中CD3 、CD8 、CD25 细胞明显增多.FCM显示CD3 、CD8 、CD25 T细胞显著增多,CD8 细胞多于CD4 细胞.活化后T细胞对L7212细胞有特异性杀伤活性,在效靶比为50:1培养72 h后杀伤率达90.1%±2.7%.DC与T细胞共培养上清中IL-2的分泌水平为4.656±0.62pg/ml,明显高于普通T细胞培养组的1.436±0.11pg/ml(P=0.011),IL-4水平则无明显变化(P＞0.05).[结论] mGM-CSF及mIL-4配伍诱导生成的DCs经L7212冻融抗原负载后可在体外高效诱导白血病特异性CTL生成.     

Can cancer cells transform normal host cells into malignant cells?

A human prostate tumour cell line, LNCaP C4-2, when injected into athymic male nude mice, produced tumours containing: (1) only human cancer cells similar to those injected; (2) only murine stromal cells containing abnormal chromosome constitutions; or (3) both human prostate cancer cells similar to those injected and the transformed murine stromal cells with altered chromosome constitutions. Karyotypic analysis of murine metaphases from all the host-derived tumours showed mostly pseudodiploid chromosome constitutions, with multiple copies (amplification) of mouse chromosome 15 and the absence of a typical Y chromosome. Fluorescence in situ hybridization analysis of these murine cells, using a biotin-labelled total human DNA painting probe, further demonstrated the absence of human DNA and the presence of only mouse metaphase and interphase cells in these transformed stromal cells. These results suggest that cancer cells are capable of inducing neoplastic transformation in stromal cells of the host organ by some, as yet unknown, epigenetic mechanism(s).     

CIK、DC-CIK细胞对神经母细胞瘤细胞杀伤作用的研究

目的：研究细胞因子诱导的杀伤细胞（ CIK）与树突状细胞（ DC）共培养后对神经母细胞瘤（ neuro-blastoma,NB）细胞株的杀伤作用。方法：取健康人和肿瘤患者外周血单个核细胞（ PBMC）,加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,用流式细胞术测定诱导培养前后DC和CIK细胞的表型,MTT法测定不同组CIK细胞对NB细胞株的杀伤活性。结果：流式细胞仪检测健康人PBMC培养后CD3＋CD56＋淋巴细胞百分比以及对NB细胞株的杀伤活性均显著高于肿瘤患者（ P〈0.05）。此外,与单纯CIK细胞相比,DC-CIK细胞具有更强的杀伤NB细胞株的活性（ P〈0.05）。结论：DC-CIK细胞是一种细胞毒作用高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。健康人和肿瘤患者的PBMC经诱导培养获得的CIK细胞有显著差别,为临床进一步提高CIK细胞的治疗效果提供了实验依据。     

肝干细胞与肝癌干细胞

正常肝干细胞在致癌因素作用下发生基因突变，获得无限增殖能力成为肿瘤干细胞，肿瘤干细胞分化成各种分化等级、表型不一的肿瘤。在正常肝干细胞转化成肝癌干细胞的过程中保留了一些干细胞表型特征和进一步向相对成熟细胞分化的能力。正常肝干细胞是肝癌重要起源。     

自然杀伤细胞与肿瘤细胞之间的免疫编辑

自然杀伤细胞(nature killer cell, NK)是机体天然免疫的主要承担者，NK细胞表面表达的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(inhibitory killer cell immunoglobulinlike receptor，KIR)和活化性受体NKG2D是调节NK细胞杀伤活性的主要受体。NK细胞通过其细胞表面的活化性受体和肿     

Activated endothelial cells induce apoptosis in lymphoma cells

We have previously shown that the arrest or regression of mouse liver metastases formed by lacZ-transduced ESbL T lymphoma cells (ESbL-lacZ) is associated with the stimulation of nitric oxide (NO) production by liver endothelial cells in sis. Here we studied in vitro the NO-mediated cytotoxicity against ESbL-lacZ target cells using well-characterized bovine endothelial cells (BEG) as effector cells. It was found that the co-culture of BEC with human TNF-alpha caused an increase of NO synthesis which could be completely blocked by the treatment with inducible NO synthase (iNOS) inhibitor N-G-monomethyl-L-arginine (NMMA). Incubation of activated BEC with metastatic lymphoma cells led to the death of the latter cells as evidenced by staining with propidium iodide and FAGS analysis. This cytotoxicity was considerably reduced after pretreatment of BEC with NMMA. Cytotoxic effects were also demonstrated after incubation of tumor cells with NO donor glycerol trinitrate (GTN). Non-activated BEC were not able to produce NO and showed a substantially lower level of cytotoxicity. The anti-tumor cytotoxicity exerted by activated BEC includes the stimulation of apoptosis in metastatic lymphoma cells which is mediated to a large extent by NO. These data reveal a novel role of endothelial cells in the elimination of metastatic cells through the induction of programmed cell death.     

神经干细胞和脑肿瘤干细胞研究进展

神经干细胞（NSC）是中枢神经系统（CNS）内具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，主要存在于脑室下区域（SVZ），NSC通过自我更新和分化维持正常CNS的形态和功能。可塑性（plasticity）是NSC的重要特征，由NSC所处的微环境（microenvironment）决定。脑肿瘤干细胞（BTSC）是脑肿瘤中与NSC相似的细胞，是脑肿瘤发生和生长的细胞来源。BTSC可能起源于NSC，是NSC可塑性的表现，导致NSC向BTSC分化的机制可能是微环境作用的结果。