反义Gαq／11亚基ODNs对平滑肌细胞DNA合成和PC蛋白表达的 …

目的：探讨Ｇｑ蛋白介导血管活性多肽对ＶＳＭＣＤＮＡ合成及增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）蛋白表达的影响。方法：用硫代的Ｇαｑ／１１亚基反义寡聚脱氧核苷酸，以６μｍｏｌ／Ｌ的浓度加入含１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ刺激无血清ＤＭＥＭ培养基中体外培养ＶＳＭＣ。用＾５Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定ＶＳＭＣＤＮＡ合成，免疫细胞化学技术检测ＶＳＭＣＰＣＮＡ蛋白表达。结果：Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ可明显抑制ＶＳＭＣＤＮＡＲ的合成，在     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞迁移的影响

目的：血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）迁移在血管成形术后再狭窄的发生中起着关键作用。ｃ－ｍｙｃ是对多种刺激ＳＭＣ迁移的生长因子作出迅速早期反应的基因。推测采用与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ互补的寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）的反义战略可达到抑制ＳＭＣ迁移的目的。方法：将嵌合性硫代磷酸修饰的反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,采用改良的Ｂｏｙｄｅｎｃｈａｍｂｅｒ方法检测ＳＭＣ的迁移率。结果：反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ作用的ＳＭＣ对１０％ＦＢＳ的化学趋化活性明显减弱,反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ显著抑制了ＳＭＣ迁移。而正义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ和错配ｃ－ｍｙｃＯＤＮ处理的ＳＭＣ,与对照组相比,迁移率无差别。结论：（１）反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ对体外ＳＭＣ迁移的抑制具有序列特异性;（２）ｃ－ｍｙｃ基因表达在ＳＭＣ迁移的信号通路中起关键作用;（３）本研究为采用ｃ－ｍｙｃＯＤＮ的战略抑制ＳＭＣ迁移进而防止血管成形术后再狭窄的发生奠定了基础     

反义寡核苷酸抑制猪内皮细胞生成内皮素的研究

目的：研究内皮素反义寡核苷酸能否抑制猪肺动脉内皮细胞生成内皮素。方法：设计并合成三段针对内皮素－１前体基因的反义寡核苷酸片段，检测其对培养的内皮细胞生成内皮素的影响。结果：两个反义寡核酸片段能明显抑制体外内皮细胞生成内皮素，而相应正义和非特异硫代寡核苷酸则无此抑制作用，说明其作用具特异性。结论：内皮素－１反义寡核苷酸有可能用于内皮素相关的疾病的治疗。     

c-sis反义寡核苷酸对肺血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的:探讨从血小板源生长因子-B链(PDGF-B)的基因水平阻断对肺血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:给肺动脉平滑肌细胞(VSMC)分别施加不同剂量的c-sis癌基因反义寡核苷酸(ASON), 通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察细胞不同时相的增殖曲线;采用流式细胞术观察不同干预条件下VSMC细胞周期的变化。结果:中、大浓度ASON对细胞增殖有明显抑制作用。在中浓度的ASON作用下, 加入PDGF-BB能促进VSMC的增殖。ASON干预前后, VSMC增殖周期中各期细胞构成发生显著的变化, 以G₀＋G₁期细胞增多、S+G₂＋M期细胞减少为特征。各组的G₀＋G₁期细胞均显著多于对照组(P＜0.05)。小剂量与中剂量、中剂量与大剂量间G₀＋G₁期细胞有显著差异(P＜0.05)。结论:中、大剂量ASON能明显抑制肺VSMC的增殖, 可使G₀＋G₁期细胞数明显增多, 且与ASON有剂量依赖关系。     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

目的：探讨ｃ－ｍｙｃ基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖的作用。方法：采用针对大鼠ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ包括ＡＵＧ在内的翻译起始区的前５个密码子的嵌合性硫代修饰的反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＯＤＮ）,以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,通过细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入观察其对ＳＭＣ增殖的抑制作用。结果：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ不仅对从静止状态刺激的ＳＭＣ增殖有抑制作用,而且对处于增殖状态的ＳＭＣ的增殖也有显著抑制作用,这种抑制作用可因加入正义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ而减弱甚至消除,而且随着剂量的增加,抑制作用越来越明显。一次性应用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ可达到较持久的作用。而正义ＯＤＮ和错配ＯＤＮ对ＳＭＣ增殖无影响。结论：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ以剂量依赖和序列特异方式抑制ＳＭＣ增殖。ｃ－ｍｙｃ基因表达在ＳＭＣ增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ抑制ＳＭＣ增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。     

粘着斑激酶活化对平滑肌细胞粘附和迁移的影响

目的:研究粘着斑激酶磷酸化在细胞外基质成份诱导平滑肌细胞粘附和迁移中的作用。方法:通过纤粘连蛋白(FN)诱导培养的平滑肌细胞粘附迁移,以免疫沉淀和Western blolt方法检测粘着斑激酶(FAK)及其磷酸化的表达量。将FAK反义寡核苷酸(ODNs)经脂质体转染细胞,观察对FAK磷酸化、细胞粘附铺展和迁移的影响。结果:FN在显著诱导平滑肌细胞粘附和迁移时,FAK也呈明显表达,20 mg/L FN可使其磷酸化处于较高表达量。脂质体可有效地介导ODNs转染,转染效率为(86.7±4.5)%,FAK磷酸化表达量明显减少,5-60 mg/L不同浓度FN组,细胞铺展率减少17.89%-27.67%,10、20、40和60 mg/L FN组迁移细胞数也分别显著少23.26%、21.63%、19.31%、17.88%(P＜0.05)。结论:活化的FAK是细胞外基质诱导SMCs粘附和迁移的重要信号分子,由其介导的信号转导促进了这一过程,反义FAK ODNs可有效地对此进行抑制。     

高血糖症对大鼠血管平滑肌细胞表型转变的影响

目的：复制高血糖症大鼠模型,研究高糖对大鼠血和平滑肌细胞表型转变的影响及其机制。方法：采用组织培养及放射免疫分析方法测定各指标。结果：（１）设备在糖组血浆ＮＯ２含量、血管壁ＮＯＳ活性及ＣＧＭＰ含量明显低于对照组;（２）高血糖组血清胰钫 含量１、血管平滑肌细胞的「＾３Ｈ」－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组。结论：长期高血压糖症可引起血管平滑肌细表型发生转变,从而促进了血管平滑肌细胞的增殖。     

Caveolin-1反义寡核苷酸对SMMC7721细胞增殖和VEGF表达的影响

目的:研究caveolin-1反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:脂质体介导caveolin-1反义寡核苷酸瞬时转染SMMC7721细胞,Western blotting检测转染效果;MTT法和ELISA法分别检测转染前后SMMC7721细胞增殖和分泌VEGF的变化。结果:转染48 h后,反义寡核苷酸组caveo-lin-1蛋白表达水平明显低于对照组;MTT检测结果显示,转染后的SMMC7721细胞显著增殖,增殖率为90.9%;ELISA检测结果显示,转染后的SMMC7721细胞分泌的VEGF显著升高(P0.01)。结论:Caveolin-1反义寡核苷酸抑制caveolin-1的表达,而caveolin-1具有抑制SMMC7721细胞的增殖和其分泌VEGF的作用,有望成为肿瘤治疗的新靶点。     

bcl—2基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响

目的：探讨ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响。方法：应用细胞培养，免疫标记及流式细胞仪技术，检测了ｂｃ１－２基因反义寡脱氧核糖核苷酸（ＡＳＯＤＮ）和阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）对白血病Ｋ５６２和ＨＬ－６０细胞作用和ｂｃｌ－２基因表达。结果：Ａｒａ－Ｃ（１０μｍｏｌ／Ｌ）与ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ同时作用比单独用Ａｒａ－Ｃ或Ａｒａ－Ｃ与正义寡脱氧核糖核苷酸（ＳＯＤＮ）细胞存活率显著减少（Ｐ＜０００１），并且流式细胞仪检测显示ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ使ｂｃｌ－２蛋白阳性率降低。结论：ｂｃｌ－２基因反义寡核苷酸能抑制该基因表达，提高白血病细胞对Ａｒａ－Ｃ的敏感性     

半边莲生物碱抑制内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖

目的：探讨半边莲生物碱(LCLA)对内皮素-1（ET-1）诱导人脐动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的抑制效应及其作用机制。 方法： 采用细胞计数、［3H］-TdR掺入、流式细胞术、免疫细胞化学染色及Fura-3/AM 荧光探针标记方法检测VSMC增殖；并用台盼蓝拒染、乳酸脱氢酶（LDH）检测方法观察LCLA对VSMC的毒性反应。 结果： LCLA(100、200和400 mg/L)、BQ-123(10-6mol/L)、ST(10-7mol/L)均抑制ET-1所诱导的VSMC增殖（均P＜0.05）：明显降低VSMC的细胞数目、［3H］-TdR掺入量、S期和G2/M期的数目百分比，增加G0/G1期的数目百分比；减弱细胞内增殖细胞核抗原（PCNA）的表达强度和Ca2+荧光强度；LCLA的抑制作用存在明显的剂量依赖关系，但对VSMC存活率和LDH释放量均没有影响。 结论： LCLA浓度依赖性地抑制ET-1所诱导的人脐动脉VSMC增殖，其机制与降低VSMC内Ca2+含量有关。     

端粒酶RNA反义核酸降低鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平

目的:研究端粒酶活性抑制后鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平的变化。方法:脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫组化法检测端粒酶逆转录酶(hTRT)和p53蛋白表达水平。结果:端粒酶RNA反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量依赖性,流式细胞仪检测出现凋亡峰,反义寡核苷酸组hTRT和p53蛋白表达水平显著低于其它处理组及空白对照组(P＜0.01)。结论:端粒酶RNA反义寡核苷酸抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性后可降低p53蛋白表达水平。     

ET-1和bFGF促进大鼠血管平滑肌细胞增殖的协同作用及其机制研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮素-1(ET-1)促进血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的协同作用,并进一步研究可能的机制。方法:5-溴-2’-脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入法和细胞计数法观察对VSMC增殖的影响,Western免疫印迹法观察ET-1对VSMCbFGF和成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR-1)蛋白表达的影响。结果:bFGF和ET-1能协同促进VSMCBrdU掺入和细胞增多,并且在一定剂量和时间范围内呈量效、时效关系。同时ET-1剂量依赖性上调bFGF和FGFR-1蛋白,表达高峰分别为24和48h,二丁酸佛波脂(PDBU)预耗竭细胞内蛋白激酶C(PKC)后该上调作用显著下降。结论:bFGF和ET-1对VSMC增殖具有协同作用,与ET-1上调bFGF和FGFR-1蛋白有关,上调作用呈PKC依赖性。     

bcr-ahl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞生长的影响

目的：研究 ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸（Ａｓｐｏ）对 Ｋ５６２细胞生长特性的影响,探讨其在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）基因治疗中的意义。方法：倒置显微镜下细胞活体观察;Ａｓｐｏ与细胞共同培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及 １２０ｈ,用０．４％台盼蓝染色计各处理组死活细胞数,甲基纤维素半固体培养法观察其克隆形成率的变化,流式细胞仪测定各处理组细胞Ｐ２１０蛋白表达变化。结果：Ａｓｐｏ处理后细胞仍呈克隆状生长,当 Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ时,即可产生增殖抑制作用,呈一定的量效关系,其最大抑制效应时间为作用１２０ｈ,当Ａｓｐｏ达１０μｍｏｌ／Ｌ时,在一定细胞浓度范围内（１×１０４／ｍＬ－ ５× １０５／ｍＬ）,均有显著抑制作用,当Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ以上时,Ｋ５６２细胞 Ｐ２１０蛋白表达明显下降甚至不表达。 ｂ２ａ２型 Ａｓｐｏ对表达 ｂ３ａ２型 ｍＲＮＡ的 Ｋ５６２细胞也表现出交叉抑制作用。结论：ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞具有特异性增殖抑制作用,在慢性粒细胞白血病基因治疗中值得深人研究。     

缺氧内皮细胞培养液对肺动脉平滑肌细胞表型的影响

用细胞培养和形态定量分析方法观察缺氧对肺动脉平滑肌细胞表型的影响。结果显示，缺氧性内皮细胞条件培养液组肺动脉平滑肌细胞的二倍体细胞和α－ｓｍ－ａｃｔｉｎ含量均少于常氧性内皮细胞条件培养液组（Ｐ＜０．０５），尤以肌丝成份减少最明显；粗面内质网和线粒体却显著增多。而直接缺氧组与常氧组无明显差异。提示：缺氧可促使内皮细胞产生和释放某种促平滑肌细胞表型转化的物质或因子，从而改变了肺动脉管壁细胞之间的正常调控关系，导致平滑肌细胞肥大，合成细胞外基质增多。     

bcr-abl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞生长的影响

目的: 研究bcr-abl融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸(Aspo)对K562细胞生长特性的影响,探讨其在慢性粒细胞白血病(CML)基因治疗中的意义。方法:倒置显微镜下细胞活体观察;Aspo与细胞共同培养24 h、48 h、72 h、96 h及120 h,用0.4％台盼蓝染色计各处理组死活细胞数,甲基纤维素半固体培养法观察其克隆形成率的变化,流式细胞仪测定各处理组细胞P210蛋白表达变化。结果:Aspo处理后细胞仍呈克隆状生长,当Aspo浓度达5μmol/L时,即可产生增殖抑制作用,呈一定的量效关系,其最大抑制效应时间为作用120 h,当Aspo达10μmol/L时,在一定细胞浓度范围内(1×10⁴ /mL~5×10⁵/mL),均有显著抑制作用,当Aspo浓度达5μmol/L以上时,K562细胞P210蛋白表达明显下降甚至不表达。b2a2型Aspo对表达b3a2型mRNA的K562细胞也表现出交叉抑制作用。结论:bcr-abl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞具有特异性增殖抑制作用,在慢性粒细胞白血病基因治疗中值得深入研究。     

反义寡核苷酸抑制缺氧/再给氧时内皮细胞细胞间粘附分子-1的表达

目的:探讨反义寡核苷酸(AS-ODN)对缺氧/再给氧(H/R)时内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:流式细胞仪测定肾小球血管内皮细胞在缺氧、再给氧及加入AS-ODN后ICAM-1表达的阳性百分率。结果:缺氧10h,肾小球血管内皮细胞ICAM-1的表达与对照组无显著性差异,再给氧6hICAM-1的表达明显高于正常,加入AS-ODN后,ICAM-1阳性细胞的百分率下降40.6%。结论:AS-ODN可以降低H/R时内皮细胞ICAM-1的表达。     

成年合成型血管平滑肌细胞的研究进展

The intermediate phenotype of vascular smooth muscle cell in adult is the dedifferentiation state returned from the high differentiation state , appeared on the damaged blood vessels. It is regulated by many factors. Its distribution, the characteristics of morphology and structure, the regulated transform factors and the molecular biological mechanism are introduced, and its functional significance and the role in vascular diseases are also discussed in this article.     

缺氧对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞5-羟色胺转载体基因表达的影响

目的：探讨无氧（Ｏ％Ｏ２＋９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２）和低氧（２５～３％Ｏ２＋９２％Ｎ２＋５％ＣＯ２）对新生小牛肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）和肺动肺平滑肌细胞（ＰＡＳＭ）５－羟色胺转载体基因表达的影响。方法：应用细胞培养，核酸分子杂交技术。结果：无氧组和低氧组（１５ｈ、３ｈ、６ｈ）ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体ｍＲＮＡ表达显著高于常氧组（Ｐ＜００５），而无氧和低氧１２ｈ至４８ｈ对ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体ｍＲＮＡ表达无明显影响。无氧和低氧（３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ）组ＰＡＳＭ５－羟色胺ｍＲＮＡ表达均显著高于常氧组（Ｐ＜００１），结论：推测缺氧早期通过促进ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体基因表达，加强ＰＡＥＣ对５－羟色胺的摄取和降解，随缺氧时间的延长，ＰＡＥＣ的此功能受损。缺氧ＰＡＳＭ５－羟色胺转载体基因表达的持续增加，则可能参与缺氧肺动脉高压的形成。     

反义寡核苷酸抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞血管内皮生长因子mRNA表达及其生物效应的研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)转染对神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF mRNA表达的影响以及对肿瘤细胞增殖、分化的影响。方法用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸(MSODN)转染LA-N-5细胞,半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF165和VEGF121 mRNA转染前后不同时间表达的变化;MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率。结果半定量RT-PCR检测结果显示,在转染后72 h VEGF165和VEGF121 mRNA的表达:ASODN组为0.346±0.029和0.227±0.036,ASODN+LipofectamineTM2000组为0.275±0.035和0.165±0.017。ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组均显著抑制VEGF mRNA的表达,ASODN+LipofectamineTM2000组抑制作用较ASODN组更强(P<0.05);转染后ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组细胞增殖显著受抑,在48 h时抑制率最高,分别为(39.92±2.7...     

虎杖甙对正常人血管平滑肌细胞内钙和膜电位的调节作用

目的和方法：观察虎杖甙（ＰＤ）对人脐带动脉平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）内游离钙、细胞膜电位的变化,以探讨ＰＤ对血管平滑肌的调节机制。用Ｆｌｕｏ－３－ＡＭ、ＤｉＢＡＣ４（３）标记培养的ＶＳＭＣ,在激光共聚焦显微镜上测定细胞内游离钙和膜电位变化。结果：给ＰＤ（０５ｍｍｏｌ／Ｌ）１０ｍｉｎ后,ＶＳＭＣ内游离钙浓度升高５６％±５６％。当ＰＤ加入前用维拉帕米和ＥＧＴＡ预处理后,则游离钙不再升高;ＥＧＴＡ和肝素预处理也抑制ＰＤ的升钙作用,而ＥＧＴＡ和普鲁卡因预处理则使细胞内钙显著升高。ＰＤ还可使ＶＳＭＣ膜电位去极化,加入钠通道阻断剂河豚毒素（２５μｍｏｌ／Ｌ）可完全阻断ＰＤ的去极化作用：加甲氰咪胍、维拉帕米、优降糖和利及丁预处理不能阻断ＰＤ去极化作用。结论：：ＰＤ可通过细胞外钙内流来增加细胞内游离钙浓度,并促进细胞外钠离子内流而导致细胞去极化