空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究

目的建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌）和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应（PCR）检测技术。方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素（hly）基因序列和大肠杆菌的O157抗原（rfbE）基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6-8 h。结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。     

多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌

目的 建立可同时检测沙门菌、单增李斯特菌的双重实时荧光PCR快速检测方法,并应用于食品样品的检测.方法 根据GenBank上下载的沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因的保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重实时荧光PCR反应体系.对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行评估,并应用于食品标本...     

荧光定量PCR方法在空肠弯曲菌检测中的应用

空肠弯曲菌是引起人类食源性疾病的主要病原菌之一。快速、特异检测方法的建立对于该病原菌感染的诊断及鉴别诊断具有重要意义。荧光定量PCR方法作为一种快速诊断方法已经广泛应用于空肠弯曲菌的检测及鉴定。本文从荧光定量PCR方法在空肠弯曲菌病原检测中的建立、发展以及应用等方面进行综述。     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的 探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法.方法 根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqMan探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究.结果 该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10cfu/mL.反应体系具有很高的稳定性.结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值.     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法。方法根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqM an探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究。结果该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10 cfu/mL。反应体系具有很高的稳定性。结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值。     

聚合酶链反应检测空肠和结肠弯曲菌的核酸

为了解急性腹泻病空肠和结肠弯曲菌的感染率，建立了空肠和结肠弯曲菌的ＰＣＲ检测方法。引物设计在结肠弯曲菌鞭毛Ａ基因高度保守区，的主增产物为４５０ｂｐ。     

多重PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的 建立一种快速、特异的检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌株的多重PCR方法。 方法 针对O157:H7菌株的O157、H7抗原特异基因rfbE O157、fliC H7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因设计相应引物,在同一扩增体系中进行PCR反应,通过优化多重PCR 反应条件和循环参数,建立检测O157:H7菌株的多重PCR方法,并测定其特异性和灵敏度。 结果 6 对特异性引物各自扩增相应的基因片段,检测结果与常规PCR 获得的结果一致。细菌纯培养物的检测灵敏度为1.33×10⁴ CFU。 结论 该多重PCR方法能在一次检测中同时反映待测菌株是否为肠出血性大肠埃希菌O157:H7及其携带毒力基因的情况,可为O157:H7大肠埃希菌感染的诊断及流行病学调查提供一种简便、快速的检测手段。     

单增李斯特菌检测方法研究进展

单核细胞增生性李斯特菌L．monocytogenes（简称单增李斯特菌）被认为是引起动物和人类李斯特菌病的主要致病菌,是一种短小的革兰阳性无芽胞杆菌,研究发现单增李斯特菌包括致病性、弱致病性和非致病性3种类型．单增李斯特菌能使人畜致病,造成猪、鸡等多种畜禽死亡。人感染后则主要表现为脑膜炎、败血症和单核细胞增多。     

应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究

目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。     

一起单增李斯特菌引起新生儿败血症的溯源研究

目的 调查自贡市1例单核细胞增生性李斯特菌所引起的新生儿败血症病原学及流行病学特征,为防控提供参考。 方法 检测新生儿血液样本、产妇阴道及外阴拭子样本中的单增李斯特菌,采集该新生儿家庭住所的食品及环境样本、住所附近农贸市场的食品样本,检测样本中的单增李斯特菌,同时对产妇进行问卷调查;对分离到的单增李斯特菌进行血清型鉴定,并运用多位点序列分型（MLST）,脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术研究菌株的同源性。 结果 从新生儿及其母亲样品中分离到7株单增李斯特菌、居住地附近的农贸市场凉拌熟食摊中分离到1株,8株菌株的血清型均为1/2b,ST型均为ST87型,PFGE带型相似度100%。 感染母亲与市场中污染凉拌熟肉的单增李斯特菌来自同一污染源,新生儿李斯特菌感染由母婴垂直传播导致。 结论 凉拌熟肉制品很可能是孕产妇单增李斯特菌感染的危险因素,需要在食品安全风险监测项目中重点监测。 围产期妇女单增李斯特菌感染的筛查应作为产妇产检的重要内容。      

胶体金标记免疫层析法检测大肠杆菌O157

目的 应用抗大肠杆菌O157(E.coli O157)单克隆抗体,制备一种简便快速的胶体金标记免疫层析(GICA)条用于检测标本中E.coli O157.方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗E.coli O157单克隆抗体,以硝酸纤维膜作为抗E.coli O157单克隆抗体的包被载体,制成GICA检测条.标本中E.coli O157与检测条上金标记抗体(Au-Ab)结合后,利用硝酸纤维膜的层析作用移动,与膜上的固相抗体结合形成可见的红色条带.结果 GICA检测条灵敏度可达105 cfu/ml.用GICA检测了1750份不同食品和人畜粪便标本中E.coli O157,GICA检测条阳性份数43份,后经分离培养检出29株大肠杆菌O157;另14份标本经鉴定,其中12份标本可疑为弗劳地枸橼酸杆菌.结论 GICA条检测标本的E.coli O157,特异性较高,不需任何仪器设备,较简便快速,易于判断结果,故可对标本进行快速筛查,适合各级疾控中心和临床检验部门使用.     

新型环烯烃聚合物微流控芯片的设计及其在大肠埃希菌O157:H7快速检测中的应用

目的建立一种可快速检测大肠埃希菌O157:H7的新型微流控芯片方法,用于细菌的早期鉴别与诊断。方法采用激光雕刻技术制作微流控芯片,在OCA光学透明胶上雕刻1条微通道,再将上、下2层环烯烃聚合物(COP)不可逆键合,最后通过免疫荧光方法检测大肠埃希菌O157:H7。比较微流控芯片法与培养法检测结果的总体符合率。结果成功建立了一种新型、简易的微流控芯片系统,对大肠埃希菌O157:H7的检测限为10~3CFU/mL,且有良好的特异性和可重复性,与培养法的总体符合率为95%。结论新型COP塑料芯片系统可实现对大肠埃希菌O157:H7的低成本、快速检测。     

弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况

目的 建立一种快速检测弥散黏附性大肠埃希菌（DAEC）的普通多重PCR方法,了解DAEC在腹泻患者中的流行情况。方法 根据DAEC黏附基因afaB、afaC、afaD、daaE及16S rRNA基因rrs,建立4重PCR反应体系,对PCR引物、反应体系和反应条件进行优化,评价敏感性和特异性,并应用于389份腹泻患者粪便标本的筛查。结果 4重PCR反应可以特异性扩增DAEC菌株afaB/C、afaD、daaE基因片段,除2株肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）外,检测引物对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌均无特异性扩增,此多重PCR方法的检测下限可达3.20 101 CFU/反应（8.01 103 CFU/ml）。利用本研究建立的多重PCR方法对腹泻患者粪便标本进行检测,发现DAEC菌株分离率为6.2%（24/389）。结论 本研究建立的多重PCR方法可用于DAEC菌株的快速鉴别,也可用于人粪便标本DAEC的初步筛查。     

阀控多通道微流控芯片高通量快速检测大肠埃希菌O157:H7

摘要：目的：建立一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157:H7。 方法：采用集成多条反应通道和控制气阀的微流控芯片,用气阀控制芯片通道内反应的顺序,在通道交叉处构建出10个检测区。然后以免疫荧光技术为检测手段,检测水和粪便标本中的大肠埃希菌O157:H7。 结果：成功建立了一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,并应用于大肠埃希菌O157:H7的快速检测。此芯片一次可同时检测10个样本,单个样本检测时间少于10 min、试剂消耗量仅为0.5 μL,对大肠埃希菌O157:H7的最低检测限为1×10³ CFU/mL。检测大肠埃希菌O157:H7组的荧光信号（4 122±164）与大肠埃希菌ATCC 25922（2.67±0.45）及伤寒沙门菌（3.33±0.94）比较,差异有统计学意义（t分别为35.78和30.79,P均<0.01）。批内精密度为5.2%。将本法用于模拟临床样品中大肠埃希菌O157:H7的测定,敏感性和特异性分别为62%和100%,与培养法的总体符合率为81%。 结论：于气阀控制的多通道微流控芯片系统可实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157:H7,有望成为一种高效和快捷的新检测方法。     

一种鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌的PCR方法

目的利用基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法,鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌和O157大肠埃希菌。方法用微生物鉴定仪对细菌进行生化鉴定,与O157血清凝集,同时扩增wzx基因。结果25株与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌及1株不与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阳性,8株与O157血清不凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阴性,20株O157∶H7大肠埃希菌wzx基因扩增为阴性。结论对于可与O157血清发生强凝集的弗氏枸橼酸杆菌,基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法是一种有效的快速鉴别方法。     

不同来源STECO157:H7生物学特性研究

目的 探讨浙江省产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7菌株PFGE分型及携带毒力基因以及耐药情况.方法 菌株生化、血清鉴定按API 20E鉴定系统;大肠杆菌O157:H7诊断血清凝集试验;采用聚合酶链反应(PCR)法检测O、H抗原及毒力基因SLT1、SLT2、Hly、eaeA;STEC O157:H7分型用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行;14种抗生素进行药敏试验采用K-B法.结果 5株可疑菌株经生化和血清鉴定符合O157:H7特性;毒力基因检测所有分离株SLT2、Hly、eaeA三种毒力基因均阳性而SLT1均阴性;脉冲场凝胶电泳分型结果显示,有2株菌PFGE电泳条带完全相同,其余3株菌电泳条带不同,5株菌共分为4个带型;经耐药性分析,菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星100%敏感;对复方新诺明、氨苄西林100%耐药.结论 STEC O157:H7菌株在浙江省一些地区存在,并且携带SLT2毒力基因,PFGE型别较多,同时也有人间感染病例的出现,提示应加强O157:H7监测力度,防止该菌在人间的感染和流行.