Humanin抑制NR1亚基表达和NR2B亚基磷酸化的神经保护作用

目的：探讨Humanin （HN）通过抑制N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体NR1亚基的表达和NR2B亚基的磷酸化在兴奋性神经毒中发挥的保护作用,并阐明其可能的作用机制。方法：利用原代培养的Wistar大鼠皮层神经元建立NMDA诱导的兴奋性神经毒模型,将神经元分为对照组、NMDA组、NMDA+MK-801（MK-801）组和NMDA+HN（HN）
组。流式细胞术荧光定量检测各组神经元膜NMDA受体NR1亚基蛋白的表达,Western blotting法检测各组神经元膜NMDA受体NR2B亚基Tyr1472位点的磷酸化水平。结果： 倒置相差显微镜观察,NMDA组中的神经元胞体肿胀,个别细胞变成圆形,胞体周围光晕模糊,神经元突起大部分消失,表现出明显的神经毒性作用。流式细胞术免疫荧光定量检测,与对照组比较,NMDA组NR1亚基蛋白的平均荧光强度值明显增加（P<0.05）;与NMDA组比较,MK-801组和HN组的NR1亚基蛋白的平均荧光强度值明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测,各组神经元的NR2B亚基总蛋白的表达水平无改变;与对照组比较,NMDA组NR2B亚基蛋白Tyr1472位点的磷酸化水平明显升高（P<0.05）;与NMDA组比较,MK-801组和HN组均能降低NR2B亚基蛋白Tyr1472位点的磷酸化水平（P<0.05）。 结论： NMDA受体NR1亚基蛋白表达水平的增加和NR2亚基磷酸化可能参与NMDA诱导的兴奋性神经毒作用;HN可能通过抑制NR1亚基的表达和NR2B亚基的磷酸化而发挥对神经元的保护作用。     

白介素-6抗N-甲基-D-天门冬氨酸神经毒性作用的研究

目的:利用N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)损伤小脑颗粒神经元的模型,探讨IL-6对神经损伤的保护作用,为临床上应用细胞因子防治脑损伤提供新思路。方法:取出生后8天幼鼠小脑的颗粒神经元做体外培养。用IL-6(10 ng/m l)慢性预处理培养的小脑颗粒神经元,孵育8天后用NMDA(10、100、1000和10000μmol/L)急性刺激小脑颗粒神经元30 m in以造成神经元损伤。用CCK-8试剂盒(Cell Counting K it-8)检测神经元的活性。结果:NMDA能呈浓度依赖性地抑制小脑颗粒神经元的活性。单纯IL-6慢性预处理小脑颗粒神经元,不能改变小脑颗粒神经元的活性。IL-6慢性预处理小脑颗粒神经元可明显改善NMDA对小脑颗粒神经元活性的抑制作用。结论:NMDA对神经元有浓度依赖性的神经毒性作用,IL-6具有抗NMDA神经毒性作用的效应。     

早期惊厥样放电对发育中神经元NMDA受体1表达的远期影响

目的探讨早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体1（N—methyl—D—aspartate receptor1，NR1）表达的远期影响。材料与方法以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型。根据对培养6d皮层神经元的不同处理分为三组：正常DMEM培养液组（GONT1）、正常细胞外液组（CONT2）和无镁细胞外液组（MGF）。神经元分别在上述三种液体中孵育3h，然后恢复正常DMEM培养基继续培养，分别应用实时定量PCR与Westernblot方法在培养7、12及17d时测定皮层神经元NMDA受体1mRNA与蛋白表达的变化。结果在正常DMEM培养液中，NR1 mRNA与蛋白的表达在培养7d时处于较高水平，以后逐渐下降，以培养12d为最低。与GONT2和GONT1组相比，MGF组NR1 mRNA与蛋白的表达在培养7d皮层神经元均明显降低，在12d时明显增高（P〈0．05）。GONT2组与GONT1组相比无统计学差异（P〉0．05）。结论发育中皮层神经元早期无镁诱导惊厥样放电对NMDA受体1mRNA与蛋白表达具有远期影响，提供了神经元早期惊厥样放电引起远期功能损伤的可能机制。     

白介素-6拮抗N-甲基-D-天门冬氨酸诱导的神经元凋亡

目的:在抗凋亡成分Bcl-2、促凋亡成分Bax和凋亡关键酶半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl asparate-specific proteinase-3,caspase-3)的基因水平,探讨IL-6保护神经元防止N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导的神经元凋亡。方法:取出生后8d幼鼠的小脑进行颗粒神经元体外培养。在培养液中加入IL-6(40ng/ml),孵育8d后,用NMDA(100μmol/L)刺激小脑颗粒神经元30min,诱导神经元凋亡。用Real-timePCR法检测神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表达水平。结果:未用IL-6预处理的神经元,在用NMDA刺激后,其表达Bcl-2mRNA显著减少,表达BaxmRNA及caspase-3mRNA明显增加。IL-6本身没有明显影响上述基因的表达。神经元用IL-6预孵育后,再用NMDA刺激,神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表达水平与未用IL-6预处理的神经元比较,表现为Bcl-2上调、Bax和caspase-3下调的变化,这些变化均有显著意义。结论:NMDA可诱导神经元的凋亡,IL-6对NMDA诱导的神经...     

大鼠全脑缺血再灌注损伤及相关分子表达的时间过程

目的：研究大鼠全脑缺血再灌注损伤的时间过程及相关分子的表达变化。方法：在四血管阻断法（4VO）诱导全脑缺血模型上观察脑组织病理改变；同时应用免疫印迹方法检测脑组织NMDA受体亚单位蛋白及VCAM－1水平。结果：全脑缺血再灌注后3－14d海马CA1区产生迟发性神经元死亡。皮层NR1和NR2A亚单位表达分别于再灌注后1和3d显著增加，NR2B亚单位在1－3d也显示较高水平；海马NR1亚单位表达在1d明显下降，以后呈进行性升高，于14d达高峰；NR2A和NR2B表达有相似的趋向并于7d明显增加。海马和皮层VCAM－1分别于再灌注后3和7d表达明显上调。结论：脑缺血再灌注过程中海马神经元数量减少，皮层和海马的NMDA受体亚单位蛋白（NR1、NR2A和NR2B）及粘附分子VCAM－1有不同变化；干预两者的表达可能减轻脑缺血再灌注损伤。     

NMDA受体亚单位NR1在离体人神经干细胞中的表达

目的研究离体培养的人海马神经干细胞（NSCs）中NMDA受体亚单位NR1的表达。方法分离培养胎龄8-12周人胚脑海马神经干细胞,对NSCs进行Nestin和分化鉴定。用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹和RT—PCR等方法检测原代、传代1次、传代2次的人胚胎海马NSCs中NR1蛋白和mRNA的表达。结果在孕8～12周人胚脑海马分离培养的NSCs中,NMDA受体亚单位NRI免疫细胞化学反应呈阳性,该受体亚单位的蛋白和mRNA均被检测钊。结论体外培养的早期人胚胎海马NSCs能稳定表达NMDA受体亚单位NR1。     

NMDA受体和IP3受体介导NMDA诱导的小脑颗粒神经元内Ca2＋超载

目的探讨N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）诱导的小脑颗粒神经元（CGNs）钙超载与NMDA受体（NMDAR）及细胞内钙库受体三磷酸肌醇受体（IRR）和兰尼定受体（RyR）之间的关系。方法取出生后8dSD大鼠小脑进行颗粒神经元体外培养。用NMDA（100μmol／L）急性损伤神经元,在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）扫描开始前30min,或扫描开始后4,9,14min分别加入NMDAR、IRR、RyR拮抗剂MK．80l、2-APB和DAN,检测神经元内Ca^2＋浓度的动态变化。结果MK-801预孵育神经元经NMDA急性刺激后,神经元内ca2’的荧光强度不再升高,NMDA刺激后加入MK-801,上升的ca^2＋水平立即下降,最终下降至基线水平;NMDA急性刺激2-APB预孵育神经元,神经元内ca^2＋的荧光强度升高,但升高幅度明显低于未经NMDA刺激组,NMDA刺激后加入2-APB,细胞内升高的Ca^2＋水平急剧下降,最终下降至接近基线水平;DAN预孵育的神经元经NMDA急性刺激后,胞内ca^2＋的荧光强度急剧升高,达到NMDA刺激组水平,NMDA刺激后加入DAN,神经元内ca^2＋水平无明显下降。结论NMDA诱导的神经元ca^2＋超载,主要由细胞膜钙通道NMDAR和细胞内钙释放通道IP3R介导,而细胞内钙释放通道RyR不起主导作用．     

氧化槐定碱对氧糖剥夺再灌注损伤后大鼠海马神经元Glu含量及NMDA受体亚单位NR1表达的影响

目的研究氧化槐定碱（OSR）对原代培养新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤后Glu含量与NR1表达的影响。方法以原代培养的新生大鼠海马神经元为研究对象,建立氧糖剥夺再灌注损伤模型。采用化学比色法测定神经细胞培养液中谷氨酸（Glu）的含量,Western blot方法和实时荧光定量PCR技术检测大鼠海马神经细胞NMDA受体NR1亚基蛋白和mRNA的表达。结果与氧糖剥夺再灌注损伤组比较,OSR治疗组（20、5、1.25 mg·L-1）可减少神经细胞培养液中Glu的含量（P〈0.05）;OSR治疗组（20μg·L-1）可明显抑制NMDA受体NR1亚基蛋白和mRNA的表达（P〈0.05）。结论 OSR通过降低Glu含量和减少NR1表达,减轻兴奋性氨基酸毒性,对新生大鼠海马神经元缺氧损伤具有明显的保护作用。     

美金刚保护缺血神经元分子机制的研究

目的 探讨N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体非竞争性抑制剂美金刚（memantine）对脑缺血再灌注（I/R）损伤的影响及其分子机制.方法 制备四动脉结扎（4-VO）大鼠全脑缺血模型.实验分为4组（n=6）：假手术组（sham组）,缺血/再灌注组（I/R组）,美金刚处理组和生理盐水组.在缺血后立刻腹腔注射美金刚或生理盐水.焦油紫染色观察海马CA1区神经元的存活情况,免疫印迹检测大鼠海马中p-ERK1/2的表达.结果 与sham组相比,I/R组神经元死亡增加,p-ERK1/2表达下调;与I/R组相比,美金刚处理组显著降低了神经元的死亡率,同时也明显升高了p-ERK1/2的表达.结论 美金刚抑制了I/R引起的神经元死亡.其机制可能与美金刚抑制突触外NMDA受体的过度激活进而激活ERK通路有关.     

NMDA诱导新生大鼠脑组织NMDA受体-1的表达

目的：了解N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-Aspartate,NMDA）诱导的脑组织内NMDA受体-1（NR1）表达的规律。方法：90只7日龄新生SD大鼠随机分为正常对照组（n=6）、NMDA注射组（包括10nmol NMDA微量注射后0min,15min,30min,1h,2h,4h时间点组,和10nmol,20nmol和50nmol NMDA组,各组n=6）。采用经心脏灌注固定、切片制备脑组织标本及荧光免疫组化染色和三氯四氮唑（2,3,5-triphenyhetrazolium chloride,TFC）染色方法。结果：10nmol NMDA注射后30min．沿注射轨迹边缘开始出现少量NR1阳性染色细胞．注射后1h时NR1阳性细胞亦出现在海马回CA1区和邻近脑室边缘的下丘脑区,且数目迅速增多,并主要集中在注射侧大脑半球,注射后2h及4h该阳性细胞数目与1h无明显差异。NMDA微量注射后2h,50nmol NMDA所致的NR1表达较10nmol和20nmol明显增强,且细胞壁出现皱缩、细胞核稍固缩。各浓度NMDA微量注射后2h．TTC染色均大致正常。结论：NMDA诱导的NR1表达在经过短时间的延迟后呈一定的时效和量效关系,临床上可考虑应用该延迟时段作为“治疗窗”,采用NMDA受体桔抗剂治疗与NMDA受体激活密切相关的中枢神经系统疾病。     

溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜白细胞介素-6受体及白细胞介素-8受体的表达变化

目的探讨溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠黏膜白细胞介素-6（IL-6）受体及白细胞介素-8（IL-8）受体的表达变化。方法将雄性SD大鼠36只完全随机分为正常组、模型1组、模型2组共3组,每组12只。用5％2,4,6-三硝基苯磺酸100mg／kg灌肠建立大鼠溃疡性结肠炎模型,7d后处死模型1组动物,14d后处死模型2组动物。运用Real—Time—PCR法、ELISA法分别检测各组大鼠IL-6受体及IL-8受体mRNA及其含量的表达。结果模型1组、2组IL-6受体mRNA及含量表达分别为（3．35±0．12）pg／ml、（111．35±25．09）pg／ml及（3．56±0．09）pg/ml、（160．11±15．54）pg/ml;模型1组、2组IL-8受体mRNA及含量表达分别为（3．50±0．19）pg／ml、（160．11±15．54）pg／ml及（3．68±0．16）pg／ml、（185．38±15．42）pg／ml,与正常组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论活动性UC在炎症诱导下结肠组织中IL-6受体及IL-8受体mRNA及其含量表达增高,IL-6受体及IL-8受体的水平与肠道炎症程度呈正相关。     

μ型阿片肽受体对癫痫敏感大鼠海马NR2B表达的影响

目的探讨μ型阿片肽受体（MORs）介导大鼠癫痫敏感性形成过程中海马NMDA2B受体（NR2B）表达变化。方法红藻氨酸（KA）皮下注射建立大鼠癫痫发作模型,采用脑立体定位及微渗透泵技术,海马内微量注射MORs激动剂PL017,或和拮抗剂β-FNA。7d后通过阈下剂量KA检测大鼠癫痫发作敏感性,应用原位杂交方法观察海马CA1区锥体细胞及齿状回颗粒细胞NR2B表达变化。结果PL017可显著增加大鼠海马CA1区锥体细胞和齿状回颗粒细胞NR2BmRNA（＋）神经元数及平均灰度。β-FNA则明显降低两个脑区的NR2BmRNA（＋）神经元数及平均灰度。结论MORs介导癫痫发作敏感性形成机制与NR2B表达上调有关。     

三七总皂苷对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体NR1表达的作用

目的:研究三七总皂苷对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体NR1的作用.方法:用免疫组化法观察胶原酶诱导的脑出血大鼠前脑内NR1在给药组和对照组的表达变化.结果:脑出血后大鼠前脑NR1在病灶内部少量表达,病灶周围、大脑皮质、海马等部位均有不同程度的高表达,给药组在皮层、病灶周围阳性细胞明显减少,反应强度减弱.结论:三七总皂苷明显降低NR1在病灶周围、皮层海马神经元的阳性表达,从而发挥对受损神经元的保护作用.     

大豆苷原对成骨细胞MC3T3-E1甾体激素受体辅激活因子1表达的调节作用及其机制

目的：研究大豆苷原对成骨细胞MC3T3－E1甾体激素受体辅激活因子1（steroid receptor coactivator-1,SRC-1）和核受体辅抑制因子（nuclear receptor corepressor,NcoR）表达的调节作用及其机制。方法：体外培养MC3T3-E1细胞于含29／6胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的α最低必须培养基（α—minimal essential medium,α—MEM）中,给予不同浓度大豆苷原或10^-6 mol／L的雌二醇作用3d后收获细胞,采用蛋白质印迹法观察SRC-1和NcoR蛋白的表达水平。分别应用雌激素受体（estrogen receptor,ER）拮抗剂ICI182780（Faslodex,ICI,10^-7 mol／L）和雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）特异性拮抗剂（methyl—piperidino—pyrazole,MPP,10^-6 mol／L）干预,观察大豆苷原对细胞SRC-1和NcoR蛋白表达水平的影响。结果：大豆苷原可上调MC3T3-E1细胞SRC-1的表达,10^-7mol／L和10smol／L大豆苷原组SRC-1的蛋白水平分别增加至对照组的2．5倍（P〈0．05）和2倍（P〈0．05）。各剂量组NcoR表达水平与对照组比较差异无统计学意义。雌二醇组SRC-1水平与对照组比较未见明显变化,而其NcoR表达水平较对照组下调35％（P〈0．05）。ICI182780可拮抗大豆苷原对SRC-1的上调作用。在ICI182780作用下,各剂量组SRC-1蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义;MPP干预下,10^-7mol／L和10^-5 mol／L大豆苷原组SRC-1的蛋白水平分别为对照组的1．8倍（P〈0．05）和2．4倍（P〈0．05）。结论：大豆苷原可增加成骨细胞SRC-1的蛋白表达水平,提高细胞SRC-1／NcoR比值。ER8参与了大豆苷原对SRC-1的调节过程。成骨细胞内SRC-1蛋白的增加和SRC-1／NcoR比值的提高是大豆苷原促进成骨细胞分化的机制之一。     

预缺血抑制脑缺血诱导GluR6巯基亚硝基化机制的研究

目的 观察预缺血对SD雄性大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区锥体细胞的保护作用,并探讨其可能的机制.方法 采用四动脉结扎法构建大鼠预缺血模型和全脑缺血模型,缺血6 min后分别灌注6 h或5天.大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注组、预缺血/再灌注组、预缺血/再灌注溶剂对照组和预缺血/再灌注给药组.预缺血/再灌注给药组腹腔注射5 mg/kg MK801.主要运用SDS-PAGE、免疫印迹和焦油紫染色法等技术检测相关信号蛋白的表达、活化水平及神经元细胞的死亡情况.结果 大鼠缺血/再灌注6 h,预缺血/再灌注组和预缺血/再灌注溶剂对照组的GluR6的巯基亚硝基化水平较缺血/再灌注组明显降低,而预缺血/再灌注给药组较缺血/再灌注组没有明显变化;各组间GluR6的蛋白表达量并没有明显变化.大鼠缺血/再灌注5天后,预缺血/再灌注组和预缺血/再灌注溶剂对照组海马CA1区细胞的存活数量较缺血/再灌注组明显增加,而预缺血/再灌注给药组较缺血/再灌注组没有明显变化.结论 预缺血通过NMDA受体下调大鼠全脑缺血/再灌注诱导的KA受体亚基GluR6的巯基亚硝基化,从而发挥拮抗缺血性脑损伤的作用.     

大鼠妊娠前后吸入七氟烷对仔鼠海马NMDA受体表达的影响

目的：观察大鼠妊娠前后吸入七氟烷对仔鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-asparate receptor,NMDAR）的影响。方法：雌性SD大鼠18只,3月龄,体重250～300g,采用随机数字表法,将其随机分为3组（n=6）：对照组（C组）、妊娠前吸入2．4％七氟烷6h组（BS组）和妊娠后6、10、14和18d吸入2．4％七氟烷6h组（PS组）。于出生当天（T_1）、出生后第7（T_2）、14（T3）和28天（T_4）时各组按窝别随机取12只仔鼠处死取海马,采用免疫荧光和RT-PCR法检测NMDAR（NR1、NR2A和NR2B）的表达水平。结果：与C组相比,BS组仔鼠海马NMDAR表达差异无显著性（P〉0．05）;PS组仔鼠T_1-T_3时NRl和NR2A的表达明显增强（P〈0．01）,NR2B表达显著降低（P〈0．01）;NR1 mRNA知NR2A mRNA表达增强（P〈0．05）,NR2B mRNA表达降低（P〈0．05）,T-4时NMDAR表达差异无显著性。结论：妊娠前吸入2．4％七氟烷6h对仔鼠海马NMDAR表达无影响,大鼠妊娠后特定时间内吸入2．4％七氟烷6h可引起仔鼠海马NMDAR表达短期内异常,这可能会引起仔鼠海马神经细胞凋亡和神经系统发育及认知功能的短期异常。     

消痰散结方对小鼠胃移植瘤及瘤旁胃组织中白细胞介素8及其受体表达的影响

目的：观察消痰散结方对小鼠胃移植瘤和瘤旁胃组织中自细胞介素8（interleukin-8,IL-8）及其受体趋化因子受体1（chemokine receptor 1,CXCR1）和趋化因子受体2（chemokine receptor2,CXCR2）表达的调节作用,探讨消痰散结方抑瘤、防复发的部分作用机制。方法：50只昆明小鼠随机分为正常组、生理盐水组、清热解毒方组、喃氟啶组和消痰散结方组。除正常组外,其余各组通过移植S180瘤块,建立小鼠胃移植瘤模型。予相应药物灌胃治疗3周后,剥取肿瘤,称取瘤质量,计算抑瘤率;运用酶联免疫吸附测定法检测肿瘤及瘤旁胃组织中IL-8的蛋白表达;免疫组织化学法检测CXCR1、CXCR2蛋白表达。结果：肿瘤及瘤旁胃组织中IL--8及其受体CXCR1和CXCR2蛋白表达较正常小鼠胃组织明显升高（P〈0．01）;消痰散结方下调肿瘤及瘤旁组织中IL-8蛋白表达的作用优于对照药清热解毒方和喃氟啶（P〈0．05）;消痰散结方下调肿瘤中CXCR1蛋白表达的作用优于喃氟啶（P〈0．01）,对瘤旁胃组织中CXCR1蛋白表达的作用优于喃氟啶及清热解毒方（P〈0．01）;消痰散结方下调肿瘤中CXCR2蛋白表达的作用优于喃氟啶及清热解毒方（P〈0．01）,而3种药物对瘤旁胃组织中CXCR2蛋白表达的调节作用差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：消痰散结方可明显下调胃肿瘤及瘤旁胃组织中IL-8及其受体的蛋白表达,是其抑瘤、防复发的可能机制之一。