三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力

背景：关节软骨损伤后修复结果不满意,需要新的手段,而脂肪间充质干细胞较适宜做种子细胞诱导软骨,然而怎么能够使诱导的软骨具有功能需要研究。 目的：采用三维培养体系诱导人脂肪间充质干细胞微球向软骨分化。 方法：无菌切取吸脂术后脂肪组织,分离培养人脂肪间充质干细胞,传至第3代进行流式细胞术分析,成骨成脂肪诱导等鉴定,同时也给予合适的培养条件用三维培养的方式向软骨细胞诱导,并行阿利辛蓝染色鉴定糖胺多糖的合成,苏木精-伊红染色进行组织学分析,免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达,称质量测量软骨硬度。 结果与结论：分离的人脂肪间充质干细胞CD105,CD44,CD29均高表达,而 CD45,CD34低表达,并且成骨成脂诱导后细胞茜素红染色和油红O染色均为阳性。三维培养法诱导的软骨细胞可表达大量糖胺多糖及Ⅱ型胶原。结果证实,三维培养法诱导人脂肪间充质细胞向软骨分化后,具有软骨细胞的特性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

生长分化因子5诱导脂肪干细胞向软骨细胞的转化

BACKGROUND: Growth differentiation factor 5 (GDF5) has been shown to play a crucial role in the development of chondrocytes via different regulatory mechanisms. OBJECTIVE: To explore the effect of GDF5 on the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ADSCs). METHODS: ADSCs in passage 4 isolated from Japanese White rabbits were cultured in the medium containing 0 (blank control group), 10, 50, 100, 150 and 200 μg/L, respectively. The morphological changes were observed, and the optimal concentration of GDF-5 was screened, and its round coverslips at 1, 2 and 3 weeks of culture were selected to undergo immunocytochemistry, toluidine blue staining and immunofluorescent staining. RESULTS AND CONCLUSION: The growth of ADSCs was stable in the medium containing 10 and 50 μg/L GDF5, while apoptotic cells appeared after induction with 200 μg/L GDF5. In the medium containing 100 and 150 μg/L GDF5, some spindle-shaped cells changed into irregular shape, and became round or oval after 7-10 days of culture. The optimal concentration of GDF5 was 100 μg/L. The cells transfected by 100 μg/L GDF5 were positive for type II collagen obviously and with blue-stained nucleus. The transfected cells were positive for toluidine blue, and metachromatic granules were visible in the cytoplasm. The proteoglycan mRNA expression of the transfected cells was significantly increased, and reached the highest at 3 weeks. These results suggest that GDF5 promotes the chondrocytic differentiation of ADSCs. 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

人脂肪干细胞的提取和鉴定

背景：脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞,具备自我更新能力与多向分化潜能,遗传背景相当稳定,体内植入后免疫排斥少,是一种比较理想的种子细胞。目的：提取人大网膜脂肪干细胞,并进行成脂和成骨分化能力鉴定。方法：收集手术患者大网膜的脂肪组织,经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心后进行原代培养,观察细胞生长状态;用细胞计数法绘制人脂肪干细胞增殖曲线,计算处于对数生长期的倍增时间;用相应的定向诱导液诱导人脂肪干细胞向脂肪细胞及骨细胞方向分化,并用油红O染色、茜素红染色进行鉴定。结果与结论：从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离人脂肪干细胞,贴壁生长的人脂肪干细胞为长梭形,形态类似成纤维细胞。第3代人脂肪干细胞生长曲线呈S形,对数生长期人脂肪干细胞的倍增时间为45.90 h。人脂肪干细胞经成脂、成骨定向诱导分化2,3周后,油红O染色显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴,茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节,提示所培养的脂肪干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞系分化的能力。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

脂肪干细胞诱导分化的现状及前景

背景：脂肪干细胞是由中胚层发育而来的多能干细胞,在特殊的生长因子和环境等诱导培养条件下,可以向不同的谱系分化。 目的：详细阐述脂肪干细胞诱导分化的条件及鉴定方法。 方法：应用计算机检索万方数据库及PubMed数据库2005至2014年10年间的文献,中文检索词为“脂肪干细胞,诱导,分化”;英文检索词为“adipose derived stem cells,differentiation”。依据纳入排除标准选择37篇文献进行归纳总结。 结果与结论：脂肪干细胞在抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子β作用下可向软骨细胞分化;成脂诱导液的配方包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛;成骨分化常用的诱导剂包含地塞米松或维生素D3、抗坏血酸,β-甘油磷酸钠;碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及维生素B27可联合应用诱导脂肪干细胞成神经分化;向心肌细胞分化普遍应用的诱导因子是5-氮杂胞苷;血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共同作用可以诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化。随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展,脂肪干细胞的分化研究也会更加深入,在目前对脂肪干细胞诱导分化现象观察的基础上,应加强对其内在的分子机制及调控脂肪干细胞可塑性的基因和蛋白的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化研究进展

胚胎干细胞因其具有体外无限增殖能力和体内外分化发育的全能性,有望为细胞治疗或组织工程化组织构建提供可靠的种子细胞来源.如何诱导胚胎干细胞向目的细胞分化是目前面临的一大难题.首先回顾软骨细胞的体内发生、发育过程,继而对目前已知的能在体外培养环境中影响胚胎干细胞向软骨细胞分化的各类因素进行分析综述,并探讨进一步的研究方向.     

胚胎干细胞向成骨、软骨细胞定向分化研究进展

骨、软骨组织工程的热点之一是寻找合适的种子细胞.胚胎干细胞因具有全能性和无限增殖的能力有望成为组织工程中的种子细胞新来源.主要介绍了胚胎干细胞定向诱导分化为成骨、软骨细胞研究所取得的进展,并展望了胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的前景和所面临的困难.     

miR-302对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控

背景：间充质干细胞具有自我更新能力,在一定条件下能够分化为一定谱系的细胞,但很多机制至今未明。 目的：探究miR-302b对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控作用。 方法：miR-302模拟物转染作用于脂肪间充质干细胞进行成骨成脂诱导,对照组转染miR-302阴性对照模拟物miR-NC。采用碱性磷酸酶染色及活性分析、茜素红染色、油红O染色和萃取实验观察miR-302上调对脂肪间充质干细胞成骨和成脂分化的影响,以及Western blot检测miR-302上调后成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在脂肪间充质干细胞中的表达。 结果与结论：①碱性磷酸酶沉淀物在miR-302过表达细胞中产生的量均明显少于对照组,进一步发现miR-302过表达实验组碱性磷酸酶活性明显低于对照组(P < 0.05)。②miR-302过表达明显抑制了矿物质沉积钙结节的形成,miR-302上调实验组橘红色的钙结节明显少于对照组。③miR-302过表达实验组油红O染色阳性的细胞数明显高于对照组,进一步表明实验组细胞萃取得到的油红O吸光度值明显上升(P < 0.05)。④成骨诱导第6天时成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在miR-302过表达的细胞中都有不同程度的下降。⑤以上结果表明miR-302的上调能够抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化,同时促进其向成脂分化。miR-302在间充质干细胞向成脂和成骨分化平衡发挥了双向调控作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

脂肪干细胞在软骨组织工程中的应用

软骨是最早应用组织工程技术成功构建的组织之一,但由于缺乏合适的软骨构建种子细胞,因此其发展相对落后。随着干细胞研究的兴起,脂肪干细胞（ASC）因其具有分布广泛、可利用细胞量大、取材容易等优点,为ASC作为种子细胞应用于组织工程研究提供了可能;但是ASC构建软骨组织的效果却不如骨髓间充质干细胞（BMSC）理想。因此ASC在软骨组织工程中的应用仍面临着诸多问题与挑战,其中最核心的问题是如何提高ASC成软骨的效率。为此从如何纯化脂肪来源细胞、尽可能保持其中干细胞的生物学特性并优化软骨诱导方案3个方面予以综述,为提高ASC成软骨的效率提供参考。     

胚胎干细胞和间充质干细胞分化为内皮细胞的研究现状

内皮细胞对于维持血管正常功能具有重要作用,然而其来源有限.因此,寻找内皮细胞的其他丰富来源一直为研究者们所关注.干细胞在体外培养具有能大量增殖、并在合适的条件下定向分化的特性.近年来,各种类型的干细胞诱导分化为内皮细胞的研究不断深入并各有优缺点.对胚胎干细胞和各种来源的间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的研究现状作一综述.     

ADSC源性神经干细胞向神经元和星形胶质细胞不同方向分化时的超微结构变化研究

目的: 观察成人脂肪基质细胞(ADSC)源性神经干细胞在体外向神经元和星形胶质细胞分化过程中的细胞超微结构变化。方法: 体外培养、扩增ADSC,分别采用β-巯基乙醇和以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)为主要成分的诱导剂对ADSC进行诱导分化。应用免疫荧光化学染色法对2种诱导剂诱导后的细胞进行神经巢蛋白(nestin)的鉴定及诱导率分析,透射电子显微镜观察不同方法诱导出的神经干细胞的超微结构特征。结果: 体外培养的成人ADSC在β-巯基乙醇的诱导作用下3 h nestin的表达达高峰,以IBMX为主要成分的诱导剂诱导的细胞14 d达高峰,且前者的峰值(86%)显著高于后者(23%),但以IBMX为主要成分的诱导剂诱导的细胞nestin表达持续时间明显长于β-巯基乙醇组。透射电镜下观察不同诱导剂诱导的神经干细胞超微结构,发现细胞的大体形态相似,但细胞器有差异。结论: β-巯基乙醇或以IBMX为主要成分的不同诱导剂在使成人ADSC向星形胶质细胞或神经元等不同方向分化时,可使ADSC源性神经干细胞胞浆中细胞器发生不同的超微结构变化,而细胞核的超微结构变化不明显。     

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景：人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。 目的：体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。 方法：取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。 结果与结论：体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24 h内贴壁,培养5~7 d 后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G₀/G₁,S和G₂/M所占比例分别为(88±2)%,(12±2)%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。     

骨髓基质干细胞和软骨组织工程

关节软骨是透明软骨 ,它是一种特殊的结缔组织 ,由单一的软骨细胞、纤维和基质构成。软骨组织具有自身独特的生理学特点 ,无血管 ,无神经 ,无淋巴引流 ,在关节腔内仅靠滑液来获取营养 ,其代谢主要以无氧酵解为主等决定了它极其有限的再生能力。临床上由于创伤、炎症肿瘤等原因导致的关节软骨损伤、缺失极为常见 ,且常继发骨关节炎 ,严重影响关节的功能。目前临床上多通过自体或异体移植成形的软骨或具有成软骨潜能的组织如骨膜、软骨膜等来治疗关节软骨的缺损 ,这些组织移植后能生成透明软骨样组织 ,但其生物学性能、耐磨性、韧性均欠佳 ,易…     

成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。 目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法,并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。 方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶,骨桥蛋白表达变化。 结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞,且能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达;成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态;碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色后可见钙结节形成,成骨诱导培养0,3,7,14,21,28 d,RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞;脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化,阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶,是一种优良的骨组织工程的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化

背景：脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点,通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得,但是存在着操作繁琐,花费高等不足。 目的：观察组织块培养法分离的脂肪源性干细胞的基本生物学特性及其向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞的诱导分化潜能。 方法：无菌条件下切取大鼠双侧腹股沟脂肪组织,组织块法分离培养脂肪源性干细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪分析干细胞表面标志表达。取第4代脂肪源性干细胞用成骨诱导液、成脂诱导液、内皮祖细胞诱导液培养两三周并进行鉴定。 结果与结论：组织块培养法得到的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞生长为主,呈漩涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈抛物线形;细胞表面标志CD44、CD90、CD29呈阳性表达,CD45、CD31呈阴性表达。成脂诱导后细胞油红O染色阳性、成骨诱导后细胞茜素红染色阳性。诱导后的内皮祖细胞CD34及DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性。以上结果显示组织块培养法能成功分离培养出脂肪源性干细胞,且获得的细胞纯度较高、易于增殖培养,能高表达干细胞表面抗原以及具有向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞多向分化的潜能,可以满足组织工程研究种子细胞的需求。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓基质干细胞体外诱导成软骨的研究进展

骨髓基质干细胞具有强大的体外扩增能力和多向分化潜能,在不同诱导因素诱导下可以分化为软骨细胞,已成为软骨组织工程理想种子细胞的研究热点。近十几年对于如何诱导骨髓基质干细胞成软骨已有不少研究,如诱导因子诱导、基因修饰诱导及与软骨细胞共培养诱导等,都可以将骨髓基质干细胞成功诱导为软骨细胞。就骨髓基质干细胞体外定向诱导成软骨的方法进行综述对其研究进展作一回顾.     

骨髓间充质干细胞复合多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损

背景：多肽水凝胶因为其具有良好的可塑型性,能够与损伤部位很好的无缝隙结合,所以采用该材料作为支架是骨、软骨组织工程中一种可行的探索。 目的：骨髓间充质干细胞联合新型可注射多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损,观察其修复效果。 方法：首先分离培养兔骨髓间充质干细胞,兔左侧膝关节处制备直径5 mm,深3 mm的全层骨-软骨缺损模型;右侧造模后空置作为对照。实验分为3组,单纯自组装多肽凝胶移植组,自组装多肽凝胶+成软骨因子组和自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组。采用的成软骨因子包括转化生长因子β1,地塞米松和胰岛素样生长因子1,三者混合后加入到自组装多肽凝胶或骨髓间充质干细胞中。于处理后12周时处死动物行大体及组织学观察、X射线摄片、免疫组织化学法进行组织学评分评估修复情况。 结果与结论：单纯自组装多肽凝胶移植在12周后显示出非常好的修复效果,可见番红O染色,Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色强度以及组织学评分明显高于其他组(P < 0.05)。自组装多肽凝胶+成软骨因子组修复效果较好,与自组装多肽凝胶组相似,但其修复区域蛋白聚糖表达比对照组明显升高(P < 0.01)。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组修复效果不佳,12周未能完全修复缺损区域,与单纯自组装多肽凝胶组比较骨赘的形成有所增加。结果表明,单纯自组装多肽凝胶能够在原位修复骨软骨缺损并促进软骨修复,提示以自组装多肽凝胶支架移植有望提高目前修复软骨缺损的效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

miR-155有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化

背景：近年发现,miRNA是能够对基因表达产生影响的一种新型调控子,miRNA有助于多能干细胞分化增殖以及自我更新。 目的：探讨miR-155对大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的调控机制。 方法：12周龄健康SD大鼠60只,随机分为研究组与对照组,每组30只。于麻醉状态下将大鼠处死,获取下肢骨髓,进行骨髓间充质干细胞分离、培养,研究组给予miR-155基因模拟物转染,对照组给予阴性对照序列转染,经成软骨诱导分化后进行RT-PCR检测Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan、Collagen X基因的表达,Western blot检测Sox9、Runx2蛋白的表达。 结果与结论：研究组Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因表达高于对照组,Collagen X基因表达低于对照组,差异均有显著性意义(P < 0.05)。研究组Sox9蛋白表达高于对照组,Runx2蛋白表达低于对照组,差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果表明miR-155不仅有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化,而且可以抑制骨髓间充质干细胞成软骨分化呈肥大趋势发展。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

背景：前期实验中发现生长分化因子5可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,但在复合Ⅰ型胶原支架的体外培养条件下其向软骨细胞分化的能力尚未见研究报道。 目的：探讨生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架向软骨细胞分化的能力。 方法：从兔脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,使用免疫荧光对其表型进行鉴定。在复合Ⅰ型胶原支架条件下,加入外源性生长分化因子5对脂肪干细胞向软骨细胞进行诱导,在诱导14 d时,采用苏木精-伊红染色和扫描电镜对诱导的细胞进行形态学观察。在诱导7,14和21 d时,采用反转录PCR方法检测诱导的细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达情况。 结果与结论：原代脂肪干细胞贴壁生长,呈梭形、多角形分布,细胞表面抗原CD44、CD49d 阳性,CD106 阴性。生长分化因子5诱导的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架黏附良好,增殖能力旺盛,细胞表面存在着大量的细胞外基质分泌,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平明显增加。说明生长分化因子5能够成功诱导复合Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞成软骨细胞分化。