两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒

目的 建立一种灵敏、特异的RT－PCR 方法检测环境中的HAV。方法 对两种RT－PCR，即常规两步法RT－PCR和一步法RT－PCR检测HAV的效果进行了观察，并采用半套式PCR对扩增产物的特民划性进行验证。结果两种RT－PCR与半套式PCR检测HAV均得到预期条带，所设计的引物对其它的肠道病毒扩增呈阴性；在同等反应条件下，一步RT －PCR的反应效率远高于常规RT－PCR，二者的检测灵敏度也有显著性差异，一步RT－PCR的检测灵敏 度为10TCID50／ml，两步法RT－PCR检测灵敏度为10^3TCID50/ml.结论 一步RT -PCR较常规RT-PCR易于操作,重复性好,不易污染,具有更高的反应效率和灵敏度.     

一步单管反转录PCR快速检测水中甲型肝炎病毒

本研究采用一种新的方法提取核酸，提取的病毒ＲＮＡ纯度高，增加了结果的稳定性；而且操作简单，整个过程只需要１０ｍｉｎ。反转录（ＲＴ）与聚合酶链式反应（ＰＣＲ）在一个反应管中一步操作即可完成，减少了污染机会，提高了反应敏感性和特异性。关键词：聚合酶链式反...     

四种食源性病毒多重反转录-聚合酶链反应检测研究

目的 建立同时检测诺如病毒、轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒多重RT-PCR检测方法.方法 以四种食源性病毒的高度保守区为靶序列设计特异引物,优化反应体系和条件,确定多重RT-PCR检测四种病毒的特异性和灵敏度,并初步应用于临床样本中四种病毒的同时检测.结果 在灵敏度试验中得到的轮状病毒、诺如病毒和星状病毒稳定的最高检测限均为50 pg/ml,甲肝病毒为100 pg/ml.在128份临床粪便样本中,其中轮状病毒阳性62份(48.44%),诺如病毒阳性8份(6.25%),星状病毒阳性11份(8.59%),甲肝病毒阳性4份(3.12%).结论 研究所建立的多重RT-PCR方法,在实际应用中能同时处理大量的样本,提高PCR检测方法的能力,可以应用于临床病例的诊断和流行病学调查等研究.     

聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒的初步研究

应用美国Ａｂｂｏｔｔ公司Ｓｉｍｏｎｓ等人报道的引物序列，以逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）检测３８例甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）指标均阴性的慢性肝炎患者血中的庚型肝炎病毒核酸（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ）。２０例健康供血员血清作为对照，同时用ＲＴ－ＰＣＲ法测丙型肝炎病毒核酸（ＨＣＶＲＮＡ），结果３８例慢性肝炎患者中４例ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ阳性，其中２例同时有ＨＣＶＲＮＡ阳性。表明本地区有ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染存在。     

聚合酶链反应直接检测粪便中脊髓灰质炎病毒RNA的研究

用聚合酶链反应技术检测１９分急性弛缓性麻痹患者的粪便中脊髓灰质炎病毒，其中１１份阳性，与中和试验鉴定及单克隆抗体鉴定结果符合率为９０．９０％￣１００％。该法不仅简便，敏感，特异分型，而且可作型内鉴别，为环境样品中脊灰病毒污染提供了检测手术。     

用多聚酶链反应检测环境样品中甲型肝炎病毒RNA的实验研究

采用直接逆转录一多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对加标海水、海泥、毛蚶的浓缩样品，用不同消毒方法处理过的甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）及毛蚶实测样品进行了ＨＡＶ－ＲＮＡ分析。结果表明，该方法可检出加标海水、海泥及毛蚶中的ＨＡＶ－ＲＮＡ；对苯酚消毒灭活的ＨＡＶ检验结果表明含有完整核酸序列的灭活病毒也能用ＲＴ－ＰＣＲ方法检出；毛蚶实测样品结果表明，只有１９８８年上海毛蚶ＲＴ－ＰＣＲ阳性，但细胞培养间接免疫荧光法检测结果为阴性，说明毛蚶冻存太久（≥５年），ＨＡＶ已不具感染性。直接ＲＴ－ＰＣＲ方法简便敏感，不需超速离心及其它特殊设备，在普通实验室也能使用。     

贝类及其产品中甲型肝炎病毒RT-PCR检测方法的研究

目的建立一种快速、简便、灵敏的检测贝类中甲型肝炎病毒RT-PCR方法,能够有效防止甲肝病毒的传播和对口岸进口贝类产品的监控。方法通过对病毒富集的3种方法(大体系PEG8000、小体系PEG6000和小体系PEG8000富集法)、提取RNA的2种方法(Trizol法和试剂盒法)以及RT-PCR检测的2种方法(一步法和两步法)进行比较,确立一种快速检测贝类中甲肝病毒的RT-PCR方法。结果经比较,采用小体系肠道样本检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了小体系PEG8000与PEG6000和大体系PEG8000对病毒富集的效果,回收率分别为13.3%、7.5%、10.0%;对HAV总RNA的2种提取方法进行了比较,结果均获得了纯度较高、完整性较好的总RNA,以此为模板采用一步法和两步法进行反转录和PCR反应,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,从人工污染的阳性样本中扩增得到一段长度为192bp的特异PCR扩增产物。应用本研究建立的RT-PCR方法对大连地区85份贝类及产品进行HAV检测,结果未显阳性,说明样本中不含HAV。整体用时仅为5h。结论本研究建立的检测HAV的RT-PCR方法灵敏特异、操作时间短,该方法可对贝类及其产品进行确实有效的HAV的检测。     

轮状病毒星状病毒和甲型肝炎病毒的单管多重荧光定量RT-PCR检测方法研究

目的建立能同时检测星状病毒、轮状病毒和甲型肝炎病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法。方法根据Gen Bank上下载的上述3种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重荧光RT-PCR的重复性、特异性和敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的多重荧光RT-PCR检测方法对轮状病毒、星状病毒和甲型肝炎病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒灵敏度达到101拷贝,星状病毒和甲型肝炎病毒灵敏度达到102拷贝。128份粪便标本中,轮状病毒和星状病毒的检出率分别为17.97%和3.13%,甲型肝炎病毒未检出。与基因测序比对结果相符。结论用于轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.     

套式反转录-聚合酶链反应检测革螨体内肾综合征出血热病毒的初步研究

用HTN病毒姬鼠型M基因型特异性引物,异硫氰酸胍一步法提取RNA,nested RT-PCR检测鼠肺和厩真厉螨体内76-118株病毒RNA,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和点印迹杂交证实.结果表明,姬鼠型76-118株病毒液和叮刺感染病毒乳鼠后第10天厩真厉螨组织悬液接种乳鼠第9天鼠肺、叮剌后第10天和30天螨,均检出病毒RNA.30只螨样本提取RNA也能扩增出病毒RNA.家鼠型UR株感染样本不能被扩增.该方法具有较高特异性和敏感性,操作简单,结合原位分子杂交,可用于螨媒传播HFRSV的研究.     

焦磷酸测序与PCR产物直接测序在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性比较

目的 通过与PCR产物直接测序比较,评价焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的应用价值.方法 选取临床使用拉米夫定抗病毒治疗慢性乙型肝炎患者,分别采用巢式PCR焦磷酸测序法与巢式PCR产物直接测序法检测拉米夫定相关耐药位点rtl80变异情况,比较两种方法的敏感性与特异性.结果 焦磷酸测序与PCR产物直接测序均能准确的检测出优势病毒株(占总群＞90％),焦磷酸测序中rt180M所占比例在90％～50％时,PCR产物直接测序法检出率下降至76.92％及50.00％;焦磷酸测序样本中rtl80M所占比例为50％～10％,PCR产物直接测序法对耐药基因的检出率降至15.38％～10.00％;准种(占总群＜10％)焦磷酸测序可以测出,但PCR产物直接测序法无法检测出.结论 焦磷酸测序的方法监测乙型肝炎病毒变异同PCR产物直接测序法相比,有更好的灵敏性,在抗病毒治疗过程中能够检测HBV准种及种群漂移,对于研究抗病毒疗效及耐药预测具有重要意义.     

水产制品加工生产的危害分析与关键控制点的应用探讨

目的　探讨HACCP体系在水产制品加工生产过程中的应用效果。方法　选择一家鱼肉水产制品加工企业 ,参照卫生部食品企业HACCP实施指南 ,对其生产加工过程的危害因素进行分析 ,提出预防控制措施。结果　最终确定配料中食品添加剂称量、蒸煮杀菌、探测金属碎屑三个环节为关键控制点。针对关键控制点提出相关干预措施为生产中严格控制添加剂使用量 ,彻底加热食品 ,剔除含金属碎屑 >1 2mm的食品。结论　严格控制添加剂使用量、彻底加热及剔除金属碎屑是水产制品加工生产中的关键控制措施     

实时荧光PCR法检测乙型肝炎病毒基因型

目的:建立实时荧光PCR法检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型。方法:根据乙肝病毒基因序列选取保守区域设计引物,结合不同基因型的差异设计各型的特异荧光探针检测乙型肝炎基因B、C型。结果:200例HBV感染者中基因B型70例占35%,基因C型120例占60%,基因B,C混合型10例占5%,未捡出基因型A、D、E、F,分别取B、C型基因标本10例进行测序结果一致。结论:实时荧光PCR检测乙型肝炎基因型操作简单、快速、适合临床常规检测。     

免疫捕获-核酸扩增-微孔杂交检测贝类中甲型肝炎病毒的方法研究

目的：建立贝类中甲型肝炎病毒新的检测方法。方法：先用IgG抗体吸附标本中的HAV，然后将HAV中的RNA逆转录成cDNA，用PCR方法扩增。PCR产物与标记特异基因探针孔中分子杂交，最后加入与标记物对应的酶配体，酶联免疫检测。结果：采用的两对引物和探针均可用于检测。仅加入HAV的可测出阳性，其余病毒测不出。寡核苷酸探针3．75nmol／L、7．5nmol／L、15nmol／L比较理想，杂交时间为120min，显色30min最佳。免疫捕获-核酸扩增-微孔杂交方法比原方法提高25倍以上。推测方法的检测限达到8pfu/g贝组织。结论：免疫捕获-核酸扩增-微孔杂交方法灵敏度高、特异性强，且可以定量。     

水产品中霍乱弧菌的监测方法研究

目的:研究水产品中霍乱弧菌的监测方法,及时发现被霍乱弧菌污染的水产品,采取有效防控措施,防范霍乱疫情的发生。方法:用实时荧光PCR法、胶体金法、分离培养法三种方法分别对180份水产品进行霍乱弧菌检测,阳性样品再进行霍乱肠毒素检测。结果:三种方法检出了44份核酸阳性标本,18份霍乱肠毒素阳性标本,分离出8株霍乱弧菌。结论:在进行水产品霍乱监测时,可以先用实时荧光PCR进行初筛,筛出核酸阳性标本,进行霍乱肠毒素检测,及时发现被霍乱产毒株污染的水产品,再对筛出的核酸阳性标本结合胶体金法进行分离培养和分型鉴定,进一步完成霍乱疫情的确证和分析。     

丁型肝炎病毒感染标志物在乙型肝炎病毒感染者中的检测研究

目的 通过检测和分析乙型肝炎病毒(HBV)感染者中丁型肝炎病毒(HDV)感染标志物的分布状况及HBV感染相关指标关联性分析,阐述HDV感染标志物的检测在HBV-HDV重叠感染患者中的临床意义.方法 收集HBV感染者的一般资料和血样,通过酶联免疫分析法检测五项血清HBV感染免疫学标志物指标、HDVAg和Anti-HDV,结合临床诊断和生化指标进行分析,探讨指标间相关性.结果 收集确诊HBV感染者样本346例,其中乙型肝炎病毒携带者62例占17.9％,急性乙型肝炎8例占2.3％,慢性乙型肝炎147例占42.5％,慢性重型乙型肝炎4例占1.2％,乙型肝炎后肝硬化125例占36.1％;检出总体HDV感染率为4.6％,男性显著高于女性,慢性重型乙型肝炎的HDV感染率最高,为25.0％,HDV感染者肝损伤发生率较高.结论 重症肝病病例的HDV感染显著增高,提示HDV感染与肝病的严重程度相关,建议对肝病患者开展血清HDV感染标志物检查,鉴别是否存在HDV重叠感染.     

荧光定量PCR检测戊肝病毒的应用价值探究

摘要:目的　探讨荧光定量PCR检测HEV RNA的应用价值。方法　从110535份血清标本中,随机抽取标本200份,分别进行ELISA检验和荧光定量PCR分析。结果　69例ELISA阳性的标本经荧光定量PCR检测均为阳性,31例ELISA可疑的标本经荧光PCR检测也均为阳性,100例ELISA阴性的标本中有2例经荧光定量PCR检测结果为阳性。经Kappa检验,Kappa值为0.72,可认为2种方法检测结果具有中度一致性。采用Stuart-Maxwell检验,结果显示PCR与ELISA检出3种情况的边际概率不相等（χ2＝33,P＝0.00,P＜0.05）,提示2种方法检测结果存在差异,即荧光PCR的阳性检出率更高。结论　荧光定量PCR检测HEV RNA能客观地反映HEV感染、复制及病程变化,修正或补充对ELISA测定结果的判定和解释,有利于HEV感染的早期诊断。     

水产品中沙门氏菌的检测和确证

目的 在进口水产品中沙门氏菌检测中应用多种方法互相验证,以提高检测准确性。方法 对进口水产品沙门氏菌检验时,按国家标准GB／T4789、2—2003进行常规检测的同时,结合了生物梅里埃公司的miniVIDAS仪器法和API20E鉴定系统。结果检出1批鼠伤寒沙门氏菌阳性水产品。三种方法的结果相同。结论 日常检验中传统方法可与仪器法以及快速生化鉴定法结合运用,互为补充可以提高检测准确性及检测效率。     

Prevalence of hepatitis virus infections in Albanian refugees

A sample of 393 Albanian refugees, including both children and adults, was tested for serological HAV, HBV, HDV and HCV markers. A high prevalence of infection with both the hepatitis A and B viruses was found, while HDV and HCV infections were uncommon. The overall prevalence of anti-HAV was 96%; it was very high in children 0-10 years, suggesting that HAV infection is largely acquired during childhood and that poor ambiental conditions influence the spreading of this viral infection.One or more serological markers of HBV infection were found in 295 Albanians (75%), confirming the endemic nature of this virus in the Albanian community. The overall prevalence of HBsAg was 19%, and the carrier rate was higher in males than in females. The high HBsAg prevalence among children suggests that HBV infection is usually acquired in early childhood.The serological data obtained in the Albanian sample examined clearly indicate the urgent need for measures to reduce the incidence of HAV and HBV infections and to avoid the further spread of HDV and HCV infections.Finally, the high prevalence of type B hepatitis indicates the necessity of vaccination against HBV for all risk groups and for all children at birth.