两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的　对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特征。方法　利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果　B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt( 4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 10 0 2nt( 4 13bp)碱基序列存在 7个位点的差异 ,编码氨基酸有 2个位置的改变 ;B株与NGC株和DEN 2 4 4株E区部分片段核苷酸同源性分别为99 .1%和 98.7% ;与NS1区部分片段核苷酸同源性分别为 98.3%和 98.1%。B株E基因、NS1基因序列已登录GenBank ,注册号分别为AY179733和AY2 384 71。结论　B株E、NS1基因序列和氨基酸序列与NGC株存在差异 ;B株与我国海南 1989年流行的DEN 2 4 4株和NGC株系统进化关系较近。     

我国登革2型病毒43株非结构蛋白NS1基因的特征

对我国１９８７年从广西分离的登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因的核苷酸序列进行了分析，结果表明登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因含有１０５６核苷酸编码３５２个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与我国１９８５年海南流行高峰期分离的Ｄ２－０４株、国际参考株新几内亚Ｃ株（ＮＧＣ）、牙买加株（ＪＡＭ）、候选疫苗株（Ｓ１）和马来西亚流行株Ｍ１（登革出血热）、Ｍ２（登革休克综合征）、Ｍ３（登革热）进行比较，发现核苷酸序列的同源性分别为９２．２％，９３．７％，９３．３％，９０．７％，８９．９％，８９．５％，８９．３％，氨基酸的类似性分别为８９．８％，９２．６％，９３．３％，９１．２％，９０．６％，９０．１％，８９；９％，推断的氨基酸序列含有两个糖基化位点，分别位于氨基酸残基的１３０和２０７位，一个可能的蛋白裂解位点３５０～３５２和１０个保守的半胱氨酸残基。     

登革2型病毒43株NS1基因重组质粒DNA的免疫原性及保护作用研究

目的 研究以pcDNA3.1为载体的登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因重组DNA的免疫原性及对登革病毒感染所致小鼠神经毒的免疫保护作用。方法 将纯化的pcDNA-NS1重组质粒DNA采用肌肉多点注射途径免疫3周龄BALB／c小鼠，剂量为每只100μg/次，检测了免疫鼠血清抗体滴度及特异性细胞毒作用。并以D2－43病毒脑内攻击6周龄BALB/c小鼠产生的神经毒症状为实验模型，对pcDNA-NS1的免疫保护作用进行了初步探讨。结果 用间接ELISA测得pcDNA-NS1免疫后抗体滴度为1：800，在补体存在下，对D2－43病毒感染的BHK－21细胞特异性杀伤率可达到61．6％。由免疫的BALB／c小鼠脾制备的效应细胞在体外可特异性地杀伤D2－43感染的P－815细胞（H－2^d)。当效靶比（E／T）为20：1时，pcDNA-NS1质粒免疫后的特异性CTL杀伤百分率为22．6％。将100 LD50的D2－43病毒经脑内攻击BALB／c小鼠，结果表明免疫pcDNA-NS1组小鼠存活率最高（90．9％）；与免疫pcDNA3.1对照组比较，P值＜0．05。结论 pcDNA-NS1质粒免疫BALB／c小鼠不仅可诱导体液免疫，还可诱导特异性细胞免疫。初步结果还显示，用含NS1基因的重组质粒DNA免疫的小鼠能免受致死剂量登革病毒的攻击，为登革热新型疫苗的研究奠定了基础。     

广州4株登革1型病毒E基因的全序列测定和分子进化分析

目的 通过对广州市不同年份分离的4株登革1型病毒(DEN-1)蛋白E基因进行全序列测定及分子进化分析,了解各流行株之间的遗传差异及进化关系,追踪其可能的传染来源.方法 应用RT-PCR技术分别扩增各株病毒的蛋白E基因,克隆到pGEM-T Easy载体,转化DH5α宿主菌,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定.测序结果与国内外流行株进行同源性比较和毒力位点分析,并绘制基因系统发生树.结果 4株DEN-1病毒E基因序列长度均为1485 bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性为91%～98%,推导的氨基酸序列同源性为96.0%～99.2%.广州1995年流行的DEN-1和2002、2004、2006年流行株的毒力位点氨基酸存在差异.结论 通过对登革1型病毒E基因的进化分析,GZ01/95、GZ01/02和GZ01/04这3株同属于基因型Ⅳ,而GZ17/06属于基因型Ⅰ.1995年广州地区流行的DEN-1可能来源于印度尼西亚,而2002和2004年的流行可能与澳大利亚流行株有关.2006年广州又出现的DEN-1可能与泰国2002年的流行株输入有关.     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白MBP-B165抗原性的研究

目的 通过对我国登革2型病毒株包膜E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸编码基因片段的表达,研究MBP－B165蛋白的抗原性。方法 首先采用PCR方法扩增了编码B165蛋白的基因片段,并将其插入到pMal－C2核载体进行融合表达。采用蛋白印迹和ELISA法对表达产物进行特异性鉴定。用表达的融合蛋白MBP－B165免疫大白兔,产通过ELISA法检测兔免疫血清中登革2型病毒特异的抗体。结果 表达的融合蛋白MBP－B165可与我国登革2型病毒株抗体特异结合,而且与登革1、3和4型病毒参考株的多克隆抗体均具有较高的反应性。用表达蛋白免疫大白兔可产生针对我国登革2型病毒株E蛋白的特异抗体,并且该抗体与基他3个型病毒参考株有交叉反应。结论 我国登革2型病毒43株E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸序列具有一定的抗原性,而且具有黄病毒亚组特异的反应性表位,即4个型登革病毒的结构保守性表位。     

登革2型病毒NGC株E基因扩增和部分序列分析

目的 体外扩增、克隆登革2型病毒（NGC株）包膜糖蛋白E基因约1．5kb的基因片段,并对目的基因片段进行部分碱基序列测定和分析。方法 采用逆转录聚合酶链反应扩增出E目的基因片段,经限制性内切酶Kpn1/Xbal酶切后用低熔点琼脂糖挖块回收法回收纯化,插入真核表达载体pcDNA3的多克隆位点,构建重组体pcDNA3-E,转化大肠杆菌DH5a,通过对目的基因片段的部分碱基序列测定鉴定克隆的正确性,并分析其氨基酸变异。结果 从登革2型病毒（NGC株）中扩增出约1．5kb的DNA片段,目的基因片段的部分测序与参考序列的同源性为96．53％,7个氨基酸发生变异,4个变异氨基酸与登革2型病毒Jamaica株相应位置的氨基酸相同。结论 体外成功扩增并克隆DV2（NGC株）全长E基因片段,其序列变异及与其他毒株的同源性研究为登革病毒致病机理和疫苗的研究提供材料。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的DNA免疫原性研究

目的 观察我国登革２型病毒４３株ＰｒＭ－Ｅ基因的ＤＮＡ免疫原性及非甲基化细菌性ＣｐＧ对ＤＮＡ免疫效果的影响。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段，并将其插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ中。在证明其可在哺乳动物细胞中高效表达的基础上，进一步用重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 用含ＰｒＭ－Ｅ基因的重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠可诱导产生     

广东登革3型病毒株的分离培养和鉴定

目的对2009年发生于广东地区的3例家庭聚集性登革热患者血清进行登革病毒的鉴定和病毒株的培养分离。方法用胶体金法检测患者血清中登革病毒特异性IgM、IgG抗体;C6／36细胞培养患者血清中登革病毒;RT—PCR扩增C．PrM基因序列的片段以检测患者血清中登革病毒RNA,PCR产物经序列测定后进行生物信息学分析。结果3例患者血清学检测均为登革病毒特异性IgM阳性、IgG阴性;特异性RT—PCR产物长约290bp,经琼脂糖电泳和测序分析,证实3例患者血清中均存在登革3型病毒;从1例患者血清中培养分离到了登革病毒株,经RT—PCR和测序证实为登革3型病毒。结论2009年发生于广东地区的3例登革热患者经病毒培养和分子生物学鉴定,证实均为登革3型病毒感染。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达及初步鉴定

目的　构建登革 2型病毒E基因的真核表达载体 ,实现登革病毒E蛋白的真核表达。方法　采用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)扩增登革 2型病毒 (NGC株 )包膜糖蛋白E基因全长片段 ,克隆入真核表达载体pcDNA3的Pcmv启动子下游 ,构建重组真核表达质粒pcDNA3 E ,用脂质体转染法转染NIH3T3细胞 ,表达产物以免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹进行分析检测。结果　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3 E ,通过脂质体转染法导入NIH3T3细胞 ,免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹分析检测表明 ,E基因在NIH3T3细胞实现了真核表达 ,产物相对分子质量 (Mr)为 6 0× 10 3。结论登革病毒E基因真核表达载体的构建及E基因的真核表达为研究登革病毒E蛋白的结构与功能、研制登革病毒诊断试剂及核酸疫苗奠定了基础     

广东省登革病毒的分子流行病学研究

目的 通过对广东省90年代以来流行的登革病毒分子流行病学研究,初步了解我国毒株的可能来源,方法 采用RT－PCR方法扩增广东省不同年份分离的登革病毒（DEN）1型和2型NS1部分基因片段,然后进行克隆测序,测序后的基因片段与国际上已知的多个DEN1和DEN2相应的序列进行比较,并以核苷酸的差异在6％以上作为基因亚型分型的标准。结果 ①广州1991年分离的DEN1（GD03／91）与潮洲995年分离的DEN1（GD23／95）同源性很高,为97％,属同一基因亚型,而两者与从潮洲997年分离的DEN1（GD14／97）同源性均为93％,分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD03／91和GD23／95可能来自东南亚或瑙鲁等地,GD14／97可能来自新加坡。②佛山19934昕分离的DEN2（GD06／93）和南海市1998年分离的DEN2（GD01／98）同源性为93％,分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD01／98与泰国流行株ThNH-P28/93株共享序列非常接近,核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为100％,因此推测GD01／98可能来源于泰国。结论 广东省90年代以来流行的登革热来源于不同的传染源。     

两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较

目的 利用登革2型病毒(dengue type 2 virus,DENV2)M株和NGC株NS1基因部分扇列PcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 分别构建两株DENV2 NS1基因部分序列(1-413 bp)的PcDNA3.1真核重组质粒和pET28a(+)质粒,进行原核蛋白的表达、鉴定、纯化和定量;并用pcDNA3.1重组质粒免疫BALB/c小鼠,初次免疫及第7天、14天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第7、14、28和56天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血清特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异保护性抗体水平.结果 构建了pET28a(+)-NS1m/pET28a(+)-NS1n原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,NS1基因部分序列获得表达,其相对分子质量均约22.3×103;Western blot表明该目的 蛋白可与抗His标签单克隆抗体结合;经Ni柱亲和层析法得到纯度达92%的表达蛋白,对C6/36细胞有毒性,并可用于ELASA检测.不同DENV2毒株NS1基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类和中和抗体的产生存在差异,M株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DENV2两毒株NS1基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.

Abstract：

Objective To compare the humoral immune response of BALB/c mice immunized by recombinant plasmids PeDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1.Methods Dengue type 2 virus(DENV2)NS1 gene were constructed two partial sequences(1-413 bp)of the pcDNA3.1 eukaryotic plasmids and pET28a(+)plasmid for prokaryotic expression,identification,purification and quantification.The BALB/c mice were immunized by pcDNA3.1-M-NS1,pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmids with adjuvant.Each animal received a primary inoculation and two boosts at 1-week intervals.Then the blood samples of BALB/c mice were collected from different experiment groups at day 7,14,28 and 56,respectively after first immunization.The specific IgM/IgG antibodies for NS1 protein in serum were confirmed by indirect ELISA.And then the activities of the specific protective antibody were determined by cytopathic effect inhibition(CPEI).Results Construction of the pET28a(+)-NS1 m/pET28a(+)-NS1n prokaryotic expression plasmid,SDS-PAGE analysis showed that,NS1 gene partial sequence was expressed,both the relative molecular weight of about 22.3×103:Western blot showed that the protein can bind anti-His tag monoclonal antibody;byNi affinity chromatographywith apurity of 92% protein,on the C6/36 cell toxicity,and can be used ELASA detection.The results showed that the levels of specific IgM/IgG antibody and neutralizing antibody activities were increased in pcDNA3.1-M-NS1 booster immunization group than other groups.The result had been observed longer duration of antibody level in peDNA3.1-M-NS1 booster immunization group.Conclusion Humoral immune response were significantly different between pcDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmid immunized mice groups.     

Characterization of Asn130-to-Ala mutant of dengue type 1 virus NS1 protein

The nonstructural protein 1 (NS1) of flavivirus has two N-glycosylation sites that are thought to be important for viral replication. Effects of NS1 glycosylation site mutations on viral replication have been reported in several flaviviruses, but the results have differed. In this report, we examined the role of glycosylation site of NS1 on the replication of dengue type 1 virus (DENV-1). DENV-1 production was not detectable when full-length DENV-1 RNA, which has an N-glycosylation site Asn130-to-Ala (Asn130Ala) mutation in NS1, was transfected into mammalian and mosquito cells. However, replication and secretion of recombinant DENV-1 with the NS1 Asn130Ala mutation were recovered by exogenously expressed wild-type DENV-1 NS1. A growth kinetics experiment showed that propagation of wild-type DENV-1 was prevented by NS1 Asn130Ala mutant expression in trans. Our results suggest that Asn130 of the DENV-1 NS1 is important for viral replication in both mammalian and mosquito cells.     

风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白的基因克隆与序列分析

目的：建立风疹病毒包膜糖蛋白E1的克隆载体，研究E1基因变异情况，并对其序列进行系统发生树分析。方法：利用RT－PCR方法扩增并回收风疹病毒JR23株的包膜糖蛋白E1的基因片段，将其与PMD－18T载体连接，经氨苄青霉素筛选，酶切鉴定，以获得风疹病毒E1蛋白基因的克隆，将此基因测序后，利用DNASTAR和WINSTAR软件包绘制系统发生树进行序列之间的比较分析。结果：筛选出含有风疹病毒E1蛋白基因的克隆，序列分析及发生树的绘制表明：JR23株与日本TCRB株及英国THOMAS株差别最小，分别为0．9％和1．2％，与北京BRD2株及香港XG379株差别最大，分别为7．6％和7．3％，与其它各株的差别均小于3％（除NC株为3．7％外），系统发生也与THO－MAS株、TCRB株最近，与BRD2株最远。结论：克隆载体的建立为进一步研究E1基因与糖蛋白功能的关系提供基础。系统发生表明中国不同地区风疹流行株基因序列存在明显差异，这对风疹病毒遗传与变异，分子流行病学研究，以及制备有效的亚单位疫苗提供了资料。     

Polyclonal antibodies against properly folded Dengue virus NS1 protein expressed in E. coli enable sensitive and early dengue diagnosis

The non-structural 1 (NS1) protein plays an important role in dengue diagnosis because it has been detected as a soluble serum antigen in both primary and secondary infections. The NS1 protein was expressed in Escherichia coli cells, and the efficiency of four different refolding protocols was tested. All of the protocols generated dimeric NS1 in a conformation similar to that of the protein expressed by eukaryotic cells. A polyclonal antibody produced from the properly folded E. coli recombinant NS1 (rNS1) protein proved to be a useful tool for the diagnosis of Dengue virus because it detected 100% of the Dengue virus 2 (DENV2) in infected patients’ sera and 60% of the DENV IgM-positive sera not detected by commercial NS1-based diagnostic kits. These data suggest a high-efficiency method for correctly folding rNS1 that maintains its structural and immunogenic properties. In addition, a detection method using the polyclonal antibody against correctly folded rNS1 seemed to be more sensitive and efficient for NS1 detection in serum, highlighting its usefulness for developing a high-sensitivity diagnostic kit.     

Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1

To help understand the mechanism of pathogenesis of dengue virus (DV), we set out to create an infectious cDNA of the Brazilian prototype strain of DV serotype 1 (DV1-BR/90). PCR-amplified fragments of DV1-BR/90 cDNA were readily assembled into a subgenomic cDNA that could be used to produce replicating RNAs (replicons), lacking the structural protein-encoding regions of the genome. However, assembly of a cDNA capable of producing infectious virus was only possible using a bacterial artificial chromosome plasmid, indicating that DV1 sequences were especially difficult to propagate in E. coli. While characterizing our cDNA we discovered a fortuitous temperature-sensitive mutation in the NS1 encoding region. Using our infectious cDNA and a renilla luciferase-expressing replicon we were able to demonstrate that this mutation produced a defect in RNA replication at 37 degrees C, demonstrating that the DV1 NS1 protein plays an essential role in RNA replication.     

Cloning and Sequence Analysis of Envelope Glycoprotein E1 Gene of Rubella Virus, JR23 Strain

Rubella virus (RV), the only member of the Rubivirusgenus in the family Togaviridae, is a single stranded, pos itive sense RNA virus. The structural gene in the 3′endof the genomic RNA encodes 3 virion proteins: the capsidprotein (C), and two envelop glycoproteins, E1 and E2.E1 gene is 1484 bp in length, encoding the hemagglutina tion activity and immune antigenic sites of RV. Studies in dicate that the degrees of variance in E1 gene sequence aresimilar to that of the complete gen…     

DNA vaccines against dengue virus based on the ns1 gene: the influence of different signal sequences on the protein expression and its correlation to the immune response elicited in mice

We analyzed four DNA vaccines based on DENV-2 NS1: pcENS1, encoding the C-terminal from E protein plus the NS1 region; pcENS1ANC, similar to pcENS1 plus the N-terminal sequence from NS2a (ANC); pcTPANS1, coding the t-PA signal sequence fused to NS1; and pcTPANS1ANC, similar to pcTPANS1 plus the ANC sequence. The NS1 was detected in lysates and culture supernatants from pcTPANS1-, pcENS1- and pcENS1ANC-transfected cells and not in cells with pcTPANS1ANC. Only the pcENS1ANC leads the expression of NS1 in plasma membrane, confirming the importance of ANC sequence for targeting NS1 to cell surface. High levels of antibodies recognizing conformational epitopes of NS1 were induced in mice immunized with pcTPANS1 and pcENS1, while only few pcENS1ANC-inoculated animals presented detectable anti-NS1 IgG. Protection against DENV-2 was verified in pcTPANS1- and pcENS1-immunized mice, although the plasmid pcTPANS1 induced slight higher protective immunity. These plasmids seem to activate distinct patterns of the immune system.     

我国2型登革病毒NS1基因的克隆及部分碱基序列的测定

将我国登革２型病毒株ＮＳ１基因的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增片段直接克隆到Ｔ－载体ＤＮＡ中。用限制性内切酶分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的阳性克隆的ＤＮＡ，证明插入片段与扩增的ＮＳ１片段的大小一致。用双脱氧链末端终止法测序结果表明，ＮＳ１基因扩增片段５’端的部分碱基序列并未发生改变。