骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞的实验研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)体外诱导分化为心肌细胞的可行性,为心肌梗死治疗提供理想的细胞材料。方法:分离大鼠下肢骨获取MSCs进行培养;5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养;免疫细胞化学检测细胞对连接蛋白-43和α横纹肌肌动蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步了解心肌细胞特异性蛋白的表达。结果:MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;诱导后3周10μmol/L 5-aza组细胞连接蛋白-43、α横纹肌肌动蛋白表达阳性。RT-PCR显示10μmol/L 5-aza诱导后3周的细胞可表达心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白。结论:MSCs体外经5-aza诱导后可分化为心肌细胞。     

5-氮胞苷浓度对体外骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的影响

目的探讨不同浓度5-氮胞苷(5-aza)体外诱导小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的可能性及其对细胞扩增速度的影响.方法10ml骨髓,1.077g/ml Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(MNCs),第2代传代细胞分别加入3,5,10μmol/L浓度5-aza化学诱导24h,与对照组连续培养4周,细胞爬片免疫荧光法鉴定结蛋白desmin及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的表达,电镜观察诱导细胞的超微结构变化.结果5-aza化学诱导后MSCs形态变长、增大,排列更加紧密、整齐,5和10 μmol/L组可见较多的多核细胞,部分管状结构,诱导率分别为36%和31%,无显著性差异;3μmol/L组上述变化的细胞极少,3种浓度及对照组4周后细胞扩增数量分别为(3.81±0.40)×106、(3.76±0.62)×106、(3.67±0.80)×106及(2.90±0.21)×106,10μmol/L组增殖速度明显减慢(P＜0.05).各组诱导后的细胞均未见自发搏动.免疫组化提示desmin及cTnI表达阳性,5和10μmol/L组电镜下出现肌丝样结构、心房颗粒及细胞间的缝隙连接.结论小型猪MSCs经5、10 μmol/L 5-aza化学诱导可分化为心肌样细胞,其中5 μmol/L5-aza不仅可以诱导心肌样细胞而且对细胞增殖速度影响小.     

5-氮胞苷诱导对骨髓间充质千细胞凋亡影响的实验研究

目的：研究5-胞苷（5-azacytidine，5-aza）对体外培养的兔骨髓问充质于细胞（mensenchymal stemcell，MSC）凋亡的影响。方法：体外分离培养兔MSC，用不同浓度5-aza诱导不同时间．观察MSC凋亡情况。结果：正常培养兔MSC有轻度细胞捌亡；5-aza诱导浓度达15μmol／L时凋亡率明显增加（P〈0．01）．当浓度达10μmol／L，诱导时间延长则细胞洲亡率明显增加（P〈0．05），超过15μmol／l。时出现成片细胞死亡。结论：5-aza诱导对体外培养兔骨髓间质干细胞有诱导细胞凋亡作用，其作用程度与诱导时间及浓度有关。     

5-氮胞苷诱导对骨髓间充质干细胞凋亡影响的实验研究

目的：研究5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cell, MSC)凋亡的影响。方法：体外分离培养兔 MSC,用不同浓度5-aza 诱导不同时间,观察 MSC 凋亡情况。结果：正常培养兔 MSC 有轻度细胞凋亡；5-aza 诱导浓度达15μmol/L 时凋亡率明显增加(P＜0.01),当浓度达10μmol/L, 诱导时间延长则细胞凋亡率明显增加(P＜0.05),超过15μmol/L 时出现成片细胞死亡。结论：5-aza 诱导对体外培养兔骨髓间质干细胞有诱导细胞凋亡作用,其作用程度与诱导时间及浓度有关。     

不同浓度5-氮胞苷对小鼠骨髓间充质干细胞的诱导作用

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的最佳诱导浓度。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传第2代MSCs培养48h后分别加入3、5、10、20、50μmol／L5-aza进行诱导,设为3、5、10、20、50μmol／L组。继续培养3周后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测心肌特异性蛋白α-actin表达。结果5-aza3、5μmol／L组α-actin阳性率分别为0．88％±0．52％、2．61％±0．96％,两组细胞形态均无明显改变;10μmol／L组可见细胞突起回缩,α-actin呈强阳性表达,阳性率为30．57％±1．82％;20、50μmol／L组细胞已脱落。结论MSCs经5-aza体外诱导分化,可获得形态类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞,且以10μmol/L浓度诱导作用最佳。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的观察5-氮胞苷对骨髓间质干细胞(BMMSC)体外向心肌细胞诱导分化的影响.方法分离大鼠BMMSC体外培养,使用终浓度为10 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)对其定向诱导,观察细胞形态学的变化,荧光免疫组织化学方法进行鉴定,电镜观察细胞的超微结构.结果BMMSC体外经5-aza诱导4周,肌钙蛋白及Connexin43表达阳性,电镜下在部分细胞内肌节样结构及细胞间形成缝隙连接.结论BMMSC可以在体外经5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞.     

5-氮胞苷体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的初步研究

目的:探索不同浓度5-氮胞苷(5-aza)在不同诱导时间下对成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分化为心肌细胞的诱导作用,确定最佳诱导条件。方法:体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并进行传代培养,流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34的表达,用含不同浓度5-aza(3、5、10、15、20μmol／L)培养基分别诱导12小时、24小时、48小时、72小时,倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态变化;于诱导后14、28天时免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白I(cTn-I)的表达,分析细胞转化率。结果:分离培养的ADMSCs表达CD44,不表达CD34;5-aza诱导后14天时免疫细胞化学未见有心肌细胞特异性cTn- I表达,诱导28天细胞免疫细胞化学显示cTn-I表达阳性,以10μmol/L 5-aza诱导24小时为最佳体外诱导条件。结论:成人脂肪组织间充质干细胞可在体外5-aza诱导下向心肌细胞分化。     

犬骨髓间叶干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究

目的:旨在建立骨髓间叶干细胞(MSCs)体外定向诱导分化心肌细胞的方法,为心肌疾患的移值修复治疗提供成体干细胞来源.方法:利用Percoll密度梯度法及MSCs黏附贴壁生长特性进行分离培养与扩增骨髓MSCs,并予以鉴定证实.应用5-氮胞苷对培养早期的骨髓MSCs进行定向诱导分化心肌细胞.通过细胞形态学、细胞免疫组化、透射电镜等技术观察分化细胞的肌管,心肌细胞特异性蛋白与细胞特异性超微结构以鉴定诱导分化的效果.结果:利用Percoll密度梯度法与细胞黏附贴壁生长特性,可分离培养与扩增足量骨髓MSCs.应用化学诱导剂5-氮胞苷10～20 μmol/L孵育早期培养的骨髓MSCs4～5周,可见细胞形成肌管;肌细胞特异性蛋白α-肌动蛋白,肌球蛋白以及心肌细胞特异性分子标志肌钙蛋白I免疫组化染色阳性;透射电镜可见肌丝与房性颗粒.结论:骨髓MSCs可在体外5-氮胞苷的诱导下定向转化为具有典型结构的心肌细胞.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞

目的观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记.方法提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10 μmol/L),分别在培养2周和4周时观察两组细胞光镜、电镜下形态,4周时进行磷钨酸-苏木素染色(PTAH)和肌动蛋白(actin)免疫组化染色.诱导组MSCs加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU,5μg/ml),分别在作用后第2周和第4周,利用BrdU单克隆抗体免疫组化检测BrdU标记方法.此外,用含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组MSCs,利用X-gal染色检测LacZ基因表达的半乳糖苷酶,观察诱导分化后MSCs的体外标记情况.结果体外能够成功地分离骨髓MSCs,5-aza诱导分化2周和4周后的MSCs在光镜下明显成为梭形,形态类似肌细胞.电镜下诱导分化后的MSCs在2周时出现肌丝结构,4周时肌丝明显增多.PTAH染色显示超过70%的细胞具有横纹肌的染色性质,actin免疫组化染色显示超过80%的诱导后MSCs肌动蛋白呈阳性表达.体外BrdU单克隆抗体检测BrdU掺入到MSCs细胞核中,X-gal染色证明LacZ基因能够进入MSCs并表达,两种体外标记方法在标记2周和4周时都为阳性.结论5-aza能够诱导骨髓MSCs成为心肌细胞,BrdU掺入和含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染能够成功对诱导分化后MSCs进行标记,并且标记持续至少4周.     

细胞代数与5-氮胞苷浓度对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的影响

目的探讨不同细胞代数与不同5-氮胞苷(5-Aza)浓度对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞定向分化增殖能力的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞。选择第2代、第6代、第10代细胞,每代分为四组(三组为诱导组,一组为对照组),三个诱导组分别以5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L5-氮胞苷孵育24h后,与对照组以完全培养液连续培养5d。通过MTT法测取各代细胞诱导组与对照组第1天、第3天、第5天的OD值,计算三代细胞经不同浓度5-氮胞苷诱导后及对照组的增殖率。采用免疫细胞化学法检测各代MSCs经不同浓度5-氮胞苷诱导培养4周后心肌特异蛋白cTnT、α-Actin的表达。结果正常对照组第2代与第6代细胞增殖率无统计学意义(P0.05),与第10代细胞均有统计学意义(P0.05)。相同浓度药物诱导的三代细胞,第2代细胞与第6代、第10代细胞增殖率有统计学意义(P0.05),第6代、第10代细胞增殖率无统计学意义(P0.05)。不同5-氮胞苷浓度诱导的同代细胞间增殖率无统计学意义(P0.05)。经三种浓度5-氮胞苷诱导的2代、6代、10代MSCs均表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin,对照组表达为阴性。结论随着细胞代数的增加,药物浓度对细胞的增殖能力影响越来越小。经5-氮胞苷诱导的MSCs表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin,未经诱导的MSCs不表达心肌特异蛋白。     

不同浓度的5-氮胞苷对人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的探讨不同浓度的5-氮胞苷（5-aza）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向心肌细胞分化的影响。方法抽取人胸骨骨髓35 ml,采用密度梯度离心法和贴壁法进行hMSCs的分离培养。于第3代生长状态良好的hMSCs中,分别加入3、5、10、20和40μmol/L 5-aza处理24 h,更换新鲜的培养基继续培养;对照组的细胞始终用完全培养基培养。光镜下动态观察细胞形态的变化,4周后用免疫组化染色法检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）、连接蛋白43（Cx43）的表达。结果经5-aza诱导处理后,hMSCs的形态变长、增大,排列更加紧密、整齐。免疫组化染色法检测表明,对照组与3μmol/L 5-aza组cTnI、Cx43的表达呈阴性,5、10、20和40μmol/L 5-aza组cTnI和Cx43的表达均呈阳性。在一定范围内（<10μmol/L的5-aza）,随着5-aza浓度的增加,hMSCs向心肌细胞的转化率逐渐增高;但高浓度（>10μmol/L）5-aza的毒性可造成细胞大量死亡。结论hMSCs经适当浓度的5-aza处理后,可向心肌细胞分化,10μmol/L的5-aza为最适诱导浓度。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌细胞的观察

体外分离培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),传代纯化后取第3代接种于培养板上,分别加入5、10、20 μmol/L 5氮胞苷(5-aza),孵育12、24、48 h后,更换新鲜培养基继续培养.光镜下动态观察细胞变化,4周后免疫组化染色法检测肌钙蛋白(cTnI)、连接蛋白43(Cx43)表达.结果经5-aza诱导后,hMscs形态变长、增大,排列整齐;除对照组外,其他各组hMscs的cTnI、Cx43表达均阳性;10μmol/L 5-aza孵育24 h hMscs转化率明显增加(P<0.05).提示hMscs体外经5-aza诱导后,可向心肌细胞分化;10μmol/L 5-aza诱导24 h是最佳诱导条件.     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的: 研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSC）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法: 采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200 ml/L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSC,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSC 24 h后继续培养。培养4周,用免疫细胞化学染色法检测肌系标记抗原:α-肌动蛋白（α-actin）及心肌细胞特异性标记抗原:肌钙蛋白T（cTnT）;在透射电镜下观察细胞的超微结构。结果: MSC经5-Aza诱导分化后,可表达α-actin和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSC中均未见表达。透射电镜可观察到肌丝等心肌细胞的特异性结构。结论: 5-Aza可诱导MSC分化为心肌样细胞。     

骨髓间质干细胞心肌分化过程中细胞内钙离子浓度的变化

目的研究骨髓间质干细胞心肌分化前、后钙离子浓度变化。方法用5-杂氮胞苷(5-azacytidine)体外诱导猪骨髓间质干细胞使之向心肌分化；ELASA法测定分化前、后细胞内心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)变化；应用离子图像分析系统测定分化前、后细胞内钙离子浓度变化。结果(1)经5-杂氮胞苷诱导后细胞形态发生变化；(2)诱导后第3周起细胞内cTnⅠ明显增高；(3)诱导组细胞内钙离子浓度较对照组高，且诱导前后细胞内钙释放机制不同。结论骨髓间质干细胞体外经5-杂氮胞苷诱导后可具有心肌细胞的某些特性，这一过程与钙信号有关。     

体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨体外培养并应用5-氮胞苷（5-aza）诱导人脐带源间充质干细胞（hUC MSCs）是否能分化为心肌细胞。方法足月顺产或剖宫产患者的脐带在无菌条件下剪碎后采用贴壁培养法分离、纯化hUC MSCs,采用5-aza对P3代hUC MSCs进行诱导24 h后继续培养4周,采用倒置显微镜观察细胞形态学的变化,同时采用免疫组织化学方法测定肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果采用贴壁培养法可从脐带组织获得大量hUC MSCs。5-aza诱导4周后免疫组织化学鉴定cTnI表达阳性。结论人脐带贴壁培养可获得大量的hUC MSCs,hUC MSCs体外经5-aza诱导可定向分化为心肌细胞。     

骨髓间质干细胞横向分化为心肌细胞的机制和诱导因素

心血管疾病严重威胁着人类的健康,近年来,随着对干细胞多向分化潜能研究的进展,其在心血管疾病方面的应用也引起了关注,而骨髓间质干细胞(MSC)以其横向分化潜能在治疗心血管疾病方面显示了巨大潜力。不少研究已证实MSC在体内、外均可分化为心肌细胞,然而其分化为心肌细胞的机制,诱导分化的相关因素和如何定向诱导,如何提高其分化效率等均为人们所关注,本文就此作一综述。     

培养基血清浓度对5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响

目的 观察脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌样细胞诱导分化的适宜培养基血清浓度。方法采用Ⅰ型胶原酶消化法自成人脂肪组织分离ADMSCs进行培养。对第3代细胞以10μmol／L的5-氮胞苷（5-aza）诱导作用24h,用含10％、5％胎牛血清的完全培养基继续培养,镜下观察细胞形态学变化,采用免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）,计算心肌细胞转化率,采用RT—PCR方法检测NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结果5-aza诱导ADMSCs后7d细胞形态及排列开始发生变化,4周后可见极个别细胞出现细微搏动,10％、5％胎牛血清培养下心肌样细胞转化率分别为31．5％±4．2％、32．8％±5．0％,P=0．72;RT-PCR产物条带见NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结论ADMSCs在-aza诱导后于低浓度血清培养基中培养效果更好。     

永生型骨髓间质干细胞体外诱导为心肌样细胞的实验研究

目的　采用骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞 ,为心力衰竭的干细胞移植治疗提供新的细胞材料。方法　抽取贵州香猪骨髓液 3ml,按照Wakitani的方法培养出骨髓间质干细胞 ,连续传代 4个月 ,得到永生型细胞 ,经 5 氮胞苷 (5 azacytidine)刺激后 ,进行RT PCR ,基因测序 ,免疫组化 ,电镜超微结构鉴定。结果　骨髓间质干细胞经 5 氮胞苷刺激后 ,部分细胞呈梭形。RT PCR ,基因测序结果表明细胞有心房利钠肽 (ANP) ,脑利钠肽 (BNP) ,心肌特异性肌球蛋白重链 (cardiac MHC) ,β肌球蛋白重链 (beta MHC) ,α骨骼肌肌动蛋白 (α skeletalactin)表达 ,结蛋白 (desmin) ,肌球蛋白重链 (MHC) ,心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ (cTnTⅠ )免疫组化阳性。电镜示梭形细胞有明显的肌丝 ,细胞核呈单椭圆形 ,位于细胞中央。结论　骨髓间质干细胞经 5 氮胞苷刺激后 ,从基因 ,蛋白 ,超微形态上已有心肌细胞特点 ,表明在体外环境下可向心肌细胞转化 ,有望成为心力衰竭干细胞移植治疗的细胞材料     

流体剪切力对5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的观察5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,并探讨流体剪切力对诱导过程的影响。方法贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,取第4代骨髓间充质干细胞以3、5、10、15及20μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用12、24及48 h,用免疫荧光法鉴定分化的心肌样细胞α-肌动蛋白表达率,10μmol/L作用24 h为最佳诱导浓度。通过建立流体剪切力模型,设立以下四组:不加载流体剪切力组、加载5 dyn/cm2流体剪切力组、加载15 dyn/cm2流体剪切力组和加载25 dyn/cm2流体剪切力组,作用24 h,倒置显微镜观察诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化,4周后逆转录聚合酶链反应测定分化的心肌样细胞心肌肌钙蛋白ImRNA的表达。结果骨髓间充质干细胞随着传代逐渐变成梭形,5-氮杂胞苷诱导后骨髓间充质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征。免疫荧光显示α-肌动蛋白表达阳性。经过流体剪切力作用细胞后,心肌肌钙蛋白I的表达增高,阳性条带均比未进行力学刺激的细胞表达明显,以15 dyn/cm2剪切力最明显。但是25 dyn/cm2剪切力作用结果并没有随着力的增大而增大。结论 5-氮杂胞苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可联合剪应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮杂胞苷。     

心肌细胞裂解成分诱导骨髓间充质干细胞分化的超微结构观察

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在心肌细胞裂解成分作用下超微结构改变,了解心肌细胞裂解成分对MSCs分化的诱导作用。 方法:分离并裂解新生大鼠的心肌细胞;自成年大鼠骨髓中分离MSCs;将分离的MSCs分3组培养:仅用普通培养基培养(对照组);5-氮杂胞苷(5-aza)诱导后用普通培养基培养(5-aza诱导组);含有心肌细胞裂解成分的培养基培养(心肌细胞裂解成分培养组)。培养1周,观察细胞形态及超微结构的改变,对培养的细胞进行抗心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)及抗分化决定簇31(CD31)细胞免疫化学染色,并分析各组细胞的增殖情况。 结果:对照组MSCs无明显的肌样细胞或内皮样细胞形成,抗cTnT和抗CD31染色阴性。5-aza诱导组部分MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见大量细胞器空化,抗cTnT染色阳性,但细胞增殖缓慢。心肌细胞裂解成分培养组的MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见肌丝样结构,抗cTnT染色阳性,细胞增殖旺盛,另见部分MSCs分化为内皮样细胞,形成内皮细胞特有的胞质突起和质膜小泡等超微结构,且抗CD31染色阳性。 结论:含有心肌细胞裂解成分的培养基可以诱导MSCs向心肌样细胞和内皮样细胞方向分化。