牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白,以抗6×His Tag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。     

变异链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达质粒的构建和表达

目的:构建含变异链球菌乳酸脱氢酶(LDH)和霍乱毒素B亚单位(CTB)嵌合原核表达质粒,并诱导表达融合蛋白。方法:应用PCR技术扩增LDH编码基因ldh和CT编码基因ctxB,定向克隆至原核表达质粒pET32a(+)上,通过限制性内酶切、PCR和序列测定分析鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达融合蛋白。结果:PCR扩增得到了ldh和ctxB;构建的质粒pET-LDH/CTB经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切和目的基因PCR检测,均得到1.4 kb大小的片段,与预计目的基因片段大小相同;质粒pET-LDH/CTB中插入的ldh序列与GeneBank中ldh比较同源性为98%,ctxB的同源性达99%,插入的相位正确;经IPTG诱导表达了约70×103的蛋白。结论:成功构建了变异链球菌LDH和CTB嵌合表达质粒pET-LDH/CTB,并正确表达融合蛋白。     

变形链球菌SBR基因表达载体的构建和表达

目的 :构建可用于大肠杆菌表达系统的含变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因的表达载体。方法 :采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因插入表达载体 pcMVT7,构建重组原核表达质粒pcMVT7 SBR ,转化大肠杆菌JM 10 9(DE3 ) ,IPTG诱导表达 ,亲和层析纯化目的蛋白。结果 :经酶切鉴定及DNA序列测定 ,重组质粒 pcMVT7 SBR序列及阅读框架正确 ,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白。 结论 :SBR表达载体构建成功 ,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础。     

IPTG诱导变形链球菌葡糖基转移酶可溶性表达及活性初步测定

目的：提取变形链球菌GS5葡糖基转移酶GTF（glucosyltransferase）催化活性区（CAT）的基因,利用IPTG诱导后获得可溶性表达,并检测活性。方法：利用PCR技术克隆CAT的基因片段,通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌BL21中表达,利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导含有质粒pET32-NusA-CAT的大肠杆菌,SDS-PAGE电泳进行检测;采用蒽酮硫酸法验证活性。结果：成功将CAT基因连入大肠杆菌BL21,获得可溶性的融合蛋白表达;并且融合蛋白具有生物学活性。结论：IPTG成功诱导克隆的变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区基因并获得可溶性融合蛋白的表达,具有生物学活性。     

牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因的克隆表达与纯化

目的 克隆表达牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)牙龈素中黏附素区域的Hgp44基因,并纯化目的蛋白.方法 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,克隆得到PgATCC33277的Hgp4基因,插入到克隆载体pMD18-T中并测序鉴定.经过酶切后将目的基因片段与表达载体pET22b相连,构建出表达质粒pET22b-Hgp44.将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹法进行分析.用固定化金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化.结果 目的基因片段约为1100 bp,与预期大小相符,测序结果与GenBank中ATCC33277国际标准菌株的RgpA的等位基因序列U15282一致.IPTG诱导后的菌体经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后形成一个以包涵体形式存在的44 000的融合蛋白.蛋白质印迹法检测证实其具有免疫原性.用镍离子金属螯合层析柱纯化出了目的蛋白,最后得到约3.5 mg/L的目的蛋白.结论 成功克隆表达了PgHgp44基因,并纯化出了目的蛋白.     

釉成熟蛋白amelotin在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:观察釉成熟蛋白(amelotin)基因聚合酶链反应产物在大肠杆菌中的表达,并获得纯化的釉成熟蛋白.方法:利用His融合蛋白表达载体pET32a(+)转化大肠杆菌BL21,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并改变诱导时间、温度、IPTG浓度来优化表达条件,然后在优化的条件下进行大量表达并收菌;His镍柱纯化表达的蛋白.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白表达、纯化情况.结果:电泳结果分析表明:amelotinPCR扩增产物在大肠杆菌中获得高效表达,大小约4×104,纯化得到的amelotin纯度较高.结论:成功得到纯化的amelotin,为进一步制备抗体奠定基础.     

重组变形链球菌表面蛋白PAc发酵工艺研究

目的:研究表达重组变形链球菌表面蛋白(rPAc)的工程菌pET20b(+)-AP/BL21(DE3)plysS的发酵条件。方法:通过摇瓶培养,进行发酵条件优化,在5L发酵罐中发酵pET20b(+)-AP/BL21(DE3)plysS工程菌,并对发酵产物进行SDS-PAGE、Western印迹分析鉴定。结果:确立了pET20b(+)-AP/BL21(DE3)plysS工程菌的高密度发酵工艺,即LB-2培养基,初始pH值为7.2,溶氧控制为30%以上,补料为10%甘油、5%酵母粉和5%蛋白胨。目的蛋白呈可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的45%以上,菌体密度达到44。Western印迹分析显示,rPAc蛋白和抗PAc抗体有良好的结合活性。结论:通过发酵工艺优化,提高了rPAc蛋白的可溶性表达量,为进一步规模化研究和生产奠定了基础。     

变形链球菌表面蛋白PAc的原核表达及纯化

目的：对在大肠杆菌中表达重组变形链球菌表面蛋白抗原PAc的培养条件进行优化,制备高纯度重组蛋白rPAc。方法：载体构建原核表达载体pET20b（＋）-AP对不同培养基、诱导浓度,温度和时间等进行筛选确定最佳条件,采用亲和层析分离纯化rPAc蛋白。结果：含原核表达载体pET20b（＋）-AP的大肠杆菌在LB培养基中培养至A600—0．6时,终浓度为1mM的IPTG诱导,30℃继续振荡培养4h,可使rPAc的表达量达到最大。分离纯化的蛋白在SDSPAGE中显示为单一条带。结论：对PAcA～P区的重组质粒pET20b（＋）-AP表达的rPAc经纯化后可用于动物免疫,为探索防龋DNA疫苗pCIA—P的新型免疫策略奠定必要的物质基础。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。     

FimH重组蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中构建并表达3种FimH重组蛋白,并对FimH重组蛋白的培养条件进行优化,制备高纯度FimH重组蛋白。方法：采用原核表达载体pET28a构建出能表达FimH的重组质粒,并分别对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化,以提高重组蛋白的产量和增大其可溶性,最后以亲和层析分离纯化3种FimH重组蛋白。结果：成功构建出表达大肠杆菌（K12,BL21）和沙门氏菌（S．T．）FimH的原核表达载体pET28a—K12／BL21／S．T．,经酶切、测序和WesternBlot鉴定,目的蛋白表达正确。在适当浓度的IPTG诱导,15℃震荡培养20h,可使FimH的表达量达到最大,分离纯化的蛋白在SDS—PAGE中显示为一条带。结论：本研究构建以3种FimH为表面呈现系统的表达载体,3种FimH基因和预测蛋白结构略有差异。本研究为后续研究3种蛋白生物活性差异及其靶向M细胞的免疫佐剂活性提供物质基础。