应用表达载体介导siRNA抑制乳腺癌细胞MCF-7血管内皮生长因子-C基因的表达

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达的抑制作用. 方法 设计合成一对编码后可形成小发夹结构针对VEGF-C基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建VEGF-CsiRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染MCF-7细胞,半定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测转染前后MCF-7细胞VEGF-C基因表达的变化. 结果 PCR和DNA测序证实,携带VEGF-CsiRNA表达载体构建成功,VEGF-C基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P<0.05),在mRNA水平其表达抑制率为61.8%;在蛋白表达水平其表达抑制率为78.3%. 结论 本研究构建的VEGF-CsiRNA表达载体可有效抑制MCF-7细胞VEGF-C的mRNA和蛋白表达,为进一步以VEGF-C为靶点的乳腺癌治疗实验研究奠定了基础.     

VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

siRNA对VEGF蛋白表达的影响及对裸鼠移植肾癌的抑制作用

目的探讨siRNA沉默血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾癌裸鼠移植瘤VEGF蛋白的表达水平及生长抑制作用的影响。方法化学合成针对VEGF的siRNA序列,通过脂质体将VEGF-siRNA转染到ACHN细胞中,将转染VEGF-siRNA的ACHN细胞（A组）、转染空质粒的ACHN细胞（B组）及未转染的ACHN细胞（C组）分别接种于裸鼠背部皮下。在SPF环境中饲养裸鼠并观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,每隔5d测定移植瘤体积大小（肿瘤的长轴L,短轴W,肿瘤体积V=1/2LW2）,绘制肿瘤生长曲线,采用免疫组化及Western blot法测定裸鼠移植瘤组织切片中VEGF蛋白的表达水平。结果 A组小鼠移植瘤成瘤及生长明显缓慢,移植瘤的体积和质量均低于B、C组,差异有统计学意义（P〈0.05）;移植瘤组织切片免疫组化及Western blot法检测结果提示：与B、C组相比,A组中VEGF蛋白表达量降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;而B、C组间瘤体的体积重量及VEGF蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 VEGF在肾癌的发生、发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA可特异性抑制肾癌细胞中VEGF的表达,抑制肿瘤的生长增殖。     

VEGF siRNA增强白血病HL60细胞对阿糖胞苷药物的敏感性

目的 探讨VEGF siRNA是否能增强自血病细胞HL60对化疗药物阿糖胞苷的敏感性.方法 体外转录合成VEGF siRNA,转染HL60细胞,采用CCK8法检测细胞增殖的情况,RT-PCR方法检测细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达水平,ELISA方法定量检测细胞培养液VEGF蛋白的表达水平,用流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 VEGF siRNA可以提高HL60细胞对阿糖胞苷的敏感性,VEGF siRNA与阿糖胞苷联用能显著抑制HL60细胞的存活,抑制率为82.9%(F=121.63,P<0.01).VEGF siRNA能降低VEGF mRNA121(F=17.17,P<0.01)和VEGF蛋白(F=3290.49,P<0.01)的表达水平.但是VEGF siRNA没有促进阿糖胞苷诱导的细胞凋亡水平.结论 VEGF siRNA通过抑制细胞的增殖来增强HL60细胞对阿糖胞苷的敏感性.     

靶向VEGF165 RNA干涉对HeLa细胞凋亡的影响

RNA干涉(RNA interference,RNAi)是指序列特异性的转录后基因沉默,它已经发展成为高效、特异阻断目的基因表达的有效工具[1].据此,我们针对人VEGF165基因mRNA序列,设计了2个干涉靶位点,体外转录合成siRNA,通过脂质体转染入HeLa细胞,分别体内、体外观察对HeLa细胞凋亡的影响.     

孕激素对绒毛外滋养细胞VEGF表达的影响

目的通过研究孕激素对绒毛外滋养细胞孕激素受体(PR)和血管内皮生长因子表达的影响,探讨P对绒毛外滋养细胞侵袭能力的影响及维持妊娠的机理。方法采用半定量PCR和定量PCR测定孕激素干预后绒毛外滋养细胞表达PR mRNA和VEGF mRNA的水平。结果(1)不同浓度的孕激素PRA表达量极低,PRB mRNA的表达没有显著差异(P>0.05);(2)VEGF mRNA与孕激素浓度变化无明显相关,反而与PRB mRNA的水平成反比关系。结论(1)孕激素作用的发挥取决于PR的水平,与激素本身的浓度没有明显关系;(2)PRB能下调滋养细胞分泌VEGF的能力从而抑制其侵袭力,提示PR异常可能是导致绒毛外滋养细胞侵袭能力发生改变而引起相关疾病的原因之一。     

小剂量VCR联合Endostar抑制PLA-802细胞系VEGF表达

目的 探讨小剂量长春新碱(VCR)联合恩度(Endostar,Endo)对横纹肌肉瘤细胞生长的影响及其机制.方法 体外培养PLA-802细胞系,用小剂量Endo、VCR单独或联合处理细胞.用MTT和流式细胞仪检测细胞的生长和细胞周期;用RT-PCR和Western blot检测药物处理后细胞内VEGF mRNA和蛋白水...     

VEGF siRNA的筛选、评价及siRNA的设计规则探讨

目的设计并评价9条VEGFsiRNA的干扰效果,并提出新的高效siRNA设计规则。方法用siRNA现有设计规则与计算机辅助结合共设计9条VEGFsiRNA序列,长度为19 bp。体外转录法构建9条VEGFsiRNA,通过脂质体介导转染神经胶质瘤U251细胞株,培养48 h,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的表达量,分析9条VEGFsiRNA序列特征与其干扰效果的关系。结果用“H-b”指数可以量化VEGFmRNA二级结构;VEGF蛋白表达的抑制程度与“H-b”指数呈负相关(r=-0.498),靶向VEGFmRNA第386~406位置核苷酸的siRNA和第401~421位置核苷酸的siRNA的“H-b”指数小,抑制蛋白表达的效果好。siRNA正义链的第19个核苷酸碱基为A/U,且第6个核苷酸碱基为A,有较好的沉默靶基因的效果。siRNA的热动力学特征也影响其干扰效果,反义链第9~14位置的内部能量稳定性的均值(AIS)大,易于发挥干扰效果;siRNA反义链的结合能量越低,siRNA反义链与靶序列mRNA结合越稳定,有利于RNA诱导的沉默复合物(R ISC)剪切靶序列mRNA。结论成功地设计并合成VEGFsiRNA序列,能有效地抑制VEGF蛋白表达。     

肺癌患者血管内皮生长因子和T细胞亚群表达的变化

测定和比较83例肺癌患者与60名正常人血清血管内皮生长因子(VEGF)和T细胞亚群(CD3 、CD4 、CD8 、CD8 CD28 )和NK细胞的表达水平,探讨其临床意义,VEGF采用ELISA法,T细胞亚群的表达采用流式细胞仪法。结果表明:肺癌患者VEGF水平明显高于对照组(P<0.01)。CD4 细胞、CD8 CD28 细胞和NK细胞明显低于对照组(P<0.01)。CD8 细胞则明显高于对照组(P<0.01)。提示肺癌患者血清VEGF增高和细胞免疫功能紊乱,有一定的临床意义。     

miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子表达的调控作用

 目的：探讨miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：选用EA.hy926细胞株作为研究对象,采用阳离子介导的转染方式,将miR-126 inhibitor 和miR-126 mimics 进行细胞转染,分析miR-126对血管内皮细胞功能的影响。采用转染negative control作为阴性对照,转染36 h后提取细胞总RNA,利用 real-time PCR和Western blotting分别检测EA.hy926细胞 VEGF  mRNA 和蛋白水平的表达。结果：转染miR-126 inhibitor 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间差异有统计学意义（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 inhibitor 使EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平显著上调（P<001）;转染miR-126 mimics 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间有显著差异（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 mimics 使EA.hy926细胞的VEGF 在mRNA及蛋白水平显著下调（P<001）。结论：miR-126 能够抑制VEGF的表达,VEGF有可能是其调节的靶基因之一。     

Efficient inhibition of human cytomegalovirus UL122 gene expression in cell by small interfering RNAs

In order to develop a gene therapy to human cytomegalovirus (HCMV), RNA interference (RNAi) was employed to inhibit the expression of HCMV UL122 gene in vitro. Recombinant vector pUL122‐EGFP, which expressed UL122‐EGFP fusion protein, and recombinant vectors psi122‐1, psi122‐2 and psi122‐3, which expressed small interfering RNAs (siRNAs) targeted to UL122 were contransfected into AD293 cells. The fluorescence signal of pUL122‐EGFP was greatly suppressed by psi122‐1 and psi122‐2, with an inhibitory rate of 82.0% ± 1.0% and 79.5% ± 2.5%, respectively. The mRNA of pUL122‐EGFP of the cells transfected with psi122‐1 and psi122‐2 was decreased 97.3% ± 0.6% and 98.0% ± 0.1%, respectively. Vector psi122‐3 showed a slightly low suppression rate. Therefore, it may be concluded that plasmids encoding siRNAs targeted to UL122 is able to in vitro reduce markedly the expression of UL122‐EGFP. And it is very likely that the psi122‐1 and psi122‐2 are potentially efficacious siRNAs in the gene therapy of HCMV infection in vivo, in which further investigations are required. This study is expected to greatly facilitate the use of the RNAi technology for the anti‐HCMV studies. (© 2009 WILEY‐VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim)     

SiRNA对丙型肝炎病毒5''非翻译区的干扰作用实验研究

目的研究多种siRNA对丙型肝炎病毒（HCV）5’非翻译区（5＇-UTR）的干扰作用。方法以绿色荧光蛋白基因（GFP）为报告基因，构建HCV5’UTR与GFP核酸序列连接的表达载体：pcDNA—HCV-5’UTR—GFP。设计针对HCV5’UTR区3段小干扰RNA（siRNA），siRNA与表达质pcDNA—HCV-5’UTR—GFP共转染HepG2细胞中，采用荧光显微镜观测细胞内荧光强度改变，并且用流式细胞术量化分析细胞荧光强度变化，评价多种siRNA对HCV基因表达的作用。结果成功构建含HCV5’UTR区的绿色荧光蛋白基因，siRNA能特异性地抑制绿色荧光蛋白基因的表达，siRNAA、siRNAB和siRNAC的抑制率分别为68．4％、72．6％、75．6％；siRNA＋siRNAB、siRNB＋siRNAC和siRNA＋siRNAc的抑制率分别为91．8％、87．2％、92．4％；siRNA＋siRNAB＋siRNAC的抑制率最高，为95．7％。结论多种siRNA对HCV5’UTR区具有干扰作用，组合使用效果更好。     

联合靶向小干扰RNA对疱疹病毒2感染的体外抑制作用

目的 探讨联合靶向特异性小干扰RNA(siRNA)对疱疹病毒(HSV)2的体外特异抑制作用.方法 将体外合成的靶向HSV-2编码包膜糖蛋白gB的UL27.2基因、靶向DNA结合蛋白UL29.2基因的siRNA和该两种联合靶向特异性siRNA制剂,共转染Vero细胞并感染HSV-2,观察靶基因的表达情况、Vero细胞病变、空斑减数实验和子代病毒滴度并进行各组间比较:结果特异性UL27.2siRNA、UL29.2 siRNA和联合siRNA转染Vero细胞后,均能不同程度抑制各HSV-2临床株感染所导致的细胞病变,对病毒增殖抑制率分别为63.9%、86.7%和93.3%.实时定量PCR检测各组siRNA分别对UL27.2和UL29.2两个基因的表达,结果显示UL27.2 siRNA和UL29.2 siRNA对各自的靶向基因均有抑制,而联合靶向siRNA制剂对两个基因的抑制率最高.结论 联合靶向特异性siRNA制剂能有效抑制HSV-2的感染和复制.     

MTT与HOECHST染色法检测膜联蛋白A7基因沉默对Hela细胞的影响

目的　探讨膜联蛋白A7（ANXA7）低表达对人宫颈癌细胞系Hela细胞增殖和凋亡的影响。 方法 　(1)体外培养Hela细胞,应用免疫组化和Western blot鉴定细胞膜联蛋白A7的表达,Western blot鉴定siRNA干扰对膜联蛋白A7表达的抑制效果;(2) MTT实验检测siRNA抑制膜联蛋白A7的表达后对Hela细胞增殖情况的影响;(3)激光共聚焦检测siRNA抑制膜联蛋白A7的表达后对Hela细胞凋亡情况的影响。 结果　(1)免疫组化和Western blot结果均显示Hela细胞内有膜联蛋白A7的表达。siRNA干扰效率的检测显示：siRNA干扰组与阴性对照组、空白对照组比较膜联蛋白A7的表达明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;(2) MTT实验显示：siRNA干扰组与阴性对照组、空白对照组比较细胞增殖速度无显著性差异（P>0.05）;(3)激光共聚焦检测结果显示：与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA干扰组细胞凋亡率显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论　膜联蛋白A7的低表达可促进人宫颈癌细胞系HeLa细胞的凋亡。     

Inhibition of gene expression directed by small interfering RNAs in infectious bronchitis virus

In this study, fourteen small interfering RNAs (siRNAs) were synthesized for targeting of coding gene sequences, specific 5'-leader sequence of mRNA and 3'-end sequence of the Infectious bronchitis virus (IBV) genome. The expression of viral genes in Vero-E6 cells was detected by real-time PCR. Obtained results indicated that the majority of siRNAs could effectively inhibit the expression of viral genes. The inhibition effect of siRNAs significantly differed among various genes and sites on the virus genome.     

Comparison of inhibitory efficacy of short interfering RNAs targeting different genes on Measles virus replication

RNA interference (RNAi)-based short interfering RNAs (siRNAs) targeting the viral genes and the host cellular genes have been used to suppress Measles virus (MV) replication in vitro. In order to select suitable target genes and highly effective target sites for developing effective RNAi-mediated anti-MV therapy, in this study, nine short hairpin RNA (shRNA) expression vectors, which expressed siRNAs targeting the host celluar Rab9 GTPase gene, the viral large protein (L) gene and nucleoprotein (N) gene, respectively, were constructed and used to compare their ability to inhibit MV replication in Vero-E6 cells. The results showed that nine siRNAs targeting different genes exhibited different inhibitory efficacy on MV replication in vitro (about 23-94%), which could last at least 168 h post-infection. Of the nine siRNAs, R2, L1 and N2 more effectively decreased MV replication by over 90%. Furthermore, inhibitory efficacy on MV replication were increased and reached almost 100% when cells were transfected with pR2, pL1 and pN2 together. These results emphasis the importance of selecting suitable siRNA target sites for developing siRNAs-based drug therapy for MV, and demonstrate the potential of combination of siRNAs targeting different genes as a therapeutic approach to treat MV infection.     

应用RNA干扰技术抑制K562细胞BCR-ABL基因表达及诱导细胞凋亡

目的运用RNAi技术,设计针对BCR-ABL基因融合位点的。iRNAs,研究其干扰后细胞变化。方法针对BCR-ABL基因的融合位点设计siRNAs,用脂质体法转染K562细胞,进行MTY法、RT-PCR及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果转染组与对照组相比细胞增殖减少,BCR-ABL mRNA表达量降低,并有明显的细胞凋亡。结论运用RNAi技术,可以有效地抑制BCR-ABL的表达,诱导细胞凋亡,为白血病的分子机制研究和基因治疗奠定基础。     

沉默survivin基因表达对人宫颈癌hela细胞恶性行为的影响

目的 研究小于扰BNA(small interfering RNA,siRNA):抑制survivin基因的表达对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响.方法 根据survivin基因设计序列特异性的siRNA(survivin-siRNA).在脂质体介导下转染Hela细胞,Western blot方法检测survlvin蛋白...     

人重构型caspase-6基因在Hela细胞中的诱导表达

目的：将重构型caspase-6分子（RCasp-6）克隆入可诱导真核表达载体pIND中，经蜕皮激素类似物诱导探讨其对细胞凋亡的促进作用。方法：用PCR扩增RCasp-6基因，并克隆入真核表达载体pIND中。以重组体转染Hela细胞系，蜕皮激素类似物诱导。RCasp-6基因的表达产物采用免疫细胞化学染色检测。HE染色观察转染细胞的形态变化，并计数细胞绘制生存曲线。结果：成功地构建了RCasp-6基因的可诱导真核表达载体。转染的细胞经蜕皮激素诱导后，细胞形态异常。转染了RCasp-6基因的细胞固缩同时很多细胞死亡。结论：RCasp-6基因具有促进细胞死亡的作用。