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1.
pcDNA3.1^+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定 总被引:2,自引:2,他引:0
目的 克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3-1^ -HIF-1α。方法 以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ ,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1^ -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果 扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ ;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1^ -HIF-1α。结论 成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1^ -HIF-1α并证明其能在真核细胞内表达。 相似文献
2.
目的:构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法:用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM—T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论:RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3.1—MAGE—1构建成功。 相似文献
3.
小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建 总被引:6,自引:0,他引:6
目的 检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法 设计寡核苷酸探针。应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切取所需目的片段.利用分子克隆技术与pcDNA3.1/MycHisC(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果 原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列(NM—138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3.1.mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100%同源。结论 小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在mCD99L2基因,采用RT-PCR和T.A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3.1.mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。 相似文献
4.
目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌(HCC)组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒.重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。 相似文献
5.
目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3. 相似文献
6.
目的 克隆大鼠Bcl-2基因(B cell lymphoma)全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。 相似文献
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诱导型一氧化氮合酶基因真核表达载体的构建 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 构建含有人诱导型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3-iNOS。方法 采用分子生物学技术,以Hind Ⅲ和XbI I双酶切pSPORT-iNOS,电泳回收3.96kb编码人iNOS cDNA序列.克隆入真核表达栽体pcDNA3的Hind Ⅲ和XbI I位点。结果 重组真核表达载体pcDNA3-iNOS经酶切鉴定证明iNOS基因正向插入真核表达载体中,用人iNOS基因特异性引物,PCR分析重组质粒和进行碱基序列的测定均证明重组质粒中含有人iNOS基因序列。结论 构建的真核表达栽体携有人iNOS cDNA序列,并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加接信号和neo标志基因,具有转染多种哺乳类细胞通用性,可用于iNOS基因的真核表达及调控的研究。 相似文献
8.
目的构建真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。 相似文献
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目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA,构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA,采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段,并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒,双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1.1kb的产物,连接重组后经双酶切筛选阳性克隆,DNA测序验证,确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体,为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。 相似文献
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人CD134L基因真核细胞表达载体的构建、鉴定及序列分析 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 构建人CD134L真核细胞表达载体并对其进行序列分析。方法 采用PCR方法扩增人CD134L基因cDNA,先后经BamHI和XhoI酶切并纯化,再定向克隆到高效真核表达载体pcDNA3中,构建成pcDNA3-CD134L,通过CR扩增、双酶切后琼脂糖电泳分析及序列测定进行鉴定。结果 pcDNA3-CD134L经BamHI和XhoI双酶切后出现两条目的条带、经PCR扩增出现单一目的条带、序列测定结果与Genebank的序列完全一致。结论 成功地克隆了人CD134L基因cDNA,构建了真核表达载体,本研究为探讨CD134L与淋巴细胞活化的关系、信号传导机制及其临床免疫性疾病的治疗打下了基础。 相似文献
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人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。 相似文献
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Objective: To generate eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-BACE and obtain its transient expression in COS-7 cells and high expression in the neuroblastoma SK-N-SH cells. Methods: A 1503 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of human neuroblastoma by RT-PCR method and cloned into plasmid pcDNA3.1. The vector was identified by digestion with restriction enzymes BamHI and XhoI and sequenced by Sanger-dideoxy:mediated chain termination. The expression of BACE gene was detected by immunocytochemistry method. Results: The results showed that the cDNA fragment included 1503 bp total coding region. The recombinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3.1-BACE was constructed successfully, and the sequence of insert was identical to the published sequence. The COS-7 cells and the neuroblastoma SK-N-SH cells transfected with the pcDNA3.1-BACE plasmid expressed high level of BACE protein in cytoplasm. Conclusion: The recombinant plasmid pcDNA3.1-BACE can provide very useful tool for researching the mason of Alzheimer's disease and lays the important foundation for preventing the AD laterly. 相似文献
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目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究. 相似文献
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目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。 相似文献
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目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。 相似文献
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[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒。[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体。[结论]pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础。 相似文献
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目的:克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法:用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1(+)的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1(+)-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果:阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论:成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1(+)-NS1。 相似文献
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目的构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体。方法从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,应用RT—PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,将其插入pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒。进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,再利用pcDNA3.1-hIgG1Fc重组载体构建pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,并经PCR、限制性酶谱分析和测序分析进行证实。结果构建的pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,经PCR、限制性酶谱分析和测序分析,证实获得的hIgGl1Fc段及mOX40胞外段基因均与国际生物信息资源库GenBank登录的相应基因序列完全一致。结论成功构建PCD—NA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,为OX40分子的进一步研究奠定良好的基础。 相似文献
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目的: 克隆家兔胆固醇酯转移蛋白(CETP) 基因,构建其真核表达载体,研究CETP基因的结构与功能,为进一步研究CETP在动脉粥样硬化(As)中的作用机制提供参考。方法: 采用TRIzol提取家兔肝组织总RNA,采用RT-PCR 方法将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用LA Taq酶进行PCR扩增,克隆出CETP基因,将CETP cDNA片段克隆至pMD19-T载体上,对重组的CETP- pMD19-T测序后,登录GenBank进行序列比对,利用nnPredict软件分析预测CETP的二级结构。将CETP
cDNA片段克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。结果:测序及序列比对显示与M27486基因序列98%相符;家兔CETP基因cDNA全长1 659 bp,编码序列(CDs区)长1 494 bp,编码498个氨基酸。CETP的二级结构以α螺旋结构为主,相对分子质量为142119.4, pI为4.91。结论: 成功克隆了家兔CETP基因,并成功构建了其真核表达载体,明确了CETP的二级结构。 相似文献