IL—6在人骨髓瘤细胞U266中的信号转导途径与细胞增殖促进效应之间的关系

目的：研究人骨髓瘤细胞U266中IL－6信号转导途径激活与细胞增殖促进效应之间的关系。方法：首先分别采用MTT、凝胶阻滞电泳（electrwophoretic mobility shift assay, EMSA）和免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）方法观察IL－6对U266细胞生长的影响及两条IL－6信号转导途径在U266细胞中的诱导激活状态;然后采用化学试剂处理或转基因方法观察信号途径活化状态变化与IL－6效应变化之间的关系。结果：IL－6可明显促进U266细胞增殖,并在不同剂量下诱导JAK／STAT和Ras/NF-IL-6途径活化;Ras途径活化被特异性上调和下调时,IL－6对U266细胞的生长促进效应分别得以增强和减弱;而JAK／STAT途径活化受抑时,IL－6的促细胞生长效应反而加强。结论：Ras途径的诱导激活介导了IL－6对U266细胞的增殖促进效应;而JAK／STAT途径活化介导了与IL－6促细胞增殖相反的生物学效应。     

不同反应靶细胞中IL-6对STAT1激活的比较

目的 :探讨不同反应靶细胞中白细胞介素 6 (IL 6 )对信号转导子与转录激活子 1(STAT1)的激活。方法 :利用抗STAT1和抗酪氨酸磷酸化STAT1的抗体 ,进行免疫印迹分析。结果 :IL 6可促进 7TD1和TF1细胞生长 ,但在这两种细胞中对STAT1的酪氨酸磷酸化水平没有明显影响。M 1、R2和U937细胞在IL 6诱导下生长停止并向巨噬细胞方向分化 ,而IL 6在这 3种细胞中均可激活STAT1,且激活效应有剂量与时间依赖性。结论 :STAT1的活化可能与抑制效应有关。我们的数据有助于解释为什么IL 6在不同效应靶细胞中有不同的生物学效应     

Ras/MAPK/NF-IL-6信号途径在IL-6促7TD1细胞增殖中的作用

为探讨IL 6促进 7TD1细胞增殖的机制 ,本研究采用凝胶阻滞电泳方法比较IL 6对核因子STAT3(代表JAK STATs通路 )、NF IL 6 (代表Ras/MAPK/NF IL 6通路 )的激活方式 ,以反义寡核苷酸 (ASODNs)阻断IL 6对核因子的激活 ,检测ASODNs对IL 6效应的影响 ,并采用MEK特异性抑制剂PD0 980 5 9阻断Ras/MAPK通路的激活 ,观测Ras/MAPK通路的功能意义。结果发现STAT3与NF IL 6都可被低剂量IL 6激活 ,但NF IL 6激活后持续的时间比STAT3长。STAT3ASODN对IL 6效应的影响很弱 ,而NF IL 6ASODN可显著拮抗IL 6的促增殖作用。PD0 980 5 9的作用同NF IL 6ASODN相似。这些结果说明在 7TD1细胞中 ,Ras/MAPK/NF IL 6途径介导IL 6的促增殖信号。     

IL—6诱导人骨髓瘤细胞表达CD45

目的：研究髓瘤细胞系Sko-007中IL－6信号途径活化与CD45诱导表达之间的关系。方法：首先采用凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assay,EMSA)方法检测参与IL－6信号转导功能的转录因子STAT3和NF－IL－6在Sko-007细胞中的诱导活化情况并确定该细胞中IL－6信号转导途径;进而采用RT－PCR和FACS方法检测CD45mRNA和蛋白在IL－6刺激作用下的诱导表达情况;最后采用以上两种方法观察CD45诱导表达与I－6信号途径活化之间的关系。结果：①两种主要的IL－6信号转导途径JAK／STAT和Ras/NF-IL-6都能够在Sko-007细胞中诱导激活;②CD45mRNA和蛋白的表达量在IL－6刺激作用下明显增加;③STAT3反义表达质粒导入Sko-007细胞后JAK／STAT途径活化信号减弱,同时CD45mRNA诱导表达量下降。结论：Sko－007细胞中JAK／STAT途径的诱导激活介导了CD45的诱导表达。     

不同反应靶细胞中IL—6对STATl激活的比较

探讨不同反应靶细胞中白细胞介素6(IL—6)对信号转导子与转录激活子1(STATl)的激活。方法：利用抗STATl和抗酪氨酸磷酸化STATl的抗体，进行免疫印迹分析。结果：IL—6可促进7TDl和TFl细胞生长，但在这两种细胞中对STATl的酪氨酸磷酸化水平没有明显影响。M1、R2和U937细胞在IL—6诱导下生长停止并向巨噬细胞方向分化，而IL—6在这3种细胞中均可激活STATl，且激活效应有剂量与时间依赖性。结论：STATl的活化可能与抑制效应有关。我们的数据有助于解释为什么IL—6在不同效应靶细胞中有不同的生物学效应。     

酪氨酸蛋白激酶JAK1 在IL-6诱导JAK/STAT 途径活化中的作用

目的 酪氨酸蛋白激酶JAK1和转录因子STAT3为参与IL－6诱导的JAK／STAT信号转导途径的两种主要的信号蛋白分子。本研究试图揭示JAK1在JAK／STAT途径诱导活化中的作用。方法 分别采用凝胶阻滞电泳（EMSA）和免疫沉淀（IP）法观察IL－6刺激作用下STAT3和JAK1在3种骨髓瘤细胞系（XG－7，KM－3和Sko-007)中的诱导活化状态。采用RTPCR和Western-blot法检测这两种信号蛋白分子在以上3株靶细胞中的表达情况。结果 尽管SAT3在3株靶细胞中都能够正常表达，但只有Sko-007细胞中出现IL－6刺激作用下STAT3的诱导活化。在XG－7细胞中，既没有检测到JAK1的表达，也没有观察到JAK1的活化。尽管JAK1在KM－3细胞中能够正常表达，但不能被IL－6诱导激活。Sko-007细胞中则同时出现JAK1的表达及IL－6刺激后的诱导活化。结论 JAK1的正常表达和激活是IL－6刺激作用下JAK／STAT信号转导途径在骨髓瘤细胞中诱导活化的前提条件。     

IL—4、IL—12、IL／6STAT／SOCS途径对Th细胞分化调节机制的研究进展

Th细胞分化为Th1和Th2细胞是受多种细胞因子调控的。已有研究:IL－4、IL－12和IL／6通过STAT／SOCS信号途径经对Th细胞的分化进行调节。IL－12／STAT4／SOCS3使CD4^ 和Th2和Th1分化和极化，IL－4／STAT6／SOCS1使Th0B向Th2分化。IL－6则通过STAT3可以上调CD4^ T细胞SOCS－1的表达，这是由于IL－6干扰IFN－γ受体的信号转导，阻断了IFN－γ对IFN－γ基因的自我调节，因此实现了IL－6对Th1细胞的负性调控。据此认为IL－6启动CD4^ T细胞分化与抑制CD4^ T分化为Th1细胞是两种独立的分子机制，它在平衡Th1/Th2的免疫反应中起着重要的调节作用。     

IL-6表达增高及TNFα下调参与bcl-2反义寡脱氧核苷酸诱导的细胞凋亡的调控

目的 探讨bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,AS-PS-ODN)诱导细胞凋亡的调控机理。方法 合成bcl-2 AS－PS－ODN作用于小细胞肺癌细胞株NCI－H446，流式细胞仪DNA倍体分析和脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡；多重半定量逆转录－聚合酶链反应检测bcl-2 AS－PS－ODN处理前后bcl-2，c-myc,survivin,bax,s100A2,TNFα，TGFβ1及IL－6等基因mRNA表达的变化。结果 bcl-2 AS－PS－ODN能够诱导NCI－H446细胞凋亡，随着bcl-2 mRNA水平的下降，IL－6表达增高72．71％（P＜0．05），TNFα表达下调65．90％（P＜0．05），而c-myc,survivin,bax,s100A2,TGFβ1等基因的表达无明显变化。结论 IL－6表达增高及TNFα下调参与bcl-2反义寡脱氧核苷酸所诱导的细胞凋亡的调控。     

STAT3反义表达载体的构建、稳定表达及对M1白血病细胞表型的影响

目的 探讨JAK／STATs通路在IL－6信号转导中的功能。方法 将含起始密码子在内的约1．2kbSTAT3cDNA反向插入到真核细胞表达载体pcDNA3中,采用电穿孔法重组质粒导入到M1小鼠急性髓系白血病细胞中,进行G418筛选。结果 G418筛选出抗性克隆后,基因组DNAPCR扩增表明STAT3反义基因片段已导入M1细胞中并在基因组中整合。STAT3反义RNA不影响M1细胞的生长动力学特征,但可显著拮抗IL－6诱导的STAT3激活,并拮抗IL－6对M1细胞的生长抑制效应。结论 STAT3反义RNA能够在M1细胞中稳定表达,成为进一步研究JAK／STATs途径功能的新模型。     

Ras/NF-IL-6信号转导途径介导人骨髓瘤细胞KM-3中的IL-6生物学效应

目的　研究人骨髓瘤细胞KM 3中的IL 6信号转导途径与生物学效应之间的关系。方法　分别采用MTT、凝胶阻滞电泳 (electrophoreticmobilityshiftassay ,EMSA)、免疫沉淀方法检测IL 6对KM 3细胞生长状态的影响、参与IL 6信号传递功能的转录因子以及蛋白激酶在KM 3细胞中的诱导激活状态。结果　IL 6可明显促进KM 3细胞增殖 ,并可引发Ras/NF IL 6信号转导途径活化 ,但Jak/STAT信号途径没有激活。结论　Ras/NF IL 6信号转导途径介导了IL 6对KM 3细胞的生长促进作用     

用于筛选人IL-6受体拮抗剂生物学活性的M1细胞模型的建立

目的 建立用于筛选人IL－6受体拮抗剂的M1细胞模型，并在该细胞模型上筛选具有人IL－6受体拮抗活性的化合物。方法 用反转录PCR，检测M1细胞系上IL－6Rα/gp130mRNA的表达情况，然后应用MTT比色法检测在体外液体培养中，M1细胞对rhIL-6的反应性和多种小分子化合物对rhIL-6的拮抗活性。结果 M1细胞有高丰度的IL－6Rα/gp130 mRNA表达；并对rhIL-6具有较为灵敏的反应性；经过113个化合物的筛选，发现两个化合物能部分地拮抗人IL－6受体的生物学活性。结论 以M1细胞作为筛选人IL－6受体拮抗剂的细胞模型，筛选出具有一定人IL－6受体拮抗活性的两个化合物。     

IL-6相关转录因子在人骨髓瘤细胞系IL-6信号转导中的作用

为研究IL 6在人骨髓瘤细胞系的信号传递过程中IL 6相关转录因子的活化状态。本研究在IL 6刺激前后提取人骨髓瘤细胞Sko 0 0 7的细胞核蛋白 ,分别以APRE、NF IL 6/ATF、NF κB、CRE、AP 1作为探针 ,采用凝胶阻滞电泳 (electro phoret icmobilityshiftassay ,EMSA )方法检测IL 6刺激前后Sko 0 0 7细胞中与以上DNA反应成分对应的转录因子的活化情况。结果显示 ,NF IL 6和NF κB在正常培养的Sko 0 0 7细胞中组成性激活 ;IL 6刺激前后STAT3和NF IL 6的活化状态有明显改变 ;CREB和NF κB的活化状态无明显变化 ;AP 1的激活情况与细胞的生存状态有关。表明在Sko 0 0 7细胞中与IL 6信号传递密切相关的转录因子是STAT3和NF IL 6;对细胞本身生存至关重要的转录因子是NF IL 6和NF κB。     

睾丸局部感染时Sertoli细胞IL-1、IL-6 mRNA的表达

目的；研究大鼠Sertoli细胞在抗感染中的免疫调节作用。方法：以溶脲脲原体（ureaplasma urealyicum,UU)和致病性大肠杆务直接注入大肠膀胱模拟上行性感染的途径，分别在1，2和3周处死大鼠，从大鼠睾丸组织分离获得高纯度的Sertoli细胞，然后抽提总RNA，用RT－PCR方法比较正常组与UU感染组，致病性大肠杆菌组之间IL－1，IL－6 mRNA表达的差异。结果：与正常组相比，UU感染后，其IL－1 mRNA在1，2周时升高，3周时下降，IL－6在1，2周时下降，3周时升高；而致病性大肠杆菌感染后，其IL－1 mRNA在1，2周时均升高，3周下降；IL－6在1周时升高，2周时下降，3周又升高，结论：大鼠Sertoli细胞在抗感染免疫中，可能IL－1，IL－6的表达来发挥免疫调节作用。     

两条IL-6信号转导途径在人骨髓瘤细胞系U266中的相互拮抗作用

目的 研究人骨髓瘤细胞系U266中白细胞介素6（IL－6）信号转导途径及彼此之间的相互调控方式。方法 首先采用凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assay,EMSA)方法观察分别参与两条IL－6信号转导途径的转录因子STAT3和NF－IL－6在U266细胞中的诱导激活状态并确定该细胞中的IL－6信号转导通路;继而采用转基因或化学试剂处理方法,特异性上调或下调其中一条IL－6信号途径的化,并同时观察另外一信号途径的激活状态。结果 1、以上两种转录因子分别参与的IL－6信号转导途径－－JAK／STAT和Ras/NF-IL-6,它们都能够在U266细胞中诱导激活;2、在高剂量IL－6（1－100ng/ml）刺激范围之内,一条IL－6信号途径活化水平的升高可同时导致另一条信号途径活化水平的下降。结论 在一定IL－6刺激剂量范围内,U266细胞中两条IL－6信号途径的诱导激活存在着相互拮抗作用。     

衰变加速因子在Jurkat细胞增殖及分泌IL—2中的作用

目的 研究衰变加速因子对CD3阳性与阴性Jurkat细胞的增殖效应及对IL－2分泌的影响。方法 应用MTT比色实验观察交联DAF单抗DG3与固相化抗CD3联合作用对CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞增殖效应;IL－2依赖CTLL^3H-TdR掺入实验检测CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞IL－2的分泌;细胞ELISA检测CD3阳性与CD3阴性Jurkar细胞IL－2R的表达。结果 交联DG3可协助促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的增殖效应和IL－2分泌,并可引起IL－2Rα链表达增加,此作用可被Src家族酪酸激酶抑制剂PP2所抑制,而对CD3阴性Jurkat细胞无此作用。结论 衰变加速因子可协同促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的刺激增殖效应、IL－2分泌及IL－2R表达增加。     

重组人IL-6D24-PE40外毒素融合蛋白的构建及其生物学效应

目的 构建重组人白细胞介素6－绿脓杆菌外毒素融合蛋白IL－6D24－PE40,以选择性杀伤高表达IL－6受体（IL－6R）的肿瘤细胞和白血病细胞。方法 采用重叠延伸的基因融合技术将N－末端缺失24个氨基酸的重组人白细胞介素6（IL－6D24）cDNA与缺失细胞结合区的绿脓杆菌外毒素PE40基因进行融合,构建IL－6D24－PE40融合基因。利用HB101／pBV220表达系统,实现了IL－6D24－PE40融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,经MonoQ柱进行层析纯化,采用MTS法检测细胞毒活性。结果 IL－6D24－PE40融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到40％－60％。包涵体蛋白经分离、复性及纯化得到纯度＞95％的融合蛋白。Western blot证明,纯化的融合蛋白与IL－6抗体及PEA抗体均发生特异性结合。细胞毒活性检测证实,IL－6D24－PE40融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL－6R的U937细胞,ID50约为250ng/ml,而对不表达IL－6R的CEM细胞无杀伤作用。结论 IL－6D24－PE40融合蛋白能够选择性杀伤高表达IL－6R的靶细胞,有希望成为导向治疗高表达IL－6／IL－6R系统的某些白血病和其他肿瘤的新型导向药物。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进IL-8分泌

目的：探讨EB病毒LMP1分子致瘤机制，在已证实鼻咽癌细胞系中LMP1有效激活NF－κB 或AP－1的基础上，对LMP1是否通过NF－κB 或AP－1促进IL－8分泌进行探讨。方法：以稳定表达LMP1及其3种突变体，空白载体的鼻咽癌细胞系[HNE2-LMP1,NHE2-MLP1(1-185),HNE2-LMP1(1-231),HNE2-LMP1Δ187-351和HNF3－pSG5]及antisense-LMP1处理的HNF2－LMP1鼻咽癌的细胞系为材料，将IL－8报道质粒瞬时导入这些细胞系中，通过测定luciferase值以反映LMP1是否促进IL－8转录；将mut AP-1/IL-8-luc或IκB α（S32A／S36A）表达质粒导入HNE2－LMP1细胞系中，比较其IL－8报道活性，以确定LMP1是否通过AP－1或NF－κB 诱导IL－8转录；利用ELISA方法测定HNE2－LMP1，HNE2－pSG5,anti-sese-LMP1处理的HNE2－LMP1鼻咽癌细胞系中的IL－8浓度，进一步从蛋白水平上确定LMP1是否促进IL－8分泌。结果：与HNE2－pSG5相比，在HNE2－LMP1，HNE2－LMP1Δ187－351和HNE2－LMP1（1－231）细胞系中IL－8报道活性分别升高了原来水平的11．5，8．6和3．4倍，而HNE2－LMP1（1－185）对IL－8报道活性不影响。在HNE2－LMP1细胞系中IL－8蛋白水平提高了17．4倍，而antisense-LMP1则使HNE2－LMP1细胞的IL－8报道活性及蛋白水平分别下降到原来水平的18．3％和9．2％，导入mutAP-1/IL-8-luc或IκBα（S32A／S36A）的HNE2－LMP1细胞中IL－8报道活性分别下降到原有水平39％和26％，结论：鼻咽癌细胞系中LMP1可能通过NF－κAP－1促进IL－8表达。     

大鼠IL-6受体基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获取大鼠IL－6受体（IL－6R）的基因并高效表达。方法：用PCR技术，从正常成年大鼠脑的cDNA文库中，获得编码IL－6R基因的序列。测序后，通过PCR扩增和基因重组，分别构建IL－6R基因全长和羧基端部分编码序列的表达载体，并导入大肠杆菌DH5α中，通过IPTG诱导表达重组融合蛋白。对表达的羧基端序列编码的融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化。结果：获得正常成年大鼠I-6R(98-1493位）的基因，测序结果与已发表的基因序列相一致。重组蛋白以包涵体的形式进行表达。经SDS－PAGE分析，在相对分子质量（Mr)为74000和43000处，各有1条特异的蛋白带。对羧基端基因表达的包涵体形式的蛋白进行变性、重折叠及纯化后，得到了庙纯度融合蛋白。结论：成功地克隆正常成年大鼠IL－6R基因，并在E.coli DH5α中高效表达，为进一步制备抗IL－6R抗体和进行原位分子杂交研究创造了条件。     

未知酪氨酸激酶对骨髓瘤细胞中IL—6诱导Ras／MAPK／NF—IL—6途径活化的调节作用

目的 研究两条主要的IL-6信号转导途径-JAK/STAT和Ras/MAPK/NFG-IL-6在人骨髓瘤细胞系KM-3中的诱导活化情况和调控机制。方法 首先分别采用凝胶阻滞电泳（EMSA）和免疫沉淀（IP）方法检测参与 IL-6信号转导功能的转录因子（STAT3、NF-IL-6）和蛋白激酶（JAK1、MAPK）在KM-3细胞中的诱导活化情况。然后采用特异性酢氨酸蛋白激酶 抑制剂Genistein作用于KM-3细胞,观察酢氨酸磷酸化作用对KM-3细胞中IL-6信号转导功能的影响。结果 IL-6刺激后,KM-3细胞中只出现了Ras/MAPK/NF-IL-6信号转导途径的诱导激活,而JAK/STAT途径则不参与IL-6在KM-3细胞中的信号转导功能。Gwenistein的作用可明显抑制Ras/MAPK/NF-IL-6途径的活化。结论 一种目前尚无法确定的非JAK1酪氨酸蛋白激酶可参与并调节Ras/MAPK/NF-IL-6信号转导途径在KM-3细胞中的诱导活化。