核因子κB受体活化因子在破骨细胞培养中表达时相的研究

目的本研究旨在观察核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factorκB,RANK)在破骨细胞培养中的表达时相。方法采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophages colony-stimulating factor,M-CSF)及核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)作为分化诱导因子,诱导大鼠骨髓造血干细胞分化为破骨细胞,RT-PCR检测诱导分化不同时间点(0,3,5,7 d)破骨细胞膜表面RANK mRNA的表达水平。结果 RT-PCR检测结果显示RANK mRNA表达在培养0 d为1.20±0.47,3 d为1.52±0.58,5 d为1.59±0.57,7 d为1.69±0.51。诱导分化后表达量随培养时间延长而增加,各时间点与培养前比较均有统计学差异(P<0.05)。结论在破骨细胞分化的各个时间段RANK均有表达,是体外研究不同因素影响破骨细胞分化及活化的一个特异性指标。     

细菌脂多糖对破骨细胞发育的抑制作用研究

目的:寻找调节破骨细胞分化成熟的途径.方法:采用细胞核因子-KB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)体外诱导骨髓单核细胞分化为成熟破骨细胞的培养方法,在培养体系中加入不同浓度细菌脂多糖(LPS),用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察成熟破骨细胞形成情况;实时定量RT-PCR检测LPS处理后破骨细胞前体表达核因子-κB受体活化因子(RANK)和M-CSF受体mRNA.结果:LPS不能刺激骨髓单核细胞形成TRAP阳性的破骨细胞;减少了RANKL诱导的TRAP阳性破骨细胞形成数量;0.2ng/ml和20ng/ml LPS降低了30％和90％RANKL诱导TRAP阳性细胞形成数量(与未加LPS组比较,均P＜0.01);降低破骨细胞前体表达RANK和M-CSFR mRNA.结论:LPS能够抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟,抑制破骨细胞前体表达RANK和M-CSFR,能够阻断其向成熟分化.     

壮骨止痛方对骨质疏松大鼠核因子κB受体活化因子配体和骨保护素的影响

目的 探讨壮骨止痛方对骨质疏松大鼠核因子κB受体活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）、核因子κB受体活化因子配体（receptoractivator of NF-κB ligand，RANKL）和骨保护素（osteoprotegrin，OPG）表达的影响。方法 将实验动物分为假手术组、模型组、壮骨止痛方高剂量治疗组、壮骨止痛方低剂量治疗组、雌二醇组5组，用酶联免疫免法测定大鼠血清中OPG、RANKL的水平。结果 模型组大鼠血清OPG降低、RANKL水平升高，经壮骨止痛方药物干预后，大鼠血清OPG水平明显下降、RANKL水平明显下降。结论 壮骨止痛方药物可以降低大鼠血清RANKL/OPG的比值，激活RANKL/RANK/OPG信号系统，达到预防治疗骨质疏松的作用。     

改良的成年大鼠骨髓源性破骨细胞诱导培养体系

为在短时间内获得更多的破骨细胞,在近几年国内成年大鼠骨髓源性破骨样细胞培养的基础上加以改良,以建立一个简便、有效的诱导培养体系.收集3月龄SD大鼠股骨骨髓细胞悬液,置入含有20%胎牛血清、1,25(OH)2VitD3的培养液中.将培养体系分为4组A组为对照组,未加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和地塞米松(Dexamethasone);B组加入GM-CSF;C组加入Dexamethasone;D组加入GM-CSF和Dexamethasone,观察各组破骨样细胞(osteoclast-like cell,OLC)及骨陷窝形成情况,并计数比较.培养第6 d,便可见所培养细胞衍变为形态不规则、有伪足形成的多核巨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色(+),且具有骨吸收作用,符合破骨细胞的鉴定标准.D组所形成OLC及骨陷窝数目较其它3组明显增多(P＜0.01),且OLC出现较早.结果表明成功地建立了一个以1,25(OH)2VitD3、GM-CSF、Dexamethasone为诱导分化条件的培养体系.所获得破骨细胞数量多,特征明显,且培养所需时间短.     

RANKL浓度对破骨细胞形成与活性的影响

目的 探讨不同浓度RANKL对骨髓单核细胞向破骨细胞分化和活性的影响.方法 50、100和150 μg/L三种RANKL浓度诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化.抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形态并计数,抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测试剂盒检测上清中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性,骨板吸收实验检测破骨细胞骨吸收活力.结果 100 μg/L和150 μg/L RANKL浓度组在破骨细胞数量、细胞大小、核数目,抗酒石酸酸性磷酸酶活性和骨吸收率方面均明显高于50 μg/L组（P＆lt;0.01）,而100 μg/L和150 μg/L组间没有明显差异.结论 100 μg/L RANKL浓度下破骨细胞形成和活性能力强且相对较经济,是破骨细胞诱导培养的理想浓度值.     

抗风湿颗粒对胶原诱导关节炎大鼠骨保护素、核因子-κB受体激活因子配体和巨噬细胞集落刺激因子表达的影响

目的:观察抗风湿颗粒(Kangfengshi Granules,KFSG)对胶原诱导关节炎大鼠骨组织中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子-κB受体激活因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)mRNA表达的影响,探讨KFSG治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的作用机制。方法:40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)治疗组和KFSG治疗组。除正常对照组外,其余各组大鼠予以皮下注射Ⅱ型胶原诱导关节炎模型。治疗4周后,采用实时定量PCR技术检测各组大鼠骨组织中OPG、RANKL和M-CSF mRNA的表达水平。结果:造模大鼠90%出现关节炎症状。治疗4周后,模型组、CsA治疗组和KFSG治疗组与正常对照组比较,RANKL mRNA和M-CSF mRNA的表达增高,OPGmRNA的表达降低,RANKL mRNA/OPG mRNA比值亦增高,差异均有统计学意义。KFSG治疗组与模型组比较,OPG mRNA的表达水平上调,M-CSF mRNA的表达水平下调,RANKL mRNA/OPG mRNA比值下降,差异均有统计学意义。结论:KFSG治疗RA骨质破坏的分子机制可能与其上调OPG mRNA的表达、下调M-CSF mRNA的表达及降低RANKL mRNA/OPG mRNA比值有关。     

心房颤动患者血浆骨保护素、核因子κB受体活化因子配体水平及临床意义

目的探讨心房颤动患者血浆骨保护素(osteoprotegerin,OPG)及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator ofnuclear factor kappa B ligand,RANKL)水平及临床意义。方法采用酶联免疫吸附法检测40例阵发性房颤、39例持续性房颤、43例永久性房颤患者及40例窦性心律对照者血浆中OPG、RANKL水平。结果阵发性房颤组、持续性房颤组、永久性房颤组患者血浆中OPG、RANKL水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),持续性房颤组、永久性房颤组患者与阵发性房颤组相比血浆中OPG、RANKL水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而持续性房颤组、永久性房颤组患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 OPG、RANKL与房颤的发生和持续可能相关。     

β-隐黄素对大鼠正畸牙移动模型RANKL RANK OPG通路及破骨细胞形成的影响

目的:探究β-隐黄素对大鼠正畸牙移动模型核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、核因子κB受体活化因子(RANK)、骨保护素(OPG)及对破骨细胞形成的影响.方法:将大鼠按随机数表法分为:正常组、模型组、β-隐黄素低(3μg)、中(6μg)、高(12μg)剂量组,每组10只.除正常组外,其余各组建立大鼠正畸牙移动模型...     

利塞膦酸钠抑制大鼠骨髓内脂肪细胞分化及脂肪细胞核因子κB受体活化因子配体蛋白的表达

目的研究利塞膦酸钠（RIS）对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响及对骨髓内脂肪细胞来源的核因子κB受体活化因 子配体（RANKL）的调节作用,为阐明RIS抗骨质疏松的机制提供新的理论依据。方法大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导及非 成脂诱导14 d,期间以浓度梯度0、1、5、10、25 μmol/L的RIS进行药物干预,观察并计算成脂率,提取蛋白通过Western blot实验 检测RANKL蛋白表达。将24周的SD大鼠随机分成假手术组及OVX组,12周后OVX大鼠再次随机分为RIS干预组（2.4 μg/kg, 皮下注射,3次/周）及对照组。8周后行骨密度检查,并取大鼠左股骨远端骨骼标本行病理检查,观察RIS对大鼠骨髓内脂肪含 量的影响。结果体外实验发现RIS呈浓度依赖性抑制大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,并且,随着RIS浓度的升高,骨 髓内脂肪细胞RANKL蛋白的表达逐渐降低（P<0.05）。体内实验发现RIS药物干预后,OVX大鼠骨密度显著提升的同时,骨髓 内脂肪的含量明显降低（P<0.05）。结论RIS可有效抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成脂分化,降低骨髓内的脂肪含量,并通过下 调脂肪细胞RANKL的表达,抑制破骨细胞的生成和功能,这可能是RIS发挥抗骨质疏松作用的机制。     

兔骨髓基质干细胞诱导成骨的实验研究

目的:研究兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法:使用密度梯度法分离骨髓基质细胞并进行培养,传2代后运用成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠(β-Gp)、L-坏血酸(AA)进行诱导,测试骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果:形态学表明骨髓基质细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,诱导后细胞生长较前明显减慢,逐渐变为立方形、锥形或梭形。汇合时细胞呈铺石状重叠生长,进而形成“钙结节”样表现。染色及电镜观察可见细胞诱导前后有明显区别,细胞增殖吸光度(OD值)及细胞碱性磷酸酶测试表明,随着时间的延长,细胞增殖变慢,但分化能力增强(P<0.05)。结论:骨髓基质细胞作为构建组织工程骨的种子细胞在地塞米松、β-甘油磷酸、L-坏血酸诱导下成骨具有可靠的重复性。     

ODF诱导骨髓细胞向破骨细胞分化

目的:研究小鼠骨髓细胞在破骨细胞分化因子(ODF)和单核巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的诱导刺激下向破骨细胞诱导分化的新方法。方法:分离小鼠骨髓细胞,ODF、M-CSF诱导培养,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,酒石酸酸性磷酸酶(T-ACP)阳性表达。结果:小鼠骨髓细胞在ODF和M-CSF作用下,表现为长梭形和圆形细胞增多,增大。体外培养6d,有多核T-ACP阳性细胞产生。结论:小鼠骨髓细胞在ODF和M-CSF共同诱导作用下分化成破骨细胞,为体外研究破骨细胞的分化发育和功能调节提供新方法。     

枸杞多糖诱导大鼠骨髓间充质细胞向神经元样细胞转化的实验研究

①目的探讨枸杞多糖诱导骨髓间充质细胞(BMSCs)向神经细胞转化的可能机制。②方法用贴壁筛选法分离培养出贴壁生长良好的骨髓BMSCs。选取第3代细胞,当传代细胞长满瓶底的80%以上时,先用含15?S和1g/L枸杞多糖的DMEM培养基预诱导24小时,然后,用不含血清的1g/L枸杞多糖的DMEM培养基诱导。光镜下观察细胞形态;用免疫组化技术检测细胞Nes-tin、NF、GFAP的表达。③结果预诱导后,BMSCs没有变化。而经过枸杞多糖诱导后,细胞在4小时后即出现形态学上的改变,细胞变凸,立体感增强,从胞体伸出突起。免疫组化检测显示,细胞Nestin、NF染色阳性,GFAP阴性。④结论骨髓间充质细胞经过枸杞多糖的诱导可以转化为神经细胞。     

条件培养液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究*

[目的]观察乳鼠心室肌成纤维细胞条件培养液干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.[方法]分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:单纯条件培养液组(TJ)、条件培养液1组(TJ-ZY)、条件培养液2(TJ-XFK),诱导,24h后继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和α-actin mRNA的表达.[结果]免疫细胞化学结果显示单纯条件培养液诱导后的MSCs不表达心肌特异性蛋白cTnT,心复康参与组则表达.实时荧光定量(RT-PCR)结果显示各组均表达心肌分化早期基因,心复康参与组诱导后的MSCs的心肌分化早期基因表达明显高于单纯条件培养液组.[结论]微环境在MSCs向心肌样细胞的分化过程中起了重要作用,心复康能够提高MSCs向心肌样细胞的分化和特化作用.     

葡萄糖对大鼠骨髓破骨细胞RANK表达的影响

目的 观察葡萄糖对大鼠骨髓破骨细胞(Osteoclasts OC)RANK表达的影响,探讨糖尿病骨质疏松的发病机制. 方法 用M-CSF、RANKL诱导大鼠骨髓单个核细胞分化为OC,同时给予不同浓度的葡萄糖(0、5.5、15、25mmol/L)干预,通过观察OC膜表面RANK mRNA表达量来分析葡萄糖对破骨细胞的影响.结果 葡萄糖呈浓度依赖性上调 OC膜表面RANK mRNA的表达,其中高糖组培养的各时间点与其它3组相比差异有显著性( P<0.01,P<0.05).结论 高糖可促进破骨细胞的分化,可能是糖尿病骨质疏松的发病机制之一.     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

兔骨髓间充质干细胞的制备及诱导成骨的实验研究

目的:在体外原代培养兔骨髓间充质干细胞,观察兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性,为用于组织工程学的种子细胞培养提供实验基础。方法:自兔股骨、胫骨取骨髓,分离骨髓间充质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液两组进行培养,对第3代细胞进行酶动力学法碱性磷酸酶(ALP)活性检测及钙结节茜素红染色,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果:两组细胞其培养液中的ALP含量不断升高,经过两独立样本t检验,矿化液诱导组第2,6,10天的ALP水平较正常对照组均明显升高(P<0.05)。细胞表现出成骨细胞特性,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外适当的培养条件下,增殖能力很强,可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。     

交链孢酚单甲醚诱导大鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的研究

对交链孢酚单甲醚(alternariol monamethyl ether,AME)诱导大鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成进行了实验研究。结果表明,AME在体内作用48h仍可以诱发大鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成率增高。     

黄芩甙诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的研究

目的　探讨中药单体黄芩甙体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞的可行性。方法　以黄芩甙作为主要诱导剂 ,诱导成年大鼠骨髓基质细胞 6d。采用免疫细胞化学染色、蛋白质印迹 (WesternBlot)、逆转录PCR(RT PCR)法检测神经细胞、胶质细胞标记蛋白和mRNA的表达 ;原位末端标记染色评价细胞凋亡率 ;绿色荧光蛋白转染后 ,进行同种异体脑移植 ,观察诱导后细胞在脑内存活情况。结果　黄芩甙诱导 6d后 ,骨髓基质细胞形成较典型的神经细胞形态。诱导前骨髓基质细胞不表达神经细胞、胶质细胞标记蛋白和mRNA ;诱导 6h ,nestin出现暂时表达 ,诱导 6d表达神经细胞标记蛋白和mRNA ,不表达胶质细胞标记蛋白和mRNA。细胞凋亡率为 12 2 %± 2 8%。同种异体脑移植 14d ,移植物存活良好。结论　黄芩甙可以定向诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞。     

小分子化合物诱导骨髓间充质干细胞类神经分化的实验研究*

目的 探讨小分子化合物组合（Forskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）类神经分化的可行性。方法 全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,流式细胞仪鉴定细胞。培养细胞至第3代,以含有Forskolin的神经元培养基预诱导1?d,再以含有Forskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021的神经元培养基正式诱导3?d。以神经元培养基为对照组。通过观察细胞形态、免疫荧光检测、Western blotting技术对类神经分化细胞进行鉴定。结果 大鼠BMSCs以梭形细胞为主,可见长短不一的突起;经流式细胞仪鉴定,CD90、CD105表达呈阳性,而CD34和CD45表达呈阴性。诱导后,细胞有神经样形态改变,免疫荧光检测到神经元特异性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（Nestin）阳性表达,诱导3?d后Western blotting显示实验诱导组与对照组比较,NSE、Nestin和SOX1表达增多（P?<0.05）。结论 小分子化合物组合（Forskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021）可诱导BMSCs类神经分化。