鸡尾酒疗法对大鼠肝星状细胞的纤维化相关基因表达和蛋白谱的影响

目的:研究鸡尾酒疗法对大鼠肝星状细胞(HSC) 的纤维化相关基因表达及蛋白谱的变化,探讨鸡尾酒疗法抗肝纤维化作用的机制.方法:鸡尾酒作用大鼠HSC-T6 细胞株后,采用半定量RT-PCR 法检测细胞中TGF-β1、MMP-2 和TIMP-2 的mRNA 表达水平.应用SELDI-TOF-MS 技术分析HSC-T6 细胞...     

Genistein对大鼠肝星状细胞的增殖及TGF-β1、MMP-2和TIMP-2表达的影响

目的:观察4,5,7-三羟基异黄酮(Genistein)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及TGF-β1、MMP-2及TIMP-2基因表达的影响,探讨其抗肝纤维化的可能机制.方法:将体外培养的大鼠HSC-T6分别给予不同浓度的Genistein作用24 h后,用噻唑兰比色法(MTT)检测测定活细胞数,采用半定量RT-PCR法检测细胞中TGF-β1、MMP-2及TIMP-2的mRNA水平.结果:Genistein作用于大鼠HSC-T6后,活细胞数目减少,12.5、25及50 mg/L 3个作用浓度组与对照组的4值比较有显著性差异(0.306±0.0067,0.256±0.0085,0.1316±0.0049VS 0.4468±0.0299,均P<0.05).不同浓度的Genistein干预HSC-T6,MMP-2 mRNA表达水平与对照组比较均明显增强(均P<0.05);TGF-β1和TIMP-2 mRNA表达水平与对照组比较均明显降低(均P<0.05).结论:Geni Steill可能通过增强大鼠HSCMMP-2 mRNA的表达,同时抑制TGF-β与TIMP-2 mRNA的表达发挥抗纤维化的作用.     

鸡尾酒疗法对肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ表达的影响

目的:研究鸡尾酒疗法对肝纤维化大鼠肝组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)及Ⅲ型胶原(COLⅢ)表达的影响.方法:采用CCl4造成大鼠肝纤维化模型, 实验分为: 牛磺酸组、表没食子儿茶素没食子酸酯组、三羟基异黄酮组、鸡尾酒组、秋水仙碱组、模型组和正常组. 在实验的第10周末取肝组织, HE染色法观察肝组织改变, 免疫组织化学法检测肝组织中TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ的表达.结果:病理组织学观察发现各组能明显改善肝纤维化大鼠肝组织结构和肝纤维化, 免疫组织化学检测表明鸡尾酒组、三羟基异黄酮组、表没食子儿茶素没食子酸酯组、牛磺酸组的肝组织中TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ表达量与模型组比较均显著降低(TGF-β1: 2.57±0.23, 4.21±0.35, 4.93±0.21, 4.81±0.16 vs12.11±0.62, P <0.05; COLⅠ: 2.69±0.10, 4.88±0.42, 5.04±0.31, 4.79±0.29 vs 13.06±0.24,P <0.05; COLⅢ: 3.17±0.42, 5.73±0.23, 5.51±0.25, 5.24±0.18 vs 15.15±0.43, P <0.05), 并且鸡尾酒组与单一用药各组相比有统计学意义(P <0.05).结论:鸡尾酒疗法能对肝纤维化大鼠的肝脏起保护作用, 与单一用药相比更能有效降低TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ的表达, 可能具有更高的抗肝纤维化能力.     

剔毒护肝方药物血清对大鼠肝星状细胞产生Ⅰ型胶原及转化生长因子β1的影响

目的：根据剔毒护肝方抗肝纤维化的主要作用机理。方法：分离正常大鼠肝星状细胞、并传代培养。用剔毒护肝方给正常大鼠灌胃,制备药物血清,温育培养细胞。用^3H-TdR掺入法和MTT比色法观察细胞增殖,ELISA法测定上清液中Ⅰ型胶原含量,貂肺上皮细胞生长抑帛MTTI地检测培养上清液中的转化生长因子β1活性。结果：剔毒护肝方药物血清能显著4抑制肝星状细胞增殖,并能抑制肝星状细胞生成Ⅰ型胶原及产生转化生长因子β1。结论：剔毒护肝方能抑制肝星状细胞增殖和分泌转化生长因子β1,养活胶原生成,从而减弱肝星状细胞的自分泌放大效应。这可能是剔毒护肝方抗肝纤维化作用的主要机制之一。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

软肝煎药物血清对肝星状细胞/T6增殖及Ⅰ型胶原合成的影响

目的 :探讨软肝煎药物血清对肝星状细胞 (HSC) / T6的增殖、 型胶原合成的影响。方法 :实验分为大鼠血清组和药物血清两组 ,各组再分为 5 %、10 %及 2 0 % 3个浓度组 ,每组 4只大鼠。用 MTT比色法和 Alarmablue测定法评价软肝煎药物血清对 HSC/ T6的增殖抑制作用 ;用 Western blotting法和 EL ISA法评价软肝煎药物血清对 HSC/ T6合成 型胶原量的影响。结果 :在 MTT测定法中 ,与大鼠血清组相比 ,药物血清组的 5 %、10 %浓度差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ,2 0 %浓度差异有非常显著性意义 (P <0 .0 1)。在 Alarma blue测定法中 ,2 4 h时与大鼠血清相比 ,药物血清组的 2 0 %浓度差异有显著性意义 (P<0 .0 5 ) ;30 h时与大鼠血清相比 ,药物血清组的2 0 %浓度差异有非常显著性意义 (P <0 .0 1)。 EL ISA法测定的细胞上清 型胶原含量 ,药物血清组与大鼠血清组相比差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ,Western blottin法测定细胞内合成 型胶原的量 ,可知药物血清组 型胶原的含量明显少于大鼠血清组。结论 :软肝煎不仅能抑制 HSC的增殖 ,而且能抑制 HSC合成 型胶原的量 ,从而提示软肝煎有很好的抗肝纤维化作用。     

褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠肝星状细胞透明质酸、Ⅲ型前胶原分泌及Ⅰ型胶原mRNA表达的抑制作用

本研究在自身免疫性肝炎（AIH）大鼠模型肝星状细胞培养过程中加入褪黑素（MT）,检测培养上清中透明质酸（HA）和Ⅲ型前胶原（PCⅢ）的含量,并采用RT—PCR法观察MT对肝星状细胞（HSC）表达Ⅰ型胶原（colⅠ）mRNA的影响。     

PDGF-BB对肝星状细胞表达MMP-2及TIMP-1的影响

目的：探讨血小板衍生生长因子－BB（PDGF－BB）对体外培养大鼠肝星状细胞（HSC）表达基质金属蛋白酶－2（MM－2）及金属蛋白酶组织抑制因子－1（TIMP－1）的影响。方法：原位灌流分离HSC，体外培养激活，用PDGF－BB干预，采用半定RT－PCR方法检测各组MMP－2、TIMP－1 mRNA的表达情况。结果：PDGF－BB干预组TIMP－1 mRNA的表达较对照组明显增强（P＜0．01），且随着干预时间的延长其表达逐渐增强（P＜0．01）；而PDGF－BB干预组MMP－2表达与对照组无明显差异（P＞0．05）。结论：PDGF－BB促进肝纤维化与其引起HSC表达TIMP－1增强有关。     

丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响

肝纤维化的发生机制主要是肝内细胞外基质（ECM）合成与降解失衡，表现为ECM大量沉积，肝星状细胞（HSC）在此过程中起关键作用。在肝纤维化恢复期，HSC的减少不是由于其表型从活化状态向静息状态转变，而是由于细胞凋亡的结果。本研究采用猪血清腹腔注射诱导免疫性肝纤维化大鼠模型，通过对结蛋白和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色及TUNEL法来观察丹芍化纤胶囊对HSC增殖、活化和细胞凋亡的影响。     

大鼠肝星状细胞转化生长因子β3/β1 mRNA比值与Ⅰ型胶原合成的关系

转化生长因子β1(TGF β 1)是激活肝星状细胞(HSC)并促进其胶原合成的最重要因子.TGF β 3被认为具有抗组织纤维化的功能.Carrington等[1]研究提示:TGF β 1与TGF β 3的比值是纤维化发生程度的关键因素.本实验研究大鼠HSC中TGF β 3/TGF β 1 mRNA比值的变化及与Ⅰ型胶原合成的关系,阐明TGF β 3是拮抗TGF β 1的重要因子,为TGF β 3对肝纤维化的防治作用提供实验依据.     

罗格列酮对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶组织抑制因子1表达的影响

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR γ)是一种由配体激活的核转录因子,其作用广泛,与肝纤维化也存在密切联系[1].本实验选择PPAR γ的高亲和配体罗格列酮作用肝星状细胞(HSC),观察罗格列酮对HSC增殖、细胞外基质的主要成分Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)以及与细胞外基质降解密切相关的基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)表达的影响,以期探讨罗格列酮对肝纤维化的影响.     

白细胞介素-10对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的:探讨外源性IL-10对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA表达的影响.方法:60只清洁级SD雄性大鼠,随机分为生理盐水对照组(N组,8只)、CCl4组(C组,28只)和IL-10干预组(I组,24只)3组,于造模第7周和第11周分别随机选取一批大鼠,分离肝星状细胞并提取总RNA,以半定量RT-PCR方法检测各组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA表达的水平.结果:随着肝纤维化的进展,C组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA的表达增加并呈增强趋势(与N组比较,P＜0.01;与第7周比较,Col-ⅠP＜0.01;Col-Ⅲ P＜0.05).造模第7周,Ⅰ组Col-Ⅲ mRNA的表达量低于C组(P＜0.01);造模第11周,两种胶原Ⅰ组的表达量均进一步下降(与C组比较,P＜0.01;与第7周比较,Col-ⅠP＜0.05;Col-ⅢP＜0.01),与正常组差异无显著性意义(P＞0.05).结论:随着肝纤维化进展,肝星状细胞内Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA的表达增加,外源性IL-10能显著降低两者的表达.     

柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞表达转化生长因子β1和胶原的影响

[目的]观察柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞(HSC)表达转化生长因子β1(TGF-β1)和胶原的影响.[方法]采用血清药理学方法处理HSC,以貂肺上皮细胞(Mv1Lu)生长抑制MTT法检测培养上清液中TGF-β1活性,免疫细胞化学染色检测HSC TGF-β1和胶原的表达.[结果]经柔肝冲剂处理的HSC培养上清液中TGF-β1的生物活性和细胞内TGF-β1的表达受到显著抑制,其中对纤维肝HSC的作用更明显,抑制作用优于秋水仙碱.柔肝冲剂能显著抑制纤维肝HSC表达胶原,对Ⅳ型和Ⅰ型胶原具有较高的抑制率.[结论]柔肝冲剂能抑制HSC产生TGF-β1和胶原,阻断肝纤维化时HSC合成胶原等细胞外基质的自分泌放大过程.     

虫草菌丝和丹参对肝星状细胞活化、Ⅰ型胶原及转化生长因子β1mRNA与蛋白表达的影响

目的探讨虫草菌丝、丹参抗肝纤维化的作用机理。方法虫草菌丝与丹参流浸膏分别给大鼠经口灌胃给药后分离药物血清,观察药物血清对体外传代活化的大鼠肝星状细胞α－平滑肌肌动蛋白（SMactin,SMA）表达、[3H]TdR及[3H]脯氨酸掺入,TGFβ1、I型前胶原mRNA表达及其蛋白生成量的影响。结果丹参抑制HSC的SMA表达、I型胶原生成量及细胞内[3H]脯氨酸掺入的作用显著,分别为对照组的39.8％,42．7％与38．9％（P＜0．01;前2项显著低于虫草菌丝组,P＜0．05）,尚可抑制细胞1型前胶原＜mRNA,TGFβ1＜mRNA及其蛋白的表达（P＜0．01）;虫草菌丝对上述指标也均有抑制作用,以抑制TGFβ1＜mRNA及其蛋白表达的作用尤著,分别为对照组的47．7％和21．1%(P＜0．01）;显著低于丹参组,P＜0．05。结论丹参具有较强的抑制HSC活化与胶原合成的作用,抑制胶原合成主要作用于前胶原转录后的水平;虫草菌丝的主要作用点抑制HSC的TGFβ1mRNA表达与自分泌。     

干扰素γ对肝星状细胞-T6细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原等基因表达的影响

目的观察干扰素γ(IFN γ)对肝星状细胞(HSC)-T6细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(colⅢ)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)基因表达的影响。方法浓度0.1、1、10、102、103、104、2.5×105、5×105U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用四甲基偶氮唑盐比色法观察其对HSC-T6细胞生长指数的影响;以1、102、104U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用逆转录聚合酶链反应方法测定其对HSC-T6细胞Col Ⅰ、ColⅢ、TIMP1基因表达的影响。结果空白对照组ColⅠ、ColⅢ、TIMP1基因表达水平分别为2.86±0.21、2.00±0.23、3.90±0.81;1U/m1、102U/ml、104U/ml IFNγ作用于HSC-T6细胞,ColⅠ基因表达水平依次为1.00±0.11、0.42±0.12、0.33±0.12,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;ColⅢ基因表达水平依次为1.09±0.1 5、0.52±0.14、0.43±0.18,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;TIMP1基因表达水平依次为3.81±0.37、3.50±0.51、3.41±0.31,与空白对照组比较,差异无统计学意义。结论IFNγ明显抑制HSC-T6细胞colⅠ、ColⅢ基因表达水平,而对TIMP1基因表达水平无明显影响,从而可抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,这可能是其抗纤维化的作用机制之一。     

大鼠急性CCl_4损伤肝库普弗细胞对肝星状细胞增殖和Ⅰ型胶原分泌的影响

通过细胞体外培养观察急性CCl4 肝损伤的大鼠肝库普弗细胞对正常肝星状细胞的激活作用。方法　以 5 0 ?l4 橄榄油一次灌胃复制大鼠急性肝损伤模型 ,分离模型大鼠肝库普弗细胞并原代培养 ,收集条件培养液 ,以其温育正常大鼠分离的原代培养肝星状细胞 ,二苯基四氮唑溴盐 (MTT)法测定细胞增殖 ,ELISA法测定Ⅰ型胶原分泌。结果　损伤肝库普弗细胞条件培养液可显著促进肝星状细胞的增殖及Ⅰ型胶原分泌 ,并具一定量效、时效关系 ;还可促进星状细胞表型向肌成纤维样细胞转化 ,而正常大鼠分离的肝库普弗细胞则无明显作用。结论　肝损伤时库普弗细胞对肝星状细胞的活化有多方面旁分泌激活作用     

舒肝颗粒对大鼠肝星状细胞增殖及胶原分泌的影响

目的:观察舒肝颗粒对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖及胶原分泌的影响.方法:体外培养HSC-T6.设空白对照组、正常对照组和舒肝颗粒干预组,其中,舒肝颗粒干预组设7个浓度梯度.前两者加入无血清的RPMI 1640胞培养液,后者加入含舒肝颗粒的无血清RPMI 1640细胞培养液,药物终浓度分别为0.56、0.28、0.14、0.07、0.035、0.018和0.009 g/L.采用MTT法检测细胞增殖,ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型胶原含量.结果:经48 h,舒肝颗粒干预组HSC抑制率分别为48.59%、38.24%、28.12%、21.15%、8.47%、7.26%和0.33%,明显高于正常对照组,且呈剂量效应关系.舒肝颗粒干预组细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量较正常对照组明显降低(5.437 μg/L±0.043 μg/L、3.26μg/L±0.217μg/L、2.18μg/L±0.245μg/L vs 13.817μg/L±0.787μg/L、8.629μg/L±0.178μg/L、5.29μg/L±0.315μg/L,均P<0.01).结论:舒肝颗粒可通过抑制HSC增殖和胶原蛋白的分泌,减少胶原纤维在肝脏内的沉积,这可能是其抗肝纤维化的作用机制之一.     

奥曲肽对肝星状细胞胶原合成及TIMP-1、MMP-2表达的影响

目的研究奥曲肽(OCT)对体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC)胶原分泌及TIMP-1mRNA、MMP-2mRNA表达的影响。方法体外培养大鼠HSC,HSC随机分为4组,分别加入不同浓度的OCT,用ELISA法检测细胞上清液中的Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,半定量RT-PCR法检测OCT对HSC中MMP-2、TIMP-1 mRNA表达的影响。结果应用OCT干预后,HSC合成Ⅰ、Ⅲ型胶原减少,TIMP-1 mRNA的表达较少,而MMP-2 mRNA表达明显增加,差异有显著性(P<0.05)。结论OCT可以抑制HSC的Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,增强MMP-2mRNA的表达,抑制TIMP-1mRNA的表达,这可能是OCT发挥抗肝纤维化作用的途径之一。     

脂质对肝呈状细胞表达前胶原Ⅰ,ⅢmRNA的影响

目的 探讨脂质（三酯酰甘油和极低密度脂蛋白）对ＨＳＣ前胶原Ⅰ、ⅢｍＲＮＡ表达的影响。方法 链霉蛋白酶和胶原酶的位灌注,Ｎｙｃｏｄｅｎｚ雷度梯度离心分离大鼠ＨＳＣ,分别用三酯酰甘油（２５ｍｇ／Ｌ）和极低密度胆蛋白（２５ｍｇ／Ｌ）共孵育１０ｄ后,提取ＨＳＣ的ＲＮＡ,用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交观察一酯酰甘油和极低密度脂蛋白对ＨＳＣ前胶原Ⅰ、Ⅲ ｍＲＮＡ表达。 三酯酰甘油和极低密度脂蛋白刺激后其胶胶     

MMP-1过表达抑制人肝星状细胞I型胶原表达

目的观察人肝星状细胞（LX-2）过表达基质金属蛋白酶-1（MMP-1）后,肝纤维化相关指标的变化。方法构建含MMP-1全长编码基因的表达质粒,并转染人肝星状细胞,荧光定量PCR与Western blot法分别检测MMP-1、I型胶原（collagenI）、TIMP-1基因与蛋白水平的表达。结果成功构建含MMP-1全长编码基因的表达质粒dl6-95-MMP-1;dl6-95-MMP-1转染LX-2细胞7d后,荧光定量PCR结果显示,MMP-1基因转录水平显著增加,而CollagenI、TIMP-1在基因转录水平无明显改变;Western blot结果显示转染7d后,MMP-1蛋白表达明显增加,CollagenI蛋白表达明显下降,而TIMP-1蛋白表达无明显变化。结论人肝星状细胞高表达MMP-1后显著抑制CollagenI蛋白的表达,其机制主要通过发挥其酶活性降解collagenI蛋白,而不影响collagenI基因水平的表达,同时也不影响TIMP-1在基因以及蛋白水平的表达。