表型遗传修饰对人结肠癌细胞周期和抑癌基因表达的调控

目的：分析和探讨同一结肠癌细胞系DNA甲基化和组蛋白乙酰化对抑癌基因表达和细胞周期的影响。方法：培养结肠癌细胞HT－29、SW1116和Colo-320，分别以去甲基化制剂5－氮脱氧胞苷（5－aza-dC）和（或）组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂trichostatinA(TSA)及丁酸盐干预细胞。提取基因组DNA和RNA，部分行甲基化特异性PCR（MSP）检测p16^INK4A基因启动子区甲基化情况；以RTPCR研究p16^INK4A和p^21WAF1 mRNA表达水平；同时以流式细胞仪分析SW1116和Colo-320细胞周期。结果：干预前，HT－29、SW1116和Colo-320三种结肠癌细胞系中均有较弱的p16^INK4A表达；SW1116和Colo-320细胞的p21^WAF1表达缺如，对于HT－29细胞，1μmol/L的5－aza-dC干预时则无显著改变。在SW1116和Colo-320细胞中，5－aza-dC干预后p16^INK4A表达增强，且以10μmol/L或5μmol/L浓度干预24h者为最明显，相反p21^WAF1仍无明显表达，该两个细胞系经TSA或丁酸盐使细胞阻滞于G1期。结论：三种人结肠癌细胞中，p16^INK4A基因的表达均受甲基化调节。SW1116和Colo-320细胞中p21^WAF1基因表达主要受乙酰化调节，在该两个细胞系中，乙酰化使细胞周期停滞于G1期。     

丝裂原激活蛋白激酶阻断剂与DNA甲基化酶抑制剂对人结肠癌细胞的协同影响

目的研究细胞外信号渊节激酶-丝裂原激活蛋白激酶途径（ERKMAPK）与DNA甲基化问的关系及对结肠癌细胞生物学行为的协同影响。方法培养人结肠癌细胞SW1116，分别以PBS、二甲基亚砜（DMSO）为对照组，PD 9805950μmol／L、5氮脱氧胞苷（5-aza—dC）5μmol／L、PD9805950μmol／L＋5-aza-dC5μmol／L进行药物干预．以定量RT-PCR检测DNA甲基化酶（Dnmt）1、3a和3b基因转录水平；流式细胞仪分析细胞周期；MTT测定细胞活力；光学显微镜下观察细胞形态学变化。结果ERK—MAPK途径阻断剂PD98059下调Dnmt 1和Dnmt 3b．Dnmt抑制剂5-aza-dC下调Dnmt 1、Dnmt 3a和Dnmt 3b，且5-aza-dC联合PD98059对Dnmt1及Dnmt 3a mRNA的表达下调更为显著。5-azo-dC明显降低G0／G1期细胞百分比（P〈0．05），G2／M期细胞百分比明显增加（P〈0．05）；PD98059使G0／G1期细胞百分比降低（P（0．05）．G2／M期增加（P〈0．05）。PD98059明显抑制细胞生长。PD98059促进细胞分化，呈上皮样改变，细胞变狭长，胞质减少，细胞排列开始出现相对整齐；5-azm-dC干预组细胞大小不一，出现较多多倍体细胞（多个核分裂相）。结论ERK-MAPK途径阻断剂及Dnmt抑制剂均能抑制结肠癌SW1116细胞分裂、增殖，并诱导细胞分化；两者有协同作用；ERK—MAPK信号转导途径能调控DNA甲基化水平。     

IL-6对人胰腺癌细胞生长及STAT3信号转导通路的影响

目的 探讨IL-6对人胰腺癌细胞株Capan-2生长及STAT3信号转导途径的影响.方法 采用MTT法检测不同浓度IL-6刺激后Capan-2细胞的增殖率;免疫细胞化学染色确定磷酸化STAT3(P-STAT3)在Capan-2细胞内的定位及IL-6刺激前后表达量的变化;流式细胞仪检测细胞的凋亡;Western blot检测IL-6刺激前后Capan-2细胞中P-STAT3、bcl-xl、Cyclin D1蛋白表达量的变化.结果 100 ng/ml的IL-6作用Capan-2细胞后,细胞的增殖从1增加到4.965±0.18(P<0.05);细胞凋亡率从(3.21±0.23)%下降到(1.98±0.67)%(P<0.05);P-STAT3、bel-xl、Cyclin D1蛋白表达明显升高(P<0.05),且bcl-xl的表达与P-STAT3的表达呈正相关(r=0.985,P=0.015);Cyclin D1的表达与P-STAT3表达也呈正相关(r=0.914,P=0.036).结论 JAK/STAT信号转导途径的活化介导了IL-6对Capan-2细胞的增殖促进功能.     

胰腺癌ras癌基因及p53抑癌基因表达的临床意义

目的研究ras癌基因及p53抑癌基因在在胰腺癌表达的临床意义．方法胰腺石蜡包埋标本55例，包括胰腺癌32例，癌切缘未受浸润的胰腺组织12例，急慢性胰腺炎7例，正常胰腺4例，标本均经病理学证实，用免疫组织化学ABC法对上述标本的ras癌基因及p53抑癌基因表达进行检测．结果在32例胰腺癌中，ras和p53基因的阳性表达率分别为71．9％和28．1％，高于胰腺炎和癌切缘组织（P＜0．05）ras，p53基因表达与患者性别、年龄、肿瘤所在部位及大小和初发症状无关（P＞0．05），p53基因表达与临床分期和病理分级相关（P＜0．05），p53基因表达阳性者其临床分期较晚期，细胞分化较差，而ras基因表达仅与病理分级有关（P＜0．05）．P53基因表达与癌肿可切除率相关（P＜0．05），凡癌肿能切除者多为p53基因表达阴性者.p53基因表达亦与淋巴结转移有关（P＜0．05），其表达阳性者多已有淋巴结转移．ras与p53基因表达之间存在正相关关系．结论ras与p53基因表达可以反映胰腺癌的生物学行为，对胰腺癌的诊断和治疗有一定指导意义．     

抑癌基因的启动子区甲基化与胰腺内分泌肿瘤的发生

胰腺内分泌肿瘤（pancreatic endocrine tumors，PETs），亦称为胰岛细胞瘤，是一类少见或罕见的肿瘤，美国每年新诊断的PETs病例数大约2000例。PETs是一类在临床、生化、病理等方面颇有特色的肿瘤，绝大多数PETs可分泌多种胃肠激素，但通常有一种主要激素导致特定的临床综合征。根据PETs的临床表现可将其分为功能性PETs和无功能性PETs两大类，其中功能性PETs分为10种。     

PUMA基因转染对胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨PUMA基因转染抑制胰腺肿瘤生长的体内外效果。方法利用脂质体转染法将表达PUMA的质粒转染导入胰腺癌细胞株PC-3中,G418筛选出阳性克隆,Western和RT-PCR法检测PUMA转染后PC-3PUMA的表达,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率;分别将转染PUMA的PC-3细胞(实验组)和未转染的PC-3细胞移植到裸鼠体内,比较裸鼠移植肿瘤的大小和重量以及PUMA表达。结果PUMA表达质粒转染的PC-3细胞(PC-3/PUMA)稳定表达PUMA,其细胞凋亡率为(5.50±0.90)%,明显高于未转染组的(1.073±0.248)%和空载体转染组的(1.08±0.35)%(P<0.05);裸鼠接种4周后PC-3/PUMA细胞成瘤率为70%,PC-3细胞和空载体PC-3细胞成瘤率为100%(P>0.05),PC-3/PUMA细胞形成的肿瘤体积比PC-3细胞和空载体PC-3细胞明显减小(P<0.05),并且形成的肿瘤组织中PUMA高表达。结论胰腺癌细胞中缺失PUMA基因表达,PUMA转染胰腺癌细胞后表达PUMA,并能促进细胞凋亡。     

血卟啉衍生物光动力治疗人胰腺癌细胞的实验研究

目的 研究血卟啉衍生物光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)对体外培养的人胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应及其规律.方法 以Biolitec PDT 630半导体激光治疗仪为光源,用不同浓度的血卟啉衍生物Photosan(0.5、1、2、4 mg/L)作为光敏剂孵育PANC1细胞8 h后,分别给予不同剂量(1、5、10 J/cm~2)630nm激光照射,用MTT法测定PDT后各组的A_(492)值,以流式细胞仪测定10 J/cm2光照后细胞凋亡情况.结果 不加光敏剂Photosan或不进行光照,对细胞均无杀伤效应;添加1 mg/LPhotosan时,10 J/cm~2 的光照对细胞产生杀伤效应(0.140±0.013对0.213±0.008,P＜0.05);添加2 mg/L Photosan时,5 J/cm~2 和10 J/cm~2 的光照对细胞产生杀伤效应(0.081±0.024和0.049±0.013对0.211±0.031,P＜0.05和P＜0.01);添加4 mg/L Photosan时,所有光照剂量均对细胞产生明显的杀伤效应.但5 J/cm~2与10 J/cm~2光照对细胞的杀伤效应无显著差异.用10J/cm~2光照,0、2、4mg/LPhotosan时的细胞凋亡率分别为(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%,差别具有统计学意义(P＜0.05).结论 单纯给予光敏剂或光照对PANC1均不产生PDT效应.光敏剂达到一定浓度,光照达到一定剂量后,PDT效应随其增加而增强.     

PUMA基因转染对胰腺癌细胞生长的影响

目的 探讨PUMA基因转染抑制胰腺肿瘤生长的体内外效果.方法 利用脂质体转染法将表达PUMA的质粒转染导入胰腺癌细胞株PC-3中,G418筛选出阳性克隆,Western和RT-PCR法检测PUMA转染后PC-3 PUMA的表达,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率;分别将转染PUMA的PC-3细胞(实验组)和未转染的PC-3细胞移植到裸鼠体内,比较裸鼠移植肿瘤的大小和重量以及PUMA表达.结果 PUMA表达质粒转染的PC-3细胞(PC-3/PUMA)稳定表达PUMA,其细胞凋亡率为(5.50 ± 0.90)%,明显高于未转染组的(1.073 ± 0.248)%和空载体转染组的(1.08 ± 0.35)%(P ＜0.05);裸鼠接种4周后PC-3/PUMA细胞成瘤率为70%,PC-3细胞和空载体PC-3细胞成瘤率为100%(P ＞ 0.05),PC-3/PUMA细胞形成的肿瘤体积比PC-3细胞和空载体PC-3细胞明显减小(P ＜0.05),并且形成的肿瘤组织中PUMA高表达.结论 胰腺癌细胞中缺失PUMA基因表达,PUMA转染胰腺癌细胞后表达PUMA,并能促进细胞凋亡.     

砷对人胶质瘤细胞周期调控相关基因表达的影响

目的比较三氧化二砷（As2O3）对两种不同p53表型胶质瘤细胞U87MG、T98G细胞周期调控相关基因表达的影响。方法应用功能分类细胞周期基因芯片技术，筛选出As2O3作用于两种胶质瘤细胞U87MG、T98G后与细胞周期调控表达有差异的基因，并对3条有共性表达的基因进行Western印迹分析；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率；流式细胞仪分析细胞周期改变。结果MTT分析表明：As2O2对2个细胞系的生长有抑制作用，且抑制率具有浓度和时间的依赖性，砷作用72h后，U87MG和T98G细胞系的生长抑制率为50％（IC50）时，其浓度分别为1．78、3．55μmol／L。As2O3可以将U87MG和T98G细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期。U87MG细胞在加入As2O3后，差异表达2倍以上的基因共11条，表达上调的有5条，下调的有6条。T98G细胞在加入As2O3后，差异表达的基因共13条，表达上调的有9条，下调的有4条。Western分析显示，As2O3能上调2个胶质瘤细胞系的P53蛋白水平，同时降低细胞周期蛋白B1、D1表达。结论As2O3通过将细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期来抑制U87MG和T98G细胞的增殖；p53、CyclinB、CylinD等基因表达与As2O3诱导胶质瘤细胞周期阻滞的发生有关。     

氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116细胞周期通路相关调控因子的影响

背景：氧化苦参碱为中药苦参的主要有效成分，研究显示其对结肠癌细胞具有杀伤作用。目的：观察氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116细胞周期通路相关调控因子的影响，阐明其抗结肠癌作用的分子机制。方法：分别以2、3、4mg／m1氧化苦参碱干预SW1116细胞24h或48h，以流式细胞仪检测细胞周期，以逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白（cyclin）D1、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、CDK抑制剂p53、核转录岗子E2F1和S期激酶相关蛋白2（Skp2）mRNA和蛋白水平的表达。结果：氧化苦参碱干预可使SW1116细胞周期阻滞于G0／G1期，cyc1inD1、CDK4、E2F1和Skp2mRNA和蛋白表达显著下降，p53mRNA和蛋白表达显著上升，作用呈剂量和时间依赖性（P〈0．05）。结论：氧化苦参碱可通过影响细胞周期相关通路以抑制人结肠癌细胞增殖。     

启动子甲基化对抑癌基因转录的影响及其5-Aza-CdR干预作用的研究

目的在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株水平观察基因启动子CpG岛甲基化与mRNA转录之间的关系,探讨5AzaCdR(5azaeoxycytidine)的干预作用。方法应用甲基化特异性的多聚酶链反应(MSP)和RTPCR分别检测甲基化的发生和mRNA的转录水平。结果细胞株A549甲基化的基因为MGMT、RASSF1a,SH77甲基化的基因为MGMT、RASSF1a和RARβ,NCl甲基化的基因包括APC和RARβ。4个抑癌基因发生甲基化的细胞株mRNA均不转录,而经5AzaCdR处理后均恢复转录。结论NSCLC细胞株中抑癌基因启动子甲基化导致mRNA转录失活,5AzaCdR具有潜在的去甲基化作用使基因恢复转录。     

重组DNA甲基化酶1表达质粒对结肠癌细胞相关基因表达的影响

目的 分析DNA甲基化酶1(DNMT1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞肿瘤相关基因的表达影响。方法 分别构建并转染含有人正义和反义DNMT1的真核表达质粒入结肠癌SW1116细胞，PCR和限制性内切酶证实转染结果，以Western印迹法分析各组细胞DNMT1蛋白的表达情况。定量PCR检测hMLH1、hMSH2及c—myc、p16^INK4A基因的表达。结果 经G418筛选得到稳定转染DNMT1基因的结肠癌细胞系，且分别在该转染有正义和反义质粒的细胞系中，DNMT1蛋白表达上调和下调。同时发现转染正义DNMT1的细胞中hMLH1、hMSH2及c—myc的表达降低，而转染反义DNMT1的细胞中hMSH2的表达明显增强。各组细胞p16^INK4A基因的表达差异不明显。结论 DNMT1基因调控人结肠癌细胞中肿瘤相关基因的表达。     

MEK抑制剂治疗非小细胞肺癌的研究进展

随着对肿瘤分子机制的深入研究,非小细胞肺癌的分子靶向治疗已获得重大进展。蛋白激酶抑制剂是新近研发的靶向药物之一,其通过阻碍细胞内分子传导,影响肿瘤细胞的生存与增殖而起作用。丝裂原细胞外激酶（mitogenextracellularkinase,MEK）在Ras／Raf／MEK／ERK信号通路中发挥重要作用,大量的基础及临床研究提示MEK广泛作用于多种信号通路并在各类实体肿瘤中过度表达,因此MEK抑制剂可能具备广谱的抗肿瘤的优势。本文以新型MEK抑制剂司美替尼（selumetinib,AZD6244,ARRXY-142886）为例,重点阐述Ras／Raf／MEK／ERK信号通路、MEK抑制剂的作用机制及研究进展。     

Egr-1基因表达及其在射线诱导的肝癌细胞凋亡中的作用

目的:研究Egr-1基因的表达在放射诱导的细胞凋亡中的作用．方法:选择肝癌细胞系HepG2,SMMC-7721和正常肝细胞系HL-7702培养;培养细胞接受4Gy X射线照射;收获受照前和受照后1,2,4, 6,12和24 h的细胞,采用荧光定量PCR(FQ- PCR)检测0,1,2和4 h Egr-1基因的表达,采用流式细胞术(FCM)检测0,6,12和24 h细胞周期和细胞凋亡．结果:随HepG2,SMMC-7721和HL-7702在4GY X射线照射后1 h即诱导了Egr-1基因表达增高,4 h均未达峰值,分别为ΔEgrHepG2(12．9629±1．0649)、ΔEgr7702(0．0096±0．0008)和ΔEgr7721(0．0017±0．0003),HepG2显著高于HL-7702和SMMC-7721(P<0．01)．照射后6 h射线诱导的3株细胞凋亡均不明显,但在12 h均诱导了明显的细胞凋亡,而且HepG2(41．16％)和HL-7702(27．45％)已达峰值; SMMC-7721诱导的细胞凋亡水平较低,24 h仅为24．94％,且未达峰值．在射线诱导的细胞周期变化中,HepG2和SMMC-7721 S期的变化与细胞凋亡变化在6-12 h走势相反．结论:在HepG2,SMMC-7721和HL-7702细胞中,射线通过诱导Egr-1基因表达而诱导了细胞周期和细胞凋亡的变化;射线诱导的Egr-1基因表达水平可能与射线诱导的细胞凋亡成正相关;S期肿瘤细胞可能易发生射线诱导的细胞凋亡．     

RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制

目的:探讨RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制.方法:利用Lipofectamine TM2000转染DNMT1-siRNA至胰腺癌细胞BxPC-3.实验共分为3组:实验组(转染DNMT1-siRNA)、阴性对照组(转染negative-siRNA)和空白对照组(转染脂质体).转染48h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞体外增殖活力;FCM法检测细胞凋亡;甲基化特异性PCR法(MSP)检测抑癌基因p16、RASSF1A和ppENK的启动子甲基化状态.结果:与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的DNMT1 mRNA及蛋白表达量均显著降低(P<0.01);实验组细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(44.46%±5.98%vs3.74%±1.02%vs5.07%±1.16%,P<0.01).空白对照组与阴性对照组的p16、RASSF1A和ppENK基因甲基化阳性,而实验组的p16和ppENK基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化.结论:DNMT1基因表达下调后,能抑制胰腺...     

5-脱氧杂氮胞苷抑制肝癌细胞株生物学行为的机制

目的 DNA甲基化模式的改变伴随着永生性细胞系的确立,生长凋控基因CpG岛的重新甲基化可能导致了其转录的不活跃,在体外培养的情况下,使得肿瘤细胞选择了有利于生长的条件．我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷处理两株肝癌细胞,研究其对肝癌细胞的影响,探讨DNA甲基化异常与肝细胞癌间的相关性及5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株恶性生物学行为的影响及其机制。方法 用5-脱氧杂氮胞苷处理肝癌细胞株SMMC-7721和HePG2,然后采用相差显微镜观察药物处理前后细胞的形态变化,采用MTT法观察细胞的生长速度变化,采用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率、P16蛋白表达的变化．采用RT-PCR法比较p16和甲基转移酶mRNA表达量的变化,比较裸鼠致瘤性的大小。结果 5-脱氧杂氨胞苷处理后细胞形态趋于规则,生长速度减慢．SMMC-7721细胞,G1期细胞增加了8.5％,而s期和G2／M期细胞分别减少了47．8％和10.4％．HePG2细胞,G1期细胞增加了3．5％,S期减少了46．2％．G2／M期增加了23．7％．两细胞凋亡率分别增加了91．6％和133．3％．P16蛋白表达分别增加了23．4％和20.9％,p16mRNA表达增高,而DNA甲基转移酶mRNA表达明显降低,裸鼠皮下移植瘤生长减慢。结论 肝细胞癌的发生与DNA甲基化异常有关,甲基化酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷可能通过抑制甲基转移酶抑制抑癌基因启动子区域的高甲基化,恢复其生长调控功能,从而使肝癌细胞株的恶性生物学行为发生逆转。     

Effects of silymarin on the spontaneous proliferation and cell cycle of human peripheral blood leukemia T cells

Silymarin is a polyphenolic flavonoid that has a strong antioxidant activity and exhibits anti-carcinogenic, anti-inflammatory, and cytoprotective effects. Although its hepatoprotective effect has been well documented, the effect of silymarin on T cells is largely unknown. The purpose of this study was to analyze the effects of the silymarin on the proliferation and cell cycle progression of Jurkat cells, a human peripheral blood leukemia T cell line. Cells were incubated with various concentrations of silymarin for 24–72 h and examined for cell growth and proliferation using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and DNA 5-bromo 2′-deoxyuridine (BrdU) colorimetric assays. Cell cycle analysis by flow cytometry was also performed using propidium iodide staining. Results of the study revealed that silymarin increased proliferation of Jurkat cells at 50–400 μM concentrations with 24 h exposure, confirmed by both MTT and BrdU assays. However, Jurkat incubation with silymarin at higher concentrations of 400 μM for 48 h and 200–400 μM for 72 h caused inhibition of DNA synthesis, cell cycle arrest at the G2/M phase and significant cell death. Results of the present study also revealed a similarity of cell growth patterns between Jurkat, U937 and RPMI 8866 cells. In conclusion, this study demonstrated an in vitro growth stimulatory effect of silymarin on leukemia cells with monocyte, T and B cell origin that has not been previously reported for either solid tumors or other leukemia cells, suggesting a possible specific stimulatory effect of silymarin on the key cells of the immune system.