HBsAg在不同真核表达载体中的表达

目的建立ＨＢｓＡｇ及其变异体的高效真核表达系统。方法从已构建的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋－ＨＢｓ系列突变重组体获取ＨＢＶ－Ｓ基因片段,将其亚克隆到真核表达载体ｐＭＥＰ４,ｐＣＥＰ４,ｐＬＸＳＮ,ＰＸＴ１及ｐｃＤＮＡ３,从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的一系列表达载体,并将其转染（或感染）人肝癌细胞系ＨｅｐＧｅ２。结果获得稳定分泌ＨＢｓＡｇＲ其突变体的抗性细胞系。结论各组真核表达载体皆能表达ＨＢｓＡｇ及其突变体,但在转染率、表达量及稳定性上存在差异。选择其中的高效、准确表达系统,将为ＨＢｓＡｇ变异株生物学性状的深入研究及进一步基因治疗、基因免疫的研究提供有用的工具。     

恶性疟原虫海南分离株(FCC1／HN)裂殖子表面蛋白2(MSA2)真核表达载体的构建

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（ＦＣＣ１／ＨＮ）裂殖子表面蛋白ＭＳＡ２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＭＳＡ２,为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。方法 采用ＰＣＲ技术对ＦＣＣ１／ＨＮ基因组ＤＮＡ ＭＳＡ２基因进行扩增,扩增产物经纯化后用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切,然后定向克隆入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３,连接产物转化大肠杆菌ＴＧ１,再用相同的内切酶酶切和ＰＣＲ扩增对重组子进行鉴定。结果 筛选出的     

重组质粒pGEX—6P—1／Sj—FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建基因工程菌株、获得重组蛋白Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法 用ＰＣＲ法从日本血吸虫ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段，再将该片段重组于ｐＧＥＭ－Ｔ中并进行ＤＮＡ测序鉴定，经酶切后将目的片段构建成重组质粒ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ，转化于大肠杆菌ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达。用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱对表达产物进行纯     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周血B细胞中的表达

目的　体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ） 基因变异的生物学意义。方法　应用逆转录病毒载体ｐＸＴ１ 构建ＨＢＶ／Ｃ 基因表达载体,并转染永生化人外周血Ｂ 细胞使之稳定表达ＨＢｃＡｇ。结果　重组质粒ｐＸＴ１ＨＢＶ／Ｃ 经聚合酶链反应（ＰＣＲ） 和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性,转染后的永生化人外周血Ｂ 细胞ＰＣＲ 鉴定含目的ＤＮＡ,流式细胞仪分析显示,约４７ ．４ ％ 的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论　ＨＢＶ／Ｃ基因逆转录病毒表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中稳定表达,有利于系列研究ＨＢＶ／Ｃ基因变异的生物学意义。     

慢性乙型肝炎患者血清及肝组织中乙型肝炎病毒核心基因的研究

３６例肝穿刺诊断为慢性乙型肝炎患者的肝组织及血清，用ＨＢＶ全基因核酸杂交法及聚合酶链反应（ＰＣＲ）法扩增了病毒的ＰｒｅＣ／Ｃ区基因片段。发现ＰＣＲ法扩增后再经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ吸印转移及核酸杂交（ＰＣＲ－ＳＢＨ）可显著提高检出ＨＢＶ基因的敏感性。对５例无任何血清ＨＢＶ标记者证实在其肝内存在ＨＢＶ基因。用ＡｖａⅡ，ｓａｕ３ＡＩ，ＸｍｎＩ，ＢｓｔＮＩ及ＴａｑＩ酶切图谱分析上述病例的ｃ基因，与ｐＡＤＲ－１Ｃ基因比较，有４例（５份标本）有Ｓａｕ３ＡＩ的异常酶切位点，提示ＨＢＶ不仅ＰｒｅＣ区存在变异株，Ｃ基因中亦可有变异。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

莱姆病螺旋体83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因克隆与表达 …

目的 为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法 根据莱姆病螺旋体８３ｋＤ原浆栓蛋白（ｐ８３）特异性区段的基因序列,设计一对引物,采用ＰＣＲ技术从莱姆病螺旋体Ｂ３１株基因组ＤＮＡ中扩增ｐ８３特异性区段的基因片段,纯化扩增产物,用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆入质粒载体ｐＢＫ－ＣＭＶ;转化大肠杆菌筛选重组克隆,用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切、ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ序列测定对重组质     

REGULATION OF GI MOTOR FUNCTION：ROLEOFBRAINPEPTIDES．

ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮＯＦＧＩＭＯＴＯＲＦＵＮＣＴＩＯＮ：ＲＯＬＥＯＦＢＲＡＩＮＰＥＰＴＩＤＥＳ．Ｖ．ＭａｒｔｉｎｅｚａｎｄＹ．Ｔａｃｈｅ，ＣＵＲＥ：ＤｉｓｅａｅｓＲｅｓｅｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＷｅｓｔＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓＶＡＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ．...     

日本血吸虫（中国大陆株）FABPc重组抗原高效融合表达,纯化及 …

目的 构建Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ表达克隆,获得大量纯化ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ重组（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）抗原,了解其作为侯选疫苗抗原的潜能。方法 以ＰＣＲ法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体ｐＧＥＸ－６Ｐ－１进行融合表达,经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱和ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ＾ＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ酶切后纯化出ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ,Ｗｅｓｔｅｒｎ     

肝细胞癌中p53基因突变的检测及新DNA片段的发现

目的：检测原代肝癌组织以及肝癌细胞系中ｐ５３的突变位点和频率,了解ｐ５３突变与肝癌发病和治疗的关系。方法：设计了３对引物,采用ＰＣＲ技术扩增ｐ５３的５－８外显子,然后进行ＤＮＡ测序鉴定,共测定了两个肝癌细胞系（ＢＥＬ－７４０２和２．２．１５）以及两例原代肝癌组织,其中５和６外显子用一对引物串联扩增出来,上游引物序列为５′－ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧ－３′,下游为：５′－ＧＧＡＡＴＴＣＡ     

乙型肝炎患者HBV DNA定量测定与临床疗效的关系

我们应用微板核酸杂交－核酸定量技术对８６例乙型肝炎患者血清ＨＢＶＤＮＡ的定量测定以及其中 １１例应用 ＩＦＮａ ２ｂ治疗３个月前后血清ＨＢＶ ＤＮＡ的变化情况。 １．资料与方法：采用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计引物,选取ＨＢＶ ＤＮＡ Ｃ区的保守序列作引物与探针,其序列分别为：引物Ｗ１ＴＧＧＡＣＧＴＣＧＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡ,引物Ｗ２ ＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡ,包被探针ＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＧＧＡＴＣＴＡＧＴＡＧＴＣＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧ…     

聚合酶链反应检测肾移植受者尿中人巨细胞病毒的临床应用

为探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测肾移植受者（ＲＴＲ）尿中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ在临床工作中的应用及其价值，本组采用ＨＣＭＶ早期及晚期基因组两对引物及ＨＣＭＶ特异性单抗分别建立了ＰＣＲ技术及捕获、间接酶联法（ＭａｃＥＬＩＳＡ，ＩＥＬＩＳＡ）。应用ＰＣＲ检测ＲＴＲ尿中ＨＣＭＶＤＮＡ、ＭａｃＥＬＩＳＡ及ＩＥＬＩＳＡ法检测各受血者中ＨＣＭＶ－ＩｇＭ及ＩｇＧ，并比较其结果，表明：６５例ＲＴＲ尿中ＨＣＭＶＤＮＡ阳性率为６０％，ｌｇＭ及ＩｇＧ阳性者尿中ＨＣＭＶＤＮＡ阳性率各为８１．８％及５４．５％。说明ＰＣＲ应用存在一定局限性，应与血清学等方法相结合，取长补短，才能适应临床需要，充分发挥其应用价值。     

慢性重型肝炎患者外周血单个核细胞内干扰素和白细胞介素的表达及意义

目的探讨慢性重型肝炎（ＣＳＨ）病人外用血单个核细胞（ＰＢＭＣ）内干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）及白细胞介素－４（ＩＬ－４）的表达及其临床意义。方法常规分离ＰＢＭＣ,在ＰＭＡ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ的刺激下,采用流式细胞术（ＦＡＣＳ）,对１７例ＣＳＨ患者及１９例正常健康者ＣＤ４＋Ｔ细胞内ＩＦＮ－γ和ＩＬ－４的表达进行分析,并应用荧光定量聚合酶链反应检测ＨＢＶ ＤＮＡ含量。结果 ＣＤ４＋Ｔｈ１、 Ｔｈ２细胞在ＣＳＨ组分别为７．２％—２６．３％（平均１５％）和０、ｌ％—１０．９％（平均２．０％）,正常对照组则分别为２．２％—１１．９％（平均５．９％）和０．４％—３．９％（平均２．２％）;ＣＤ４＋Ｔｈ１细胞百分数两组间差异有显著意义（Ｐ＜０．０１）。荧光定量ＰＣＲ结果表明ＣＳＨ组中１３例ＨＢＶ　ＤＮＡ阳性,其ＨＢＶ ＤＮＡ的含量与ＩＦＮ－γ表达细胞百分数呈负相关。结论 Ｔｈ１细胞与肝脏的炎症活动明显相关,ＩＦＮ－γ的表达对ＨＢＶ复制可能具有一定的影响。     

基因疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤免疫研究

目的　观察 ＨＢＶ ＤＮＡ 疫苗（ｐＣＲ３－１Ｓ） 诱导Ｂａｌｂ／ ｃ 小鼠（ Ｈ２ｄ） 的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ 的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５ 细胞（Ｐ８１５ＨＢＶＳ） （ Ｈ２ｄ） 成瘤性的影响．方法　肌肉注射ＤＮＡ 疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５ＨＢＶＳ 细胞,观察成瘤情况,４ ｈ ５１Ｃｒ 释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ 活性．结果　接种 ＤＮＡ 疫苗后小鼠成瘤率为１２－５ ％ , 对照组为１００ ％ ． 小鼠平均存活期大于３８－２ ｄ ,对照组为２８－４ ｄ ,４０ ｄ 后小鼠存活率为８７－５ ％ ,对照组为０ ％ ． ＣＴＬ 细胞杀伤活性明显增加,ｐＣＲ３－１Ｓ 组５１ ％ ,对照组为２１ ％ （ Ｐ＜ ０－００１） ．结论　ＤＮＡ 疫苗可以诱导细胞免疫应答,对体内ＨＢＶ 感染具有预防及治疗作用．     

合成多肽体外诱导乙肝病毒抗原特异性T杀伤细胞实验研究

目的及方法 为探讨ＨＢＶ抗原特异性细胞毒Ｔ细胞（ＨＢＶ－ＣＴＬ），根据ＨＢｃＡｇ的ＨＬＡ分子结合关键序列合成抗原多肽２段，分别与转铁蛋白（Ｔｆ），抗ＣＤ单克隆抗体（ＣＤ３ｍＡｂ）和ＩＬ－２联合体外诱导ＨＢＶ－ＣＴＬ，应用＾３Ｈ－ＴｄＲ释放法分别测定ＨＢＶ－ＣＴＬ对ＨＢＶＤＮＡ转染的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞特异性活性及无ＨＢＶＤＮＡ转染的ＨｅＰＧ２细胞的非特异性杀伤率。结果 ＨＢＶ－ＣＴＬ对ＨＢＶＤ     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用

目的　构建ＩＦＮ－γ基因真核表达重组质粒作为基因佐剂,观察其与ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１（ｐｃ－ＲＯＰ１） ＤＮＡ共同免疫小鼠所诱导的免疫应答。方法　将ＩＦＮ－γ基因片段定向插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,双酶切鉴定,获得ｐｃＩＦＮ 重组子;碱裂解法大量制备,经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,每只鼠注射ｐｃＩＦＮ、ｐｃ－ＲＯＰ１ 各１００μｇ,两周后同量加强免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后第３０ 天、５０ 天、７０天共三次用ＭＴＴ法测定小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞增殖活性及ＮＫ细胞活性;双夹心ＥＬＩＳＡ 测定血清细胞因子ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及酶法测定ＮＯ含量;ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果　构建成功的作用下,该两项指标均明显提高,且ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２ 及ＮＯ水平均较不加佐剂组显著提高（Ｐ＜ ０．０１）;而对ＩｇＧ抗体滴度无显著影响（Ｐ＞ ０．０５。结论　ＩＦＮ－γ基因佐剂具有协同ｐｃ－ＲＯＰ１ＤＮＡ免疫的作用,可增强免疫鼠细胞免疫应答,ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２细胞因子及ＮＯ的产生     

重组人肝再生增强因子原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）和基因重组技术构建重组人肝再生增强因子原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法 利用ＰＣＲ方法从我们构建的ＰＵＣ１９－ｈＡＬＲ质粒中扩增出带ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切位点的ｈＡＬＲ编码区ＤＮＡ。ＰＣＲ产物和质粒ｐＥＴ１１ａ分别被相应内切酶消化,然后被Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接以获取重组表达质粒。重组表达质粒ｐＥＴ１１ａ－ｈＡＬＲ经电转化入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,在Ｉ     

HBV前C区A1896变异产生和HBe转换时相的关系

乙型肝炎病毒Ａ１８９６变异与ＨＢｅ血清转换的时相有何关系？探讨如下。 一、资料与方法 １．研究对象：血清ＨＢＶ ＤＮＡ阳性各临床类型ＨＢＶ感染共５５例,男４２例、女 １３例;年龄 １３～ ６０岁;急性肝炎 １例,ＨＢＶ携带者 １１例,肝炎肝硬化 ８例。所有研究对象排除甲、戊、丙肝,未经过抗病毒及免疫治疗。采集分离血清待检。 ２．研究方法：ＨＢｅＡｇ／ＩＣ检测参照文献［１］。血清 Ａ１８９６ ｍｓ－ＰＣＲ检测：引物： Ｉ１８７９—１８９６ ５’－ＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧ—３’, ＩＩ １８７９—１８９…     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周？…

目的体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）基因变异的生物学意义。方法 应用逆转 录病毒勒体ＰＸＴ１构建ＨＢＶ／Ｃ基因表达载体，并转染永生化人外周血Ｂ细胞使之稳定ＨＢｃＡｇ。结果 重组质粒ＰＸＴ１－ＨＢＶ／Ｃ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性，转染后的永生化人外周血Ｂ细胞ＰＣＲ鉴定含目的ＤＮＡ，流式细胞仪分析显示，约４７．４％的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论ＨＢＶ／Ｃ基因逆转