转化生长因子—β1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的观察转化生长因子-β1 (TGF-β1)对软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)含量的影响。方法通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106个细胞于培养皿,在细胞贴壁后更换培养基时,加入TGF-β1 10ng/mL,每周传代1次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质GAG的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质,第2代传代细胞分泌GAG的能力最强;加入TGF-β1能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。结论TGF-β1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。     

猪关节软骨细胞体外培养及其形成糖胺多糖能力的实验研究

目的:观察软骨细胞体外培养的情况及其合成糖胺多糖的特点。方法:通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106个细胞于培养皿,加入培养基,每周传代一次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法(AlcianBlue)测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)的变化;利用倒置显微镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果:软骨细胞在pH值为7.0,含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长良好,体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质,第二代传代细胞分泌GAG的能力最强。结论:软骨细胞体外培养生长良好,合成大量的糖胺多糖类基质。传代第二代是最佳接种时间。     

猪耳廓软骨细胞外分泌基质的检测

目的　通过体外传代培养猪耳廓软骨细胞 ,并连续检测软骨细胞形成外分泌基质的能力 ,寻找出最适宜接种的种子细胞。方法　通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞 ,定量接种 6× 10 6个细胞于培养皿 ,每周传代 1次 ,连续 5周 ,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖 (GAG) ;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果　第 1,2 ,3 ,4,5周软骨细胞外分泌基质GAG平均含量分别为 :612 ,12 3 5 ,14 62 ,113 8和 710 μg。 结论　体外培养的第 2代软骨细胞功能和活性最佳 ,传代第 2周是最佳接种时间。     

TGF-β1和BMP-2对终板软骨细胞增殖和糖胺多糖合成的影响

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)对体外培养大鼠终板软骨细胞增殖和合成糖胺多糖的影响。方法:取原代大鼠终板软骨细胞,体外培养传代至第二代,常规培养液培养组为对照组,培养液中加入TGF-β1及BMP-2作用于软骨细胞为实验组,观察细胞的生长情况,测定终板软骨细胞增殖和糖胺多糖(GAG)含量的变化,分析两种因子对软骨细胞增殖行为和合成糖胺多糖的影响。结果:单独应用TGF-β1与BMP-2刺激,终板软骨细胞增殖能力及糖胺多糖合成较对照组增高,而TGF-β1与BMP-2联合使用能够更加明显地促进终板软骨细胞增殖能力及糖胺多糖的合成。结论:一定浓度的TGF-β1与BMP-2联合使用,能有效促进体外培养的软骨细胞增殖和合成GAG基质的能力。     

猪软骨细胞外分泌基质功能检测的实验研究

寻找体外传代培养猪耳廊软骨细胞最适宜接种的种子细胞。方法：通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种６＊１０＾６个细胞于培养皿,每周传代１次,连续５周,留取所有培养液,用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。     

黄芪多糖对体外培养大鼠软骨细胞内糖胺多糖合成的影响及其机制

目的:研究黄芪多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖(GAG)合成的影响。方法:分离大鼠关节软骨细胞传代培养并加入IL-1β造模,分别将100,10,1,0.1 mg/L的黄芪多糖作用于该软骨细胞,以4.5 mg/L的硫酸氨基葡萄糖作为阳性对照。其后检测细胞增殖、细胞内GAG含量、细胞内葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ(GlcAT-1)mRNA含量和透射电镜观察细胞形态学改变。结果:各浓度的黄芪多糖均对大鼠软骨细胞增殖率无影响。100 mg/L的黄芪多糖可以增加软骨细胞内GAG的合成(P<0.01);1,10,100 mg/L的黄芪多糖能够增加GlcAT-1 mRNA的表达。结论:黄芪多糖能逆转IL-1β对体外培养的大鼠软骨细胞GAG合成的抑制作用,其主要机制可能与促进GlcAT-1的表达有关。     

体外培养人胎儿软骨细胞的生物学特性

目的 建立人胎儿软骨细胞分离培养、扩增技术体系,研究其体外单层培养条件下的生长特性,探讨胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法酶消化法获取胎儿软骨细胞,体外培养扩增,经测定细胞生长曲线、群体倍增时间及累计倍增数目,观察细胞生长动力学并确定体外生长规律。通过免疫组织化学检测Ⅱ型胶原分泌,阿利辛蓝比色法测定基质糖胺多糖(GAG)含量。P1细胞接种于聚羟乙酸(PGA)纤维支架,观察两者生物相容性及细胞体外成软骨能力。结果 关节软骨细胞形态呈典型的多角形,随着传代的次数增加,逐渐变成“成纤维细胞样”的条梭形。平均倍增时间为74 h。细胞连续培养5代,累计倍增数目为7.83±0.42。P1-P5间接免疫组化Ⅱ型胶原表达阳性,P6不表达。GAG含量P1细胞低于P0细胞,随体外培养时间延长逐渐增加。P1细胞接种于PGA纤维支架,体外培养14 d,组织学观察显示有软骨组织形成。结论 胎儿软骨细胞经常规体外培养,至第6代失去分泌软骨特异性基质的功能。P1细胞接种PGA纤维展现良好的生物相容性,初步证实胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。     

黄芪多糖对体外培养大鼠软骨细胞内糖胺多糖合成的影响及其机制

目的：研究黄芪多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖（GAG）合成的影响。方法：分离大鼠关节软骨细胞传代培养并加入IL-1β造模,分别将100,10,1,0.1 mg/L的黄芪多糖作用于该软骨细胞,以4.5 mg/L的硫酸氨基葡萄糖作为阳性对照。其后检测细胞增殖、细胞内GAG含量、细胞内葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ（GlcAT-1）mRNA含量和透射电镜观察细胞形态学改变。结果：各浓度的黄芪多糖均对大鼠软骨细胞增殖率无影响。100 mg/L的黄芪多糖可以增加软骨细胞内GAG的合成（P〈0.01）;1,10,100 mg/L的黄芪多糖能够增加GlcAT-1 mRNA的表达。结论：黄芪多糖能逆转IL-1β对体外培养的大鼠软骨细胞GAG合成的抑制作用,其主要机制可能与促进GlcAT-1的表达有关。     

体外培养人胎儿软骨细胞的生物学特性

目的建立人胎儿软骨细胞分离培养、扩增技术体系,研究其体外单层培养条件下的生长特性,探讨胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法酶消化法获取胎儿软骨细胞,体外培养扩增,经测定细胞生长曲线、群体倍增时间及累计倍增数目,观察细胞生长动力学并确定体外生长规律.通过免疫组织化学检测Ⅱ型胶原分泌,阿利辛蓝比色法测定基质糖胺多糖(GAG)含量.P1细胞接种于聚羟乙酸(PGA)纤维支架,观察两者生物相容性及细胞体外成软骨能力.结果关节软骨细胞形态呈典型的多角形,随着传代的次数增加,逐渐变成"成纤维细胞样"的条梭形.平均倍增时间为74 h.细胞连续培养5代,累计倍增数目为7.83±0.42.P1～P5间接免疫组化Ⅱ型胶原表达阳性,P6不表达.GAG含量P1细胞低于P0细胞,随体外培养时间延长逐渐增加.P1细胞接种于PGA纤维支架,体外培养14 d,组织学观察显示有软骨组织形成.结论胎儿软骨细胞经常规体外培养,至第6代失去分泌软骨特异性基质的功能.P1细胞接种PGA纤维展现良好的生物相容性,初步证实胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.     

细胞高密度培养促进兔关节软骨细胞糖胺多糖合成作用研究

目的 研究细胞密度对体外培养兔关节软骨细胞糖胺多糖(glycosaminoglyean,GAG)合成的影响.方法 1月龄新西兰兔5只,无菌手术切取双膝关节软骨,采用0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶消化分离关节软骨细胞,来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分:一部分以密度2×104/cm2接种,传代时仍以相同密度接种;另一部分在细胞贴壁后人工降低细胞密度至2×103/cm2培养.原代(P0)和传1代(P1)细胞均在细胞融合后换液,并且于换液后12,24,36,48,60 h分别抽取上清测量GAG浓度.采用重复测最资料的方差分析,比较低密度培养P0组与高密度培养P0组、P1组上清GAG浓度.结果 低密度培养P0组上清GAG含量显著低于高密度培养P0组(P<0.001),且低于体外培养时间略长的高密度培养P1组软骨细胞(P<0.05).结论 高密度培养更有利于软骨细胞维持表型,是软骨平面培养的较好方式.     

骨髓间充质干细胞二维培养条件下向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨二维培养条件下转化生长因子-β1(TGF-β1)体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为软骨细胞的方法.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSC,取第4代BMSC行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1、5、10、15和20ng/mL的TGF-β1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代BMSC诱导培养,2周后采用免疫组化法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝(DMB)比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖(GAG)的表达情况.结果 贴壁培养法可分离并纯化sD大鼠的BMSC,所得第4代BMSC细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组化染色显示TGF-β15、10、15和20ng/mL组阳性,二甲基亚甲蓝(DMB)比色法检测显示实验组细胞外基质糖胺多糖(GAG)含量均明显增加(P<0.00),其中TGF-β110 ng/mL组细胞分泌的GAG显著多于其他剂量组(P<0.00).细胞分泌GAG的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论 贴壁培养法可以获得较纯的BMSC,该实验所用的诱导体系可成功将BMSC诱导为软骨细胞;TGF-β110ng/mL组诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力强于其他剂量组,在该实验的细胞密度范围内其诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力与细胞密度呈正相关.     

FGF对关节软骨细胞基质及其TGFβ1表达的作用

目的:观察成纤维细胞生长因子(FGF)对培养兔关节软骨细胞基质及转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响.方法:培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞,在每次换液时加入FGF 100 ng/ml,铺满后收集细胞,作关节软骨细胞TGFβ1检测及电镜免疫组织化学观察.采用氯胺T法和Antonopoulos法,作细胞基质的胶原和蛋白多糖含量测定.结果:FGF能明显促进胶原和蛋白多糖的合成,并且与剂量、时间呈正相关(P＜0.01).光镜下实验组细胞明显呈棕色,电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒粘附.结论:FGF能促进关节软骨细胞TGFβ1的表达及基质合成,推迟了关节软骨细胞的成熟,维持细胞的软骨表现型,这些作用有利于关节软骨损伤后的修复,可能具有一定的临床意义.     

转化生长因子β1对软骨样细胞整合素和吞噬细胞糖蛋白-1表达的影响

目的 :检测软骨样细胞 (HEMCSS)α1β1,α2 β1,α5 β13种整合素 (integrins)和吞噬细胞糖蛋白 - 1(CD4 4 )的表达 ,及转化生长因子 β1(TGF - β1)对它们表达水平的影响。方法 :HEMCSS是永生性软骨肉瘤细胞 ,培养于含10 %胎牛血清 ,不含或含 1,5 ,10ng·ml-1的TGF - β1的培养液 ,培养时间 2 4h。共聚焦显微镜观察α1β1,α2 β1,α5 β1和CD4 4在HEMCSS细胞上的表达和分布 ,流式细胞仪检测α1β1,α2 β1,α5 β1和CD4 4在HEMCSS细胞上表达的水平。结果 :共聚焦显微镜结果显示 ,HEMCSS细胞膜表面均有α1β1,α2 β1,α5 β1及CD4 4表达。流式细胞仪检测表明 ,加入TGF - β1,培养HEMCSS细胞 2 4h后可诱导α1β1,α2 β1,α5 β1的表达增加 ,并呈剂量依赖趋势。而 3种不同浓度的TGF - β1培养 2 4h后均减少了HEMCSS细胞CD4 4表达。结论 :TGF - β1可以调节HEMCSS细胞膜上细胞外基质受体的表达 ,从而调节软骨细胞与细胞外基质成分的结合 ,对调节软骨细胞的功能起着重要的作用。     

塞来昔布对体外培养软骨细胞活性及细胞外基质合成影响的实验研究

目的:通过细胞学实验来研究塞来昔布对体外培养软骨细胞活性及细胞外基质合成的影响.方法:用酶消化法分离兔关节软骨细胞,利用相差显微镜和H.E.染色软骨细胞形态学观察,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色,Western blot检测金属蛋白酶(MMP-1)、MMP-3蛋白,阿利新蓝法检测糖氨多糖(GAG)的合成.结果:随传代次数增加,细胞逐渐变大,72 h后见细胞大部分贴壁并延伸呈成纤维细胞形态.5 W时A组、B组、C组的阳性免疫染色的灰度值A、C组灰度弱于B组(P＜0.05),A、C组间差异无统计学意义(P＞0.05).在3、5 w时C组软骨细胞较B组软骨细胞的MMP-1、3蛋白表达量下降,P＜0.01,A组在各周无明显变化.3 W与5 W时A、C组糖氨多糖含量高于B组(P＜0.01).结论:塞来昔布可以抑制IL-1所产生的不良效应;可通过减少MMPs的合成,保护软骨基质的降解来维持细胞活性与细胞外基质的合成.     

犬骨髓基质千细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究

目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF．B1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF．131）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF—β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

转化生长因子β1对大肠癌细胞增殖与侵袭能力的影响

目的:观察 TGF β1 对大肠癌细胞增殖与侵袭能力的影响。方法:体外培养大肠癌细胞株 SW480 和LS174T,加入不同浓度的 TGF β1,应用 MTT法检测不同浓度的 TGF β1 对 SW480 和 LS174T细胞增殖的影响,MatrigelTM侵袭试剂盒检测不同浓度的TGF β1 对 SW480 和 LS174T细胞运动和侵袭能力的影响,免疫细胞化学(SP法)检测SW480和LS174T细胞TGF βRⅡ蛋白和Smad 4蛋白的表达。结果:不同浓度的TGF β1(0.1, 1.0,10.0μg·L-1)对SW480和LS174T细胞的增殖均无影响(P>0.05)。TGF β1 能显著促进 SW480 细胞的运动与侵袭能力, 3 种浓度的 TGF β1 (0. 1, 1. 0, 10. 0μg·L-1 )作用于 SW480 细胞 24 h 后,侵袭率分别为 30. 2%、41.1%和41.7%,与对照组的侵袭率18.6%相比明显升高,而在 LS174T细胞中却观察不到此种效应。免疫细胞化学显示 SW480 细胞表达 TGF βRⅡ蛋白,但不表达 Smad 4 蛋白;而 LS174T细胞表达 Smad 4 蛋白却不表达TGF βRⅡ蛋白。结论:TGF β1 能促进SW480细胞的侵袭能力,这种作用不依赖于Smad 4信号途径,TGF β1 发挥生长抑制和促进侵袭能力的作用可能是通过不同的信号路径实现的。     

大鼠胫骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定

[目的]建立体外培养及鉴定大鼠胫骨生长板软骨细胞的方法.[方法]采用胰酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法对5～8只3周龄SD大鼠胫骨生长板软骨行体外分离、培养并传至第6代、观察各代软骨细胞形态,MTT法绘制细胞生长曲线,Ⅱ型胶原免疫组化染色,阿力新蓝染色检测各代软骨细胞外基质硫酸糖氨多糖(GAG)含量和结构,采用逆转录聚合酶链反应检测各代细胞Ⅱ型胶原和aggreacan mRNA表达水平.[结果]体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形;MTT比色法显示,4代以前的软骨细胞的生长曲线近似"S"形,在第4～8天细胞呈对数生长,在第9～10天达平台期,至第11天开始出现生长抑制.4代以前的软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性.原代至第6代软骨细胞的GAG含量、长链分子百分比分别为0.35±0.04,(83.0±3.6)%;0.33±0.02,(78.7±4.2)%;0.31±0.06,(77.7±2.3)%:0.30±0.05,(77.0±5.3)%;0.14±0.01,(44.3±4.0)%;0.10±0.01,(39.3±2.5)%及0.07±0.01,(28.0±2.0)%,显示从第4代后随着传代次数的增加逐渐下降(P<0.05),Ⅱ型胶原和aggreacan mRNA表达水平亦显著减少(P<0.05).[结论]本研究所采用的软骨细胞分离和培养的方法,能在短时间内获得高纯度和高存活率的软骨细胞,第3代及以前的细胞保留了软骨细胞的表型特征,增殖较快,这一方法为更深入地从细胞水平研究儿童的生长提供了可靠有效的模式.     

碱性成纤维细胞生长因子及其受体在体外培养软骨细胞中的表达

目的探讨软骨细胞在体外传代培养过程中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体(FGFR)表达的变化趋势,以及它对软骨细胞增殖和细胞外基质(ECM)合成的影响.方法采用猪耳软骨细胞在体外进行扩增传代,收集第1～6代的细胞样品行RT-PCR和Western blotting检测,从mRNA和蛋白水平来反映bFGF和FGFRs的表达.另取第1～6代软骨细胞,以含10ng/mL bFGF的培养液进行培养,比较其与空白对照组细胞在增殖速率和ECM合成等方面的差异.结果 bFGF、FGFR1和FGFR2在第1-3代软骨细胞中表达减少的趋势较为平缓;第4、5代时,有大幅的向下跃迁;在第6代时仅微量表达或消失.这一现象与体外培养软骨细胞增殖速率的下降相平行,第4代及以后代次细胞对bFGF刺激无反应.结论 bFGF和FGFRs表达的减弱与软骨细胞在体外培养过程中的老化进展可能有密切的关系.     

TGF-β1对人腹膜间皮细胞分泌细胞外基质和bFGF的影响

目的 :研究TGF - β1对人腹膜间皮细胞分泌细胞外基质和bFGF的影响。方法 :人腹膜间皮细胞(HPMC)作体外培养 ,在第三代 ,将细胞转板至细胞融合后 ,将其分为对照组 (F12 )和TGF - β1刺激组两组(F12 TGF - β15ng/ml) ,分别在 2 4 ,4 8h采用ELISA法检测上清液中纤维连接蛋白 (FN)和纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI- 1)的含量 ;采用半定量逆转录多原酶链反应 (RT -PCR)检测HPMC细胞内FN ,PAI - 1和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA的表达。结果 :HPMC表达FN ,PAI - 1和bFGF ;HPMC在 5ng/mlTGF - β1刺激下分泌FN及PAI - 1明显的增加 ,与对照组比较差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;HPMC经TGF- β1作用 12h后 ,FNmRNA ,PAI- 1mRNA和bFGFmRNA半定量结果与对照组相比 ,其表达量分别上调18.5 4 % ,8.6 %和 6 6 .9%。结论 :TGF - β1可促进HPMC合成与分泌细胞外基质和bFGF。     

IGF—Ⅰ和TGF—β1对幼年及成年兔关节软骨细胞增殖和代谢的作用

目的 观察IGF－I和TGF－β1对幼年及成年兔关节软骨细胞增殖和代谢的作用。方法 采用体外培养兔关节软骨细胞的方法。利用^3H-TdR和^35S-Na2SO4掺入分别反映软骨细胞增殖和骨质蛋白多糖的合成,应用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡,结果 随年龄增加、关节软骨细胞凋亡增加,同时增殖和蛋白多糖的合成能力下降,而且对IGF－I和TGF－β1反应性亦呈年龄相关下降。但是IGF－I和TGF－β1均可能在一定程度上以剂量依赖方式促进软骨细胞^3H-TdR和^35S-Na2SO4掺入增加。结论 外源性TGF－I和TGF－β1在体外可促进不同年龄兔关节软骨细胞增殖和基质合成,提示外源性生长因子在骨关节炎的防治上可能有一定意义。