早期牙髓损伤修复中牙本质涎磷蛋白表达的免疫组化研究

目的：衬步探讨牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP)在早期早贿损伤修复中的作用。方法：制备大鼠牙髓损伤模型,分别对损伤后6h,12h,1d,2d,3d,7d及正常大鼠牙髓标本进行HE和免疫组织化学染色,检测各实验组标本中DSPP的表达。结果：正常大鼠牙髓中仅在成牙本质细胞层有DSPP的阳性着色;牙髓损伤后6h,12h,DSPP在成牙本质细胞层的染色明显减弱;损伤后1-3d,梁色较正常牙增强。此时,牙尖及富细胞区的牙髓细胞也有了性着色;损伤后7d,染色与正常对照无明显差异。结论：DSPP在牙髓损伤的早期阶段表达下调;随后在成牙本质细胞及富细胞区牙髓细胞中表达增强;7d时表达趋于正常。提示：它可能在牙髓损伤早期的自身修复中起作用。     

Toll样受体4在人成牙本质细胞和牙髓组织中的表达

目的 探讨人牙髓组织和成牙本质细胞中Toll样受体4（TLR4）的表达与分布特点，及其在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用。方法从新鲜拔除的人第三磨牙获取牙髓组织和成牙本质细胞，扫描电镜观察牙髓摘除后髓腔壁成牙本质细胞形态和附着情况；RT—PCR检测人牙髓组织以及成牙本质细胞中TLR4mRNA的表达情况：采用免疫印迹技术和免疫组织化学方法检测TLR4蛋白的表达与定位。结果扫描电镜观察牙髓摘除后成牙本质细胞大部存留在髓室壁上，细胞形态良好：RT-PCR结果发现健康牙髓、成牙本质细胞均可表达TLR4mRNA，产物大小为278bp；免疫印迹法检测正常牙髓、成牙本质细胞在相对分子质量89000附近出现蛋白条带；免疫组化显示牙髓组织中的成牙本质细胞、血管内皮细胞TLR4免疫反应阳性。正常牙髓中牙髓成纤维细胞不表达TLR4。结论成牙本质细胞通过表达TLR4参与牙髓牙本质复合体的先天免疫反应，TLR4在牙髓抵御外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用。     

EMPs对人牙髓干细胞增殖分化影响的实验研究

目的：将人牙髓干细胞（human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）与釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）按一定浓度结合,测定牙本质涎磷蛋白（dentin sialoprotein,DSPP）、波形蛋白（vimentin）、碱性磷酸酶（alkaline phophatase,ALP）的表达,阐述EMPs对人牙髓干细胞增殖分化的影响.方法：分别将浓度为100 μg/mL、200μg/mL的EMPs加入培养中的人牙髓干细胞中,分别于3d、5d、7d、9d、11d对细胞进行免疫组化染色,检测细胞爬片DSPP、vimentin、ALP的表达.结果：未经EMPs诱导的人牙髓干细胞DSPP少量细胞阳性表达,vimentin表达阴性,ALP表现低活性.经200 μg/mL的EMPs诱导5d后,人牙髓干细胞DSPP、vimentin染色呈阳性表达,ALP活性明显增加.结论：EMPs对人牙髓干细胞增殖及分化具有促进作用,200 μg/mL的浓度效果最为显著.     

p38β在矿化诱导液诱导的人牙髓细胞成牙本质向分化中的作用

目的研究p38β丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)对矿化诱导液诱导的人牙髓细胞(h DPC)成牙本质向分化的影响。方法体外培养hDPC,Western blot检测hDPC矿化诱导0、3、7、14 d后p38β蛋白表达情况;构建3条慢病毒载体p38β鄄shRNA并分别转染hDPC,Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p38β蛋白及基因表达;设立空白对照组、矿化诱导(OM)组、OM+空载体(NC)组、OM+sh鄄p38β组共4组。成牙本质向矿化诱导1、7、14 d,实时荧光定量PCR检测成牙本质向分化指标牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)的基因表达;Western blot检测成牙本质向分化指标DSPP蛋白的表达;成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节的形成情况。结果 Western blot结果表明正常牙髓组织中存在p38β蛋白;成功构建p38β稳定低表达的hDPCs(实时荧光定量PCR显示三条序列干扰效率分别为55.4%、68.3%、54.2%);实时荧光定量PCR显示沉默p38β的hDPCs经矿化诱导后,成牙本质向分化指标DSPP、ALP基因表达水平显著降低,Western blot结果显示成牙本质向分化指标DSPP蛋白表达水平显著降低;茜素红染色结果显示,矿化诱导+sh鄄p38β组与空白对照组较另外两组的矿化结节数量明显减少。结论 p38β在OM诱导的h DPC成牙本质向分化中发挥作用。     

小鼠牙胚、软骨组织中牙本质涎磷蛋白基因的克隆

目的：从小鼠牙胚、软骨组织中克隆牙本质涎磷蛋白基因（dentin sialophosphoprotein,DSPP)。方法：采用RT-PCR方法,从小鼠牙胚及软骨组织中克隆DSPP基因片段,将所得片段装入载体pGEM-TEasyVector进行序列测定。结果：从两种组织中均获得719bp的特异性片段,序列分析表明,与已发表的DSPP序列99.7%同源。结论：成功地从小鼠牙胚。软骨中克隆到DSPP基因部分序列。结果提示：除牙齿组织外,DSPP还可在软骨中表达,它可能并非是检测成牙本质细胞的特异性指标。     

PDGF－BB促进人牙髓间质细胞成牙本质分化的实验研究

目的：检测PDGF－BB是否可促进人类牙髓细胞成牙本质分化过程。方法：体外原代培养牙髓细胞，将PDGF－BB作用于人类牙髓间质细胞，检测牙髓间质细胞在矿化诱导培养基的分化。利用实时定量PCR检测分化相关指标牙本质涎磷蛋白（DSPP）及牙本质基质蛋白1（DMP1）的表达水平。利用免疫印迹技术检测PDGF－BB处理后的人牙髓间质细胞胞内AKT信号分子的活化情况。结果：PDGF－BB可明显促进人类牙髓间质细胞矿化结节的形成。同时，利用实时定量PCR检测发现巨噬细胞上清处理的牙髓间质细胞的DSPP及DMP1表达明显上调。且牙髓间质细胞内的AKT磷酸化水平明显升高。结论：PDGF－BB可促进牙髓间质细胞的成牙本质分化，可能在牙本质形成过程中发挥重要作用。     

DLK1对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响

目的研究DLK1在人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖分化中的作用。方法用免疫组织化学分析法来检测小鼠上颌第一磨牙中DLK1的表达。构建重组慢病毒使DLK1在hDPSCs中稳定过表达,用CCK8法和Ed U核素渗入法分别检测hDPSCs的细胞活力和增殖;hDPSCs进行成牙本质细胞向分化诱导后,通过ALP活性分析、ALP和茜素红染色,以及ALP、DSPP、DMP1等矿化相关基因的表达,研究hDPSCs的成牙本质细胞向的分化。结果 DLK1在小鼠上颌第一磨牙的成牙本质细胞和牙髓细胞中高表达,而且正常hDPSCs在成牙本质细胞向分化诱导14 d后,ALP蛋白水平增长1.6倍,DSPP增长1.16倍,DMP1增长1.42倍,DLK1增长1.54倍。hDPSCs中过表达DLK1后,相比于对照组增加了1.7倍,显著促进了细胞增殖,却抑制了其成牙本质细胞向分化。结论 DLK1在牙齿发育中发挥重要作用,DLK1过表达促进hDPSCs的增殖,但抑制其成牙本质细胞向分化。     

转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白基因表达中的作用

目的 研究成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因转录调控中的作用, 探索成牙本质细胞内DSPP基因表达的调控机制。方法 细胞免疫组化观察MDPC-23细胞内c-Jun和c-Fos蛋白分子的表达。瞬时转染和报告基因检测c-Jun和c-Fos在DSPP基因转录中的作用。结果 MDPC-23细胞表达c-Jun和c-Fos蛋白,c-Jun和c-Fos主要分布在MDPC-23细胞胞核。c-Jun或c-Fos过表达均显著抑制DSPP基因启动子活性。结论 证实成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos参与下调DSPP基因表达。     

Par3在成牙本质细胞胞间连接及其生物学功能中的作用研究

目的:通过下调分离缺陷基因3(partitioning defective-3,Par3)的表达探究其对小鼠成牙本质细胞系细胞(odontoblast lineage cells, OLCs)胞间连接的调控作用及相关生物学影响。方法:通过免疫荧光实验分别观察Par3在大鼠牙髓组织及小鼠成牙本质细胞中的表达及分布;利用Western blot检测炎症状态下成牙本质细胞Par3的表达情况;利用小干扰RNA(siRNA)敲低成牙本质细胞Par3的表达后,通过透射电镜观察Par3表达下调前后小鼠成牙本质细胞胞间连接结构的变化;利用Western blot及细胞免疫荧光技术检测Par3表达下调前后细胞紧密连接相关分子ZO-1(zonula occludens-1)的表达及分布情况;最后,通过EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)、Transwell及流式细胞术等检测Par3表达下调对成牙本质细胞增殖、迁移及凋亡等生物学功能的影响。结果:Par3在大鼠牙髓组织中与成牙本质细胞分布一致。体外条件下Par3表达于成牙本质细胞胞质内,且在炎症状态下表达水平下降。Par3表达下调后小...     

Cx43通过Erk1/2促进BMP-2诱导的人牙髓细胞成牙本质分化

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2和连接蛋白(Cx) 43在促进人牙髓细胞(hDPCs)成牙本质分化过程中的联系。方法:在hDPCs中过表达Cx43并施以300 ng/m L BMP-2刺激1 h,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光(IF)检测成牙本质分化标记物的表达变化;检测BMP-2介导的Smad1/5/9和Erk1/2通路活性,并施加PD98059(Erk1/2抑制剂)刺激1 h,检测抑制Erk1/2后过表达Cx43对BMP-2诱导的DSPP等的表达变化影响。结果:BMP-2上调hDPCs内osterix、DSPP、DMP-1、ALP和OCN RNA水平以及osterix蛋白表达,增强hDPCs中DSPP的荧光强度。过表达Cx43明显促进BMP-2诱导的hDPCs成牙本质分化。BMP-2激活hDPCs中的Smad1/5/9通路,过表达Cx43上调hDPCs中Erk1/2磷酸化水平。抑制Erk1/2明显减弱过表达Cx43对BMP-2诱导的osterix、DSPP、DMP-1、ALP、OCN mRNA表达以及osterix蛋白水平和DSPP染色强度的增强作用。结论...     

MEPE基因沉默对人牙髓细胞增殖与成牙本质分化的作用研究

目的：研究细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein,MEPE）基因沉默对人牙髓细胞（Human Dental Pulp Cells,hDPCs）增殖和成牙本质分化能力的影响,探讨其在牙髓损伤修复中的功能.方法：酶消化组织块法分离培养hDPCs,以lipo2000介导siRNA-hMEPE转染hDPCs,以阴性对照组和未转染组设为对照,l、3、5、7d后,CCK-8法检测细胞增殖情况;转染hDPCs后以矿化诱导液培养5、7、10d后,实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、牙本质涎磷蛋白（Dentin Sialophos-phoprotein,DSPP）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、Collagen I mRNA表达水平.结果：CCK-8结果显示Si-h-MEPE转染hDPCsld后OD值下降,3d时到达最低值,且均低于未转染组与阴性对照组,3d时差异有统计学差异（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组中,OD值持续升高,7d时到达峰值,与各自组内其他时间点比较有统计学差异（P＜0.05）;ALP活性检测结果显示,Si-h-MEPE转染hDPCs3d细胞OD值最低,且明显低于未转染组与阴性对照组（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组hDPCsOD值呈现逐渐升高趋势,在7d时达到最大值（P＜0.05）.Si-h-MEPE转染hDPCs3d时BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA的表达量均较未转染组与阴性对照组下调（P＜0.05）.在未转染组中,BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA水平持续升高,在7d时达最高值,与3d比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：MEPE基因瞬时沉默抑制hDPCs增殖、使BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ基因表达下调,ALP活性降低,与未转染组与阴性对照组比较结果提示MEPE可能通过调控hDPCs的增殖和成牙本质分化能力,在牙髓损伤修复中发挥重要作用.     

年龄对小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4表达水平及功能的影响

目的：观察不同年龄组小鼠腹腔巨噬细胞Toll样受体2/4（TLR2/4）表达水平的差别,以及该细胞在脂多糖（LPS）刺激下,炎症因子TNF-α分泌水平的差别。方法：采用real-time PCR和流式细胞技术,检测低龄组和高龄组小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达水平的差异;同时检测1μg/mL大肠杆菌（E.coli）LPS或1mg/L牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）LPS刺激后,两组细胞TLR2/4表达水平的变化;采用ELISA技术检测炎症因子TNF-α分泌水平的变化。结果：刺激前,两组细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达水平均无明显差别。E.co-li LPS或P.gingivalis LPS刺激后,低龄组细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达水平均明显高于高龄组（P〈0.05）,其分泌的TNF-α水平也显著高于高龄组（P〈0.05）。结论：年龄对小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4表达水平没有显著影响,但增龄性变化可能导致TLR2/4功能的减退。     

aFGF和TGFβ1联合诱导猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化

目的建立猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化的体外诱导方案。方法联合应用aFGF和TGFβ1对体外培养的猪牙乳头细胞进行平面诱导,观察诱导后细胞的形态学变化,通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力,并采用免疫荧光染色和RT-PCR检测成牙本质细胞特异性标志物——DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达。结果诱导后部分细胞出现细长的单侧细胞突起,在矿化液培养2周后形成典型的矿化结节,并且表达DSP蛋白和DSPP mRNA。结论联合应用aFGF和TGFβ1可以诱导体外培养的猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化。     

Toll样受体7、8、9在原发性舍格伦综合征中的表达

目的:检测原发性舍格伦综合征(primary Sjogren's syndrome,pSS)患者血细胞中Toll样受体(TLR)7、8、9的表达水平,并检测TLR7、9在pSS患者腮腺组织中的表达.方法:采用实时定量PCR,对37例pSS患者和24例对照组患者血细胞中TLR7、8、9的水平进行检测,分析2组之间的差异.应用免疫荧光法和免疫组化分别检测TLR7和TLR9在pSS患者腮腺组织中的表达.应用SAS6.12软件包,对数据进行t检验.结果:实时定量PCR显示,pSS组的TLR7、9的mRNA表达量显著高于对照组,2组之间有显著差异(P<0.05),pSS组的TLR7是对照组的2.17倍,pSS组的TLR9是对照组的2.33倍.而TLR8在2组之间无显著差异(p>0.05).免疫荧光和免疫组化发现,TLR7、9在pSS组患者腮腺组织中的导管上皮细胞、淋巴细胞和上皮岛均为阳性;而对照组腮腺组织中仅导管上皮细胞为阳性.结论:TLR7和TLR9在原发性舍格伦综合征患者中存在表达异常.     

核因子-κB/p65 siRNA介导的舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡及相关分子机制

目的：研究下调核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）/p65基因的表达对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的影响,并探讨Tca8113细胞凋亡可能的分子机制。方法：利用脂质体2000将终浓度为100nmol/L的p65 siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,通过RT-PCR检测0、24、48和72hp65 mRNA的表达,并通过流式细胞术检测转染前后细胞凋亡变化,通过Caspase-Glo○R-3/7,-8和-9检测试剂盒分析caspase-3/9活性,用Western blotting技术检测p65、bcl-2和bax蛋白表达。结果：Tca8113细胞转染p65siRNA后,在48hp65 mRNA的相对表达量为0.181±0.028,显著低于未处理组0.595±0.038和对照siRNA组0.613±0.067（P〈0.05）。流式细胞术结果显示,p65 siRNA能促使Tca8113细胞凋亡,其早期凋亡比率为（23.16±1.72）%,显著高于未处理组和对照siRNA组（P〈0.01）。转染48h后,p65和bcl-2蛋白的相对表达水平明显下调,而促凋亡蛋白bax的表达显著上升,并伴随着caspase-3/9活性的显著上升。结论：NF-κB信号途径中的p65亚基可能在舌鳞状细胞癌凋亡中发挥重要作用,该研究有望为舌鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据。     

醋酸棉酚对人腺样囊性癌ACC-M细胞E-cadherin基因mRNA表达的影响及意义

目的 研究醋酸棉酚（gossypol acetic acid,GAA）对体外培养的人腺样囊性癌ACC-M细胞增殖及E-cadherin基因mRNA表达的影响,初步探讨GAA的抗肿瘤作用机制。方法 本研究于2013年4—7月在昆明医科大学附属口腔医院（云南省高校口腔医学重点实验室）完成。（1）应用四唑盐比色（MTT）法观察GAA对ACC-M细胞生长的作用。（2）应用实时荧光定量（RFQ-PCR）法检测ACC-M细胞在GAA作用48、72 h后E-cadherin 基因mRNA的表达变化。结果 （1）MTT法检测显示：GAA作用ACC-M细胞24、48和72 h后,细胞的生长受到抑制。（2）RFQ-PCR法检测显示：分别以19、10 μmol/L的GAA作用ACC-M细胞48 、72 h 后,细胞中E-cadherin mRNA的表达水平高于对照组（P＜0.05）。结论 GAA能抑制ACC-M细胞生长,增强E-cadherin基因mRNA表达。     

KGF对口腔黏膜上皮细胞中增殖相关基因PCNAmRNA的作用

目的：检测不同浓度角质细胞生长因子（KGF）对体外培养的口腔黏膜上皮细胞形态学及对上皮细胞增殖相关基因PCNAmRNA表达的影响。方法：体外培养的口腔黏膜上皮细胞加入含不同浓度KGF（0ng／mL,5ng／rnL,25ng／mL,50ng／mL）的D—KFSM,分别培养12h、24h、48h后观察细胞形态改变并用荧光实时定量检测各组细胞内增殖相关基因PCNAmRNA的表达。结果：①相同时间段实验组较对照组上皮细胞贴壁明显,培养48h实验3组（50ng／mL）较其他组细胞核仁明显;②12h时,实验组较对照组上皮细胞内PCNAmRNA表达增加,但各实验组间PCNAmRNA表达逐渐降低（P〈0．05）;③24h时实验组较对照组PCNAmRNA表达增加,但各实验组间无统计学差异护〉0．05）：④48h时,实验组较对照组PCNAmRNA表达增加,且呈剂量依赖性（P〈0．05）。结论：外源性KGF可上调口腔黏膜上皮细胞增殖相关基因PCNAmRNA的表达,且在不同时间段、不同浓度调控作用存在差异。     

血管内皮生长因子和转化生长因子β1基因调控人根尖乳头细胞矿化相关因子的研究

目的克隆人血管内皮生长因子（VEGF）异构体中的VEGF165,构建真核表达载体,探讨过表达VEGF165和转化生长因子β1（TGFβ1）对人根尖乳头细胞矿化相关因子的影响。方法提取人脐静脉内皮细胞系ECV304总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增VEGF165基因,插入pcDNA3.1hisA,构建重组质粒pcDNA3.1hisA-VEGF165,经酶切及测序验证正确后,将其和pcDNA3.1hisA-TGFβ1转染人根尖乳头细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测转染效率和骨涎蛋白（BSP）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨钙素（OCN）、牙本质基质蛋白1（DMP1）的表达。结果插入表达载体的VEGF165基因序列与GenBank数据库中的序列具有100%同源性;转染后VEGF165及TGFβ1 mRNA显著增高;各实验组DSPP mRNA的表达均升高（P＜0.05）,实验2组和实验3组的OCN mRNA升高（P＜0.05）,各组间BSP mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）,DMP1 mRNA均未见表达。结论成功构建VEGF165真核表达载体,VEGF165和TGFβ1均能促进人根尖乳头细胞多种矿化因子的表达,与根尖乳头细胞的分化相关。     

小鼠胚胎干细胞向成牙本质样细胞的诱导分化

目的探讨胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质样细胞诱导分化的方法。方法首先通过悬浮培养的方式,将ES细胞诱导分化形成拟胚体,然后将拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞通过Transwell培养系统共培养,研究拟胚体细胞向成牙本质样细胞的分化情况。结果RT-PCR结果显示,拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞共培养10d后,可检测到成牙本质细胞的特征性分子——牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达;共培养15d后,表达有所增强。而单独培养的拟胚体细胞,则始终未检测到DSPP的表达。结论通过与牙髓成纤维细胞共培养,可以促进胚胎干细胞向成牙本质样细胞分化。