激光共聚焦显微镜观测体内回植的GFP标记的3D打印组织工程颌骨

目的:激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protins,GFP)标记的3D打印组织工程颌骨回植后体内移植情况,为筛选组织工程颌骨并为其后续功能研究提供技术基础。方法:采用羊椎骨煅烧制备陶瓷化骨粉,结合聚乙烯醇制备组织工程颌骨支架,复合GFP慢病毒转染的羊骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs),回植羊颌骨缺损动物模型,使用激光共聚焦显微镜观察不同时间点其体内分布及存活情况。结果:GFP慢病毒转染的BMSCs,流式细胞仪检测转染率为95.4%,基因测序结果与GFP基因一致。回植后使用激光共聚焦显微镜三维立体成像技术观察到GFP标记的BMSCs在组织工程骨支架上存活3个月以上。结论:激光共聚焦显微镜三维重建技术可很好地观察GFP标记的3D打印组织工程颌骨支架上的细胞移植情况,为组织工程骨的动物实验研究提供了很好的观察方法。     

组织工程修复下颌骨缺损的研究进展

组织工程学是一门应用工程学和生命科学的原理,以生物材料为载体结合被分离的细胞,并能在宿主体内降解及释放细胞,形成新的有功能组织的科学。其基本方法是将活体内取得的组织用机械或酶消化法分散成单细胞悬液,然后在模拟体内环境的体外条件进行孵育培养,使细胞存活、生长和扩散。然后将在体外培养的具有一定浓度的细胞种植到具有一定空间结构的三维支架材料上,进一步培养,通过细胞间的相互粘附、生长、繁殖、分泌细胞外基质,形成具有一定结构和功能的组织和器官^[1,2]。     

应用组织工程骨修复犬下颌骨缺损

目的　观察应用组织工程技术进行犬下颌骨缺损修复的临床疗效。方法　取犬骨髓基质干细胞(DMSSC)体外培养 ,并向成骨细胞定向诱导。将细胞与可吸收性珊瑚羟基鳞灰石 (Interpore 5 0 0R)复合体外温育 4～ 6h后 ,将细胞 -支架复合物填充于犬下颌骨缺损中 ,分别于术后 5 0d、10 0d观察缺损区域内新骨形成情况。结果　术后 10 0dX线片示骨缺损区域仍较周围正常骨质密度低 ,但与植入初期、中期相比较密度增强 ,局部已出现明显的阻射影 ;HE染色显示大片的新骨形成。结论　组织工程骨修复缺损应用前景良好。     

绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测

目的　检测绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达载体pEGFP对MSCs的转染效率及瞬时表达,为利用 pEGFP构建骨形成蛋白(BMP)表达载体并转染骨髓基质干细胞(MSCs)提供依据。方法　在体外扩增并酶切鉴定 pEGFP质粒;抽取兔骨髓,应用贴壁法培养MSCs;质粒与脂质体按照不同的比例混合,以脂质体介导法转染pEGFP, 应用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况。结果　转染效率与脂质体和质粒的比例有关,绿色荧光蛋白在基因转染24 h后开始表达,48~72 h最高,1周后表达逐渐减弱,但3~4周后仍有少量表达。结论　按照合适的质粒和脂质体比例,pEGFP转染MSCs的效率可达到30%,并能持续表达3周以上,是转染MSCs较为理想的瞬时表达载体。     

基因强化组织工程骨在颌骨修复重建中的研究进展

组织工程骨修复颌骨缺损是当前的研究热点,但外源性的成骨生长因子半衰期短、生物活性差,基因强化组织工程能使成骨生长因子在局部稳定、持续、高效地表达,从而促进颌骨的修复和重建.     

丝素蛋白抗菌性修饰在皮肤组织工程中的应用

丝素蛋白(silk fibroin,SF)是一种天然高分子纤维蛋白,常被用作理想敷料应用于口腔颌面部及全身皮肤创面的修复中.SF具有良好的生物相容性、可降解性和机械性能,可促进创面愈合,但其本身不具备抗菌性.通过不同的抗菌性修饰赋予SF材料抗菌性能已得到广泛的研究和关注.本文对SF抗菌性修饰材料在皮肤组织工程中的应用进...     

牙本质基质蛋白1基因转染猪体细胞的实验研究

目的构建牙本质基质蛋白1(DMP1)绿色荧光融合蛋白pEGFP-DMP1,确定该重组质粒转染猪口腔粘膜成纤维细胞(POMFs)及骨髓间质干细胞(MSCs)的最佳条件,评价DMP1转基因修饰对细胞生物学特性及DMP1基因表达的影响。方法构建pEGFP-DMP1真核表达载体,使用不同参数评价脂质体介导基因修饰POMFs及MSCs的转染效率,检测转染后细胞的DMP1基因表达及蛋白表达情况。结果成功构建DMP1真核表达载体pEGFP-DMP1,酶切后得到4.7kb和1.5kb的片段,当脂质体用量为5μl、质粒2μg、转染细胞密度为30%时,DMP1基因的表达比例最高,POMFs及MSCs的最佳转染时间分别为3h和45min。转基因48h后的细胞可见有DMP1基因表达,免疫组化染色显示DMP1阳性。结论选择合适的转染条件可使pEGFP-DMP1绿色荧光融合蛋白重组质粒高效转染POMFs及MSCs,并可检测到DMP1基因及DMP1蛋白表达。     

应用细胞片层技术构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损的实验研究

目的应用骨髓间充质干细胞（BMSCs）细胞片层构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损,探讨细胞片层在成骨中的作用。方法采用密度梯度离心法分离和培养BMSCs,将BMSCs向成骨细胞诱导培养后,制备细胞片层。将细胞片层包裹到聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）支架表面,将其植入犬左侧下颌骨全层缺损中,对侧下颌骨植入无细胞片层包裹的支架复合体作同体对照。将16只犬分为4组,每组4只。术后4、8、12、16周分别处死1组,取材行大体及组织学观察。结果实验侧成骨好于对照侧,术后16周,实验侧骨缺损大部分被新生骨替代,舌侧形成与正常骨相似的密质骨,与正常骨断端骨性愈合。实验侧新生骨光密度值大于对照侧,两者差异有统计学意义（P<0.05）。实验侧可见较多哈弗氏系统及红骨髓,大量板层骨;对照侧哈弗氏系统较少。结论利用细胞片层技术可以构建出含板层骨结构的组织工程骨。     

组织工程骨与Bio-Oss修复大鼠下颌骨缺损的比较研究

目的:利用组织工程骨(tissue engineering bone)修复大鼠下颌骨缺损,观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在组织工程骨修复骨缺损中的作用,为解决临床种植术中的骨量不足提供一定的实验依据。方法:实验中植入不同类型的骨替代材料用于修复大鼠下颌骨缺损,植入物分别为:①牛无机松质骨骨粉(Bio-Oss);②Bio-Oss+骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC);③Bio-Oss+VEGF基因转染后的BMSC。大鼠分别于植入后第4、12周处死,取下颌骨进行大体观察、X线观察、HE染色以及免疫组织化学染色观察,并分析实验结果。结果:相对于第一组,第二、三组的骨粉吸收速度更快,血管新生和成骨作用更好。其中第三组的血管新生、骨再生以及支架材料的吸收均要优于其他两组。结论:VEGF对组织工程骨的血管化起了重要的作用,尤其是通过外源基因导入BMSC构建的组织工程骨明显加快了骨组织的再生过程。     

基因强化组织工程骨用于上颌窦底提升的动物实验

目的 评价骨形态生成蛋白2( bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因强化骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)复合Bio-Oss骨在上颌窦底提升术中的效果.方法 抽取12只犬髂部骨髓体外分离扩增BMSC,分别加入含BMP-2基因、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒载体共培养,观察转染效率,并植入裸鼠皮下观察成骨情况.将BMP-2基因强化BMSC-Bio-Oss复合骨随机植入犬一侧上颌窦底提升形成的空腔中为实验组,另一侧植入BMSC-Bio-Oss复合骨为空白对照组.分别于术后30、60、120 d行大体观察、CT检查、组织学检查和新生骨量分析.结果 裸鼠皮下可见新生骨,荧光显微镜示踪可见BMSC.犬上颌窦底提升30 d后,大体观察和CT检查示少量新骨形成,120 d后上颌窦内新骨生成致密,仅有少量Bio-Oss骨.新生骨量分析显示,与空白对照组[(19.67 ±5.73) mm2]相比,实验组新生骨量[(24.74±6.33) mm2]显著增多(P＜0.05).结论 BMP-2基因强化BMSC-Bio-Oss复合骨应用于上颌窦底提升术可获得良好的成骨效果.     

自体骨髓基质干细胞-珊瑚羟基磷灰石修复下颌骨节段缺损的实验研究

目的应用骨髓基质干细胞（BMSCs）复合珊瑚羟基磷灰石（CHA）构建组织工程化骨，修复犬下颌骨节段性缺损。方法体外分离培养，成骨诱导扩增犬BMSCs，将第2代细胞复合CHA后修复5只犬自体下颌骨右侧3cm的节段缺损；6只犬植入单纯CHA作为对照，术后12、26、32周通过影像学、大体形态、组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果BMSCs-CHA复合物生长良好。随时间延长，X线片和CT显示实验组连接处骨痂形成，实验对照组连接处始终愈合较差；32周大体观察实验组骨修复较好，组织学显示有板层骨形成，连接处骨性愈合，实验对照组有编织骨形成，连接处纤维愈合。实验组与正常对照组下颌骨力学强度差异无统计学意义。结论自体成骨诱导BMSCs复合CHA形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损。     

血管化游离腓骨肌皮瓣修复下颌骨节段性缺损40例效果评价

目的:探讨血管化游离腓骨肌皮瓣修复下颌骨节段性缺损的效果。方法:选择2015年6月—2018年5月在青海红十字医院接受治疗的下颌骨节段性缺损患者80例。采用随机数字表法将患者分为2组,每组各40例。2组患者均由同一组具有5年以上临床经验的医护人员进行手术。对照组行非血管化髂骨移植修复,实验组行血管化游离腓骨肌皮瓣修复。比较2组患者移植效果、疼痛、生命质量、负性情绪及并发症。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果:2组患者近中牙龈乳头、远中牙龈乳头、唇侧龈缘弧度、唇侧龈缘高度得分差异无统计学意义（P>0.05）, 实验组根表面牙龈质地及颜色得分、总分均显著高于对照组（P<0.05）。术后2组患者VAS、焦虑、抑郁评分显著下降,但实验组下降幅度更大（P<0.05）。2组患者躯体功能、心理及社会功能、生命质量均显著升高,但实验组升高幅度更大（P<0.05）。对照组发生并发症3例（7.5%）,肺炎、感染及伤口复发各1例,实验组2例（5%）出现并发症,伤口复发及肺炎各1例,2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:血管化游离腓骨肌皮瓣修复下颌骨节段性缺损可显著提高修复效果、缓解疼痛及负性情绪,提高患者生活质量且不增加并发症发生率。     

Use of cultivated osteoprogenitor cells to increase bone formation in segmental mandibular defects: an experimental pilot study in sheep

The hypothesis of the present experimental pilot study was that autogeneous cultivated osteoprogenitor cells in porous calcium phosphate scaffolds can increase bone formation in segmental defects of the mandible. The autogenous osteoprogenitor cells of eight sheep were cultivated from bone biopsies from the iliac crest and seeded into cylindrical scaffolds of pyrolized bovine bone of an overall length of 35 mm and 13 mm in diameter. Segmental defects of 35 mm length were created unilaterally in the mandibles of the animals. Reconstruction was performed using cylinders with cultivated osteoprogenitor cells in four animals and empty scaffolds in the remaining four sheep, which served as controls. After 5 months, the mandibles were retrieved and the reconstructed areas were analyzed by qualitative and quantitative histology in serial undecalcified thick-section specimens. There was significantly more bone formation in the group that had received scaffolds with cultivated bone cells (P=0.028). Bone formation was present in 34.4% of the evaluated cross-sectional units in the seeded scaffolds, while it was found in 10.4% in the control group. Although the spatial distribution of bone formation was significantly different across the scaffold in both groups, osteoprogenitor cells appeared to have increased bone formation, particularly in the centre of the defect when compared to the control group. It is concluded that the repair of segmental defects of the mandible can be enhanced by the transplantation of autogenous osteoprogenitor cells in a porous calcium phosphate scaffold.     

hBMP-2基因修饰的组织工程化骨修复兔下颌骨正中缝的实验研究

目的:评价腺病毒介导的人骨形成蛋白-2(Ad-hBMP-2)基因转染的组织工程化人工骨对兔下颌骨正中缝的修复效果。方法:健康成年新西兰大白兔45只,随机分为5组,去除下颌骨正中缝的软组织,分别植入如下人工骨:Ⅰ组,Ad-hBMP-2转染的成骨细胞复合倍骼生(Bioglass)(10只);Ⅱ组,腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(Ad-EGFP)基因转染的成骨细胞复合倍骼生(10只);Ⅲ组,未转染的成骨细胞复合倍骼生(10只);Ⅳ组,单纯倍骼生(10只);Ⅴ组,空白对照(5只)。于术后第2、4、8、12周末行大体观察、X线检查、组织学检查、新生骨量分析和生物力学测定。应用单因素方差分析和多样本均数两两比较的q(Newman-Keuls)检验对实验结果进行统计学分析。结果:大体观察见,4周时,Ⅰ组的兔下颌骨正中缝被新生骨组织代替,表面有皮质骨生成。X线检查,第4、8周,Ⅰ组的下颌骨正中缝内有明显骨痂形成。新生骨量分析显示,与其他组相比,Ⅰ组的新生骨量最多(P<0.01)。Ⅰ组移植骨的最大抗弯曲负荷、弯曲刚度值显著大于其他各组(P<0.01)。结论:hBMP-2基因修饰的组织工程化人工骨可以较好地修复兔下颌骨正中缝,有可能用于牙槽突裂的骨性修复。     

三维多孔β-磷酸三钙修复下颌骨节段性缺损的生物力学分析

目的：观察三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）形成的组织工程骨对犬下颌骨极限节段性缺损的修复能力。方法：将经过诱导的犬骨髓基质细胞（BMSCs）与3.0cm×2.0cm×1.0cm的多孔β-TCP支架复合后植入犬的下颌骨3.0cm长的全层节段性缺损处。术后6个月通过CT影像学评价β-TCP/BMSCs复合体对犬下颌节段性缺损的修复能力,并和单纯植入β-TCP材料的对照组对比,同时将缺损区组织工程骨的生物力学性能和正常的犬下颌骨对比。结果：CT影像显示实验组犬的下颌骨极限缺损区已修复,下颌骨呈连续性,且形态较对照组完美。多孔β-TCP/BMSCs构建的组织工程骨和犬正常下颌骨的抗折强度测定结果无显著性差异,而抗压强度有显著性差异,组织工程骨抗压强度小。结论：三维多孔β-TCP/BMSCs复合体构建的组织工程骨修复的犬下颌骨节段性缺损能够耐受正常生理功能需要,达到了形态和功能修复的目的,为临床下颌骨缺损修复提供了重要的实验依据。     

骨组织工程基因治疗在颅颌面重建中的应用

骨组织工程中直接添加生长因子的方法存在着诸多不足,基因治疗和组织工程技术的结合,为克服这一难题提供了新的方向。本文回顾骨组织工程基因治疗的原理和特点,介绍了脂肪细胞作为骨组织工程靶细胞的研究现状,以及一种大动物模型报告基因的应用;并就颅颌面骨组织工程基因治疗中两种新的组织特异性成骨基因作一综述。     

组织工程骨修复9例颅骨缺损畸形初步报道

目的：探讨利用自体骨髓间充质干细胞（BMSC）作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损畸形的可行性。方法：运用自体BMSC组织工程骨技术,对9例外伤术后颅骨缺损患者行颅骨修复手术。抽取患者自体骨髓,密度梯度离心法分离BMSC,经体外扩增和成骨诱导后,接种部分脱钙骨支架材料,构建组织工程骨。细胞材料复合物体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区。分别于术后1周和3、6、12个月进行临床外形和三维CT检查,随访治疗效果。结果：术后1周三维CT显示,颅骨缺损区被所植入的组织工程骨填充,头颅外形明显改善。术后3至12个月CT显示,组织工程骨形成并修复颅骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合。9例患者中2例术后失访,2例高龄患者及大面积骨缺损患者发生不同程度的组织工程骨吸收现象,其余均良好地修复了颅骨缺损。结论：通过选择适宜的病例,以自体BMSC作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程化骨并修复颅骨缺损。     

骨髓基质细胞诱导分化修复髁突软骨面缺失的实验研究

目的:采用骨髓基质细胞(BMSCs)体内修复髁突软骨全层缺失。方法:15只山羊,9只作为实验组,将BMSCs和少量软骨细胞(7:3比例混合)按5×107/mL与生物可降解材料复合后,植入山羊髁突软骨全层缺失处;对照组6只山羊,髁突软骨全层缺失区植入支架材料,分别于术后4、8、12周每个时间段取材3只实验动物,2只对照组动物;2组分别用HE染色、Ⅱ型胶原分泌的免疫组化法进行评价。结果:实验组术后4周,山羊髁突软骨缺失区能形成成熟的软骨组织,12周时软骨未退变。对照组不能形成成熟的软骨组织。结论:骨髓基质细胞在自体软骨细胞基质的诱导下,可以修复山羊颞下颌关节髁突软骨面全层缺失。