自体骨髓基质干细胞-珊瑚羟基磷灰石修复下颌骨节段缺损的实验研究

目的应用骨髓基质干细胞（BMSCs）复合珊瑚羟基磷灰石（CHA）构建组织工程化骨，修复犬下颌骨节段性缺损。方法体外分离培养，成骨诱导扩增犬BMSCs，将第2代细胞复合CHA后修复5只犬自体下颌骨右侧3cm的节段缺损；6只犬植入单纯CHA作为对照，术后12、26、32周通过影像学、大体形态、组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果BMSCs-CHA复合物生长良好。随时间延长，X线片和CT显示实验组连接处骨痂形成，实验对照组连接处始终愈合较差；32周大体观察实验组骨修复较好，组织学显示有板层骨形成，连接处骨性愈合，实验对照组有编织骨形成，连接处纤维愈合。实验组与正常对照组下颌骨力学强度差异无统计学意义。结论自体成骨诱导BMSCs复合CHA形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损。     

应用细胞片层技术构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损的实验研究

目的应用骨髓间充质干细胞（BMSCs）细胞片层构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损,探讨细胞片层在成骨中的作用。方法采用密度梯度离心法分离和培养BMSCs,将BMSCs向成骨细胞诱导培养后,制备细胞片层。将细胞片层包裹到聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）支架表面,将其植入犬左侧下颌骨全层缺损中,对侧下颌骨植入无细胞片层包裹的支架复合体作同体对照。将16只犬分为4组,每组4只。术后4、8、12、16周分别处死1组,取材行大体及组织学观察。结果实验侧成骨好于对照侧,术后16周,实验侧骨缺损大部分被新生骨替代,舌侧形成与正常骨相似的密质骨,与正常骨断端骨性愈合。实验侧新生骨光密度值大于对照侧,两者差异有统计学意义（P<0.05）。实验侧可见较多哈弗氏系统及红骨髓,大量板层骨;对照侧哈弗氏系统较少。结论利用细胞片层技术可以构建出含板层骨结构的组织工程骨。     

hBMP-7基因修饰犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石修复下颌骨缺损

目的:构建携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞(dMSCs)复合珊瑚羟基磷灰石(coral hydroxyapatite, CHA),观察其修复下颌骨缺损的效果。方法:利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,转染dMSCs 与珊瑚羟基磷灰石支架材料复合,再分别植入取材动物的自体下颌骨缺损区,分别于4周和8周取材观察成骨情况。结果:大体观察、X线检查及组织学观察均发现构建组织工程骨在祼鼠皮下及骨缺损处均有明显新骨组织形成。结论:构建携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的重组腺病毒载体,体外转染dMSCs后复合珊瑚羟基磷灰石有较多量骨组织形成,可有效修复下颌骨缺损。[关键词] 人骨形态发生蛋白7 骨髓基质干细胞 腺病毒 组织工程     

犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石皮下成骨的实验研究

目的：犬自体皮下非受力部位植入犬骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）复合珊瑚羟基磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA），观察成骨情况及其转归。方法：体外分离培养、成骨诱导、扩增犬BMSCs，并通过细胞化学、免疫细胞化学检测成骨表型。将第2代细胞接种于CHA上，形成细胞一材料复合物，植于9只犬右侧腹部皮下，并在对称部位植入CHA作为对照。术后4、12、26周取材，HE染色，观察新生组织结构；通过形态计量学分析，对成骨情况量化，并行t检验。结果：成骨诱导后，细胞碱性磷酸酶染色阳性，免疫细胞化学显示骨钙蛋白表达阳性。HE染色示植入4周后，无明显骨形成；12周后，实验组有较多新生骨小梁形成，苦味酸-硫堇和Masson染色示骨基质和胶原形成良好；26周后，实验组骨小梁量有减少趋势。图像分析显示，实验组12周成骨量最高，差异有统计学意义。结论：犬BMSCs诱导后具有成骨活性，复合CHA后，可促进形成组织工程化骨。在无应力刺激情况下，随时间延长．局部成骨活动减弱。     

骨髓来源成骨细胞接种于珊瑚中再造下颌骨髁状突的研究

目的：研究用组织工程方法再造人下颌骨髁状突形状骨组织的可行性。方法：W本外培养、扩增、诱导兔骨髓基质干细胞（MSCs)、将细胞接种于人工下颌骨髁状突形状的多孔珊瑚中,植入裸鼠背部皮下组织中,术后1、2月取材,通过大体标本观察、X线检查,扫描电镜观察、组织学检查,观察新骨的形成情况。结果：大体标本观察,2月时成功地再造出具有髁状突解剖形态的骨组织、X线检查表明新组织骨骨和未降解的珊瑚构成;扫描电镜和组织观察均证明在珊胡表面和孔洞内有大量新骨形成,结论：骨髓来源成骨细胞接种于珊瑚中再造成特定形成骨组织的有效方法。     

组织工程骨促进犬牙槽骨再生的体内研究

目的：探讨以犬骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）为种子细胞,Bio-Oss小牛无机骨粉为支架,构建组织工程化骨,结合Bio-Gide胶原膜促进犬牙槽骨再生的可行性。方法：在3只犬的口腔里人工制作12个三壁骨缺损,每只犬的左侧为实验组,右侧为对照组。实验组：植入组织工程化骨;对照组：单纯植入Bio-Oss骨粉。手术后即刻及术后4周,8周,通过影像学和组织学方法（HE,Masson染色）检测骨缺损的再生效果。结果：术后8周,实验组X-ray可见缺损区新生骨骨量明显增加,切片HE染色见新生牙槽骨已充满骨缺损处,骨小梁成团状,Masson染色为红色;对照组X-ray可见骨缺损区阴影变浅,HE染色骨小梁排列凌乱,Masson染色为蓝绿色。结论：组织工程化骨促进犬牙槽骨再生是可行的。     

基因修饰的组织工程化骨修复骨质疏松症骨缺损的实验研究

目的 探讨人类骨形成蛋白2（hBMP-2）基因修饰的组织工程化骨修复骨质疏松症者骨缺损的可行性及方法。方法24只6个月龄雌性SD大鼠建立去势模型，按体重编号，随机分组。3个月后实验组骨髓问质干细胞（BMSC）转染hBMP-2质粒，对照组未作干预，在体外构建自体细胞组织工程化骨，植入下颌骨缺损区。结果术后4周时实验组有新生骨质形成，8周时成熟骨基质形成；对照组新生骨质数量明显少于实验组，且材料边缘及中央处有脂肪样结构形成。结论hBMP-2基因修饰的组织工程化骨可用于骨质疏松症者骨缺损的治疗。     

组织工程方法进行特定形态骨组织构建的研究

目的 用组织工程方法构建人下颌骨升支外形的骨组织。方法 体外培养、扩增、诱导兔骨髓基质干细胞（MSCs）,细胞长满后用基因重组人骨形成蛋白-2诱导 3天;收集细胞,按 5×107/ml的浓度混匀至 1.5％藻酸钠溶液中,然后接种于人下颌骨升支外形的多孔珊瑚中,以CaCl2固化后,植入裸鼠背部皮下组织中,于植入术后1、2个月取材,通过大体标本、X线检查、组织学检查观察新骨的形成情况。结果2月时形成的组织在裸鼠背部界限清晰,取材后观察珊瑚表面有坚硬组织形成,形状与支架材料的外形基本一致,X线检查证实珊瑚已有明显吸收,在其表面有明显X线组射影形成;组织学检查表明,在珊瑚表面及内部的孔洞内均有大量新骨形成,新骨形成过程为软骨内成骨。结论 用组织工程方法可以构建出特定形态骨组织,因此适于进行颌面部骨缺损的修复。     

三维多孔β-磷酸三钙修复下颌骨节段性缺损的生物力学分析

目的：观察三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）形成的组织工程骨对犬下颌骨极限节段性缺损的修复能力。方法：将经过诱导的犬骨髓基质细胞（BMSCs）与3.0cm×2.0cm×1.0cm的多孔β-TCP支架复合后植入犬的下颌骨3.0cm长的全层节段性缺损处。术后6个月通过CT影像学评价β-TCP/BMSCs复合体对犬下颌节段性缺损的修复能力,并和单纯植入β-TCP材料的对照组对比,同时将缺损区组织工程骨的生物力学性能和正常的犬下颌骨对比。结果：CT影像显示实验组犬的下颌骨极限缺损区已修复,下颌骨呈连续性,且形态较对照组完美。多孔β-TCP/BMSCs构建的组织工程骨和犬正常下颌骨的抗折强度测定结果无显著性差异,而抗压强度有显著性差异,组织工程骨抗压强度小。结论：三维多孔β-TCP/BMSCs复合体构建的组织工程骨修复的犬下颌骨节段性缺损能够耐受正常生理功能需要,达到了形态和功能修复的目的,为临床下颌骨缺损修复提供了重要的实验依据。     

大鼠骨髓基质细胞与胶原复合后修复牙槽骨缺损的研究

目的：探寻以大鼠骨髓基质细胞为种子细胞和胶原复合物为支架材料,构建组织工程骨的原理和方法修复齿槽骨缺损。方法：将SD大鼠骨髓基质细胞（Bone Marrows Stromal Cell,BMSc）进行体外培养并利用矿化液诱导为成骨样细胞,加入胶原（collagen）培养1d后,植入大鼠下颌骨缺损处,2周和4周后处死,取其下颌骨切片,观察成骨效应。结果：术后2周实验侧缺损区可见骨小梁形成,而对照侧无明显骨修复,4周后实验侧新骨形成量逐渐增加,而对照侧只有一些纤维组织修复。HE染色和mallory三色法染色结果也表明实验侧有新骨形成且逐渐增多。结论：应用胶原加体外诱导的成骨样细胞复合体移植可修复大鼠自体的牙槽骨缺损,为组织工程化骨在颌面外科及修复科领域的临床应用奠定了基础。     

骨髓基质细胞修复山羊髁突软骨缺失的绿色荧光蛋白示踪

目的:采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)对骨髓基质细胞体内修复髁突软骨全层缺失进行示踪观察。方法:扩增PG13细胞株,获得大量含GFP基因的假病毒液,并直接转染骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)。将含有GFP基因转染标记的BMSCs和少量软骨细胞与生物可降解材料复合后,植入山羊髁突软骨全层缺失处,1个月后应用激光共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSCs的分布。结果:标记的BMSCs植入关节软骨缺损1个月后,修复组织仍能高效表达GFP。激光共聚焦显微镜下显示:多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论:标记的BMSCs可在髁突软骨全层缺失区分化为成熟的软骨细胞,并在髁突软骨缺失的修复中发挥重要作用。     

GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞纯化方法的研究

目的:应用两种不同方法培养纯化绿荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞,以探求提高GFP小鼠骨髓间充质干细胞纯化效率的方法。方法:取4~6周龄GFP小鼠股骨全骨髓,采用贴壁法进行体外培养。待细胞融合至约80%,将细胞分为两组,分别采用常规法和改良法进行消化传代。荧光显微镜下观察各组细胞荧光状态及形态学特征,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标志物及绿荧光蛋白表达率,体外诱导观察其成骨、成脂能力。结果:贴壁法获得数量较多,形态多样的原代细胞。随着传代次数的增加,细胞形态一致性不断增高。与传统方法相比,改良法在不影响细胞增殖、分化潜能,不影响其GFP表达率的前提下,可以更早获得纯度较高的细胞。结论:改良法可提高纯化小鼠骨髓间充质干细胞效率,为其用于进一步研究工作提供基础。     

点突变型HIF-1α诱导犬骨髓基质干细胞骨向分化的研究

目的:检测点突变型HIF-1α对犬骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells.BMSCs)骨向分化的作用.方法:采用LR重组系统构建慢病毒载体Lenti-WT(wild HIF-lα)、Lenti-MT(mutant HIF-1α)及对照组LentiLacZ.分别用Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT转染犬BMSCs,以LacZ组为对照,成功转染后,分别在0、1、4、7、14及21d提取总RNA和蛋白质,通过RT-PCR和Western印迹检测目的基因在体外常氧条件下对BMSCs成骨因子表达的调控.将带有目的基因的BMSCs按2×105/孔接种至6孔板,分别于14d和21d,运用茜素红染色(alizarin red-S staining,ARS)检测其钙结节的表达采用SPSS 10.0软件包对数据进行统计学分析.结果:当MOI=9时,BMSCs的转染效率达90％以上.目的基因转染后第4天,BMSCs的成骨因子在mRNA和蛋白水平表达显著提高,14～21 d时达到高峰,并维持在高表达状态(P＜0.05).ARS结果表明,目的基因在常氧条件下可诱导BMSCs向成骨方向分化.结论:体外常氧条件下,突变型HIF-1α能够稳定表达且保持高度活性,Lenti-MT可显著提高犬BMSCs的成骨活性.     

冻存骨髓基质细胞和胶原膜在裸鼠体内的成骨研究

目的：研究经超低温冻存后的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内的成骨情况.方法：体外分离培养Beagle犬 BMSCs,冻存二代生长状况良好的BMSCs.12个月后,复苏冻存的BMSCs,并在体外构建BMSCs和0.5 cm×0.5 cm大小的BME-10X复合体.将胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液、胶原膜＋BMSCs＋基础培养液、单纯胶原膜＋矿化诱导培养液培养5 d后,植入裸鼠体内,并于术后第4、8、12周取出标本,进行大体观察和组织病理学分析.结果：单纯胶原膜＋诱导培养液组在植入胶原膜后,胶原膜边界清晰,膜边缘及内部基本没有细胞生长;在胶原膜＋BMSCs＋基础培养液组,术后第4周可见,胶原膜内有细胞长入,并有细小的条索状新生胶原形成,随着时间的延长,支架胶原逐渐分解,新形成的条索状胶原纤维变粗大;在胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液组,植入后也可见支架胶原的分解和更多的细胞生长,大量新生的胶原形成类骨质样组织.结论：冻存BMSCs复苏后进行体外培养扩增与诱导分化,并在在体内环境下复合胶原支架材料,仍然具有较强成骨能力.     

犬自体血清培养骨髓基质细胞的实验研究

目的:探讨犬自体血清培养骨髓基质细胞的可行性方法:获取犬自体血清,配制成含10%和20%自体血清的培养液,与含10%胎牛血清的培养液在相同条件下培养犬骨髓基质细胞(BMSCs)。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数以及MTT法对细胞增殖情况进行检测。并且对第2代细胞用3种不同血清成分培养液(均加入β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松)进行成骨诱导分化,采用免疫组化检测碱性磷酸酶及钙结节形成。对检测到的量化数据做统计学分析,比较各组间的差异,以评价不同血清成分培养液对细胞增殖分化的影响。结果:3组细胞的生长及形态无明显差别,经过诱导培养均能形成钙结节。对3组间量化检测做统计学分析,各组间差异无统计学意义。结论:制备的犬自体血清能完全替代胎牛血清对骨髓基质细胞进行诱导培养。     

PRF复合自体骨髓间充质干细胞修复兔牙槽骨缺损的研究

目的:观察富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)复合自体第3代骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)修复牙槽骨缺损的能力。方法:取健康雄性2月龄新西兰兔36只,随机分为4组:PRF+BMSCs组、PRF组、BMSCs组、空白对照组,均在全麻下微创拔除下颌左侧中切牙。4组实验动物分别在4、8、12周处死。取其下颌骨进行牙槽骨标本测量,X线观察,组织学观察。结果:牙槽骨标本测量比较:4组牙槽嵴宽度、高度丧失值均存在差异(P＜0.05);析因分析示PRF与BMSCs复合使用修复牙槽骨的效果优于单独使用PRF或BMSCs(P<0.05)。X线、组织学观察表明术后4、8、12周时拔牙窝骨吸收程度:PRF+BMSCs组＜PRF组＜BMSCs组＜空白对照组,PRF+BMSCs组成骨情况均优于PRF组、BMSCs组、空白对照组。结论:PRF复合自体BMSCs可以促进牙槽骨的再生与修复,具有潜在的临床应用价值。     

大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

新型多孔磷酸钙复合骨髓基质干细胞组织工程实验研究

目的观察新型生物材料多孔磷酸钙的生物相容性及复合骨髓基质干细胞（BMSCs）异位成骨情况。方法体外培养第2代Beagle犬BMSCs,转染绿色荧光蛋白（GFP）后与多孔磷酸钙（CPC）复合培养,获得最佳复合浓度,倒置和荧光显微镜、扫描电镜下观察BMSCs黏附和生长情况,复合体植入裸鼠皮下8周观察异位成骨。结果BMSCs转染GFP与多孔CPC复合培养1 d,细胞从材料中爬出,形态正常,7 d可见细胞伸出伪足,分泌基质;复合体可异位成骨。结论多孔CPC生物相容性好,是一种较理想的骨组织工程支架材料。