两种冷冻保护剂玻璃化冷冻小鼠卵巢的比较研究

目的:探讨两种玻璃化冷冻保护剂对小鼠卵巢组织学和功能的影响。方法:将23只4周龄ICR雌鼠随机分为新鲜卵巢移植组(6只)、去势组(5只)、EG40组(6只)和ED20组(6只)。EG40组和ED20组分别应用乙二醇(EG)和联合应用EG与二甲基亚砜(DMSO)玻璃化冷冻小鼠卵巢组织,一周后解冻,将一部分复苏卵巢组织自体移植入小鼠肾被膜下,另一部分组织行组织学观察。移植术后5d开始观察所有小鼠的动情周期,一个月后处死小鼠,对存活的卵巢组织行组织学观察。结果:EG40组、ED20组和新鲜卵巢移植组小鼠动情周期出现率均为100%,出现动情周期的天数分别为10.2±1.2d、8.0±0.9d和6.8±1.0d,EG40组动情周期出现天数明显多于新鲜卵巢移植组(P<0.01);ED20组与新鲜卵巢移植组差异无显著性(P>0.05)。移植存活的卵巢组织内可见不同发育阶段的卵泡,形态正常,但冻融卵巢组织内卵泡数量比新鲜组织少。结论:联合应用玻璃化冷冻保护剂EG和DMSO对小鼠卵巢组织学和功能的影响较小。     

3种玻璃化液对新生鼠卵巢的渗透反应及冻存效果的比较

目的:探索适宜新生鼠卵巢保存的玻璃化液和冷冻方案。方法:观察新生SD大鼠卵巢在预平衡液及3种玻璃化液中不同时间段的表面积变化,冻融后进行组织学观察和成年SD大鼠肾被膜下异体移植后在体活力分析。结果:新生鼠卵巢在预平衡液中出现渗透性脱水变化,移入EFS40(A组)、EG5.5(B组)、EG5.5/30(C组)3种玻璃化液中,再次剧烈皱缩。3min后,卵巢表面积分别为等渗液对照组表面积的63.2%、82.4%、70.8%。此脱水状态的卵巢玻璃化冻融后形态完整的卵泡百分率均与新鲜移植组(D组)无显著性差异(P>0.05);异体移植后,动情周期出现率和动情周期出现时间均与D组无显著性差异(P>0.05)。各冷冻移植组存活移植物均可见不同发育阶段的各级卵泡,但卵泡数目少于D组,移植20d时A组与D组间有显著性差异(P<0.05);移植60d时B组卵泡数少于D组,组间有差异(P<0.05);C组在各时间点上取材的卵泡数与D组均无差异(P>0.05)。结论:在预平衡液中15min、改良的EG5.5/30液中3min的二步渗透平衡法适宜新生鼠卵巢的玻璃化冷冻。     

4种冷冻-解冻方法对家兔卵巢组织形态学的影响

目的:探讨适宜的卵巢组织冻存方案。方法:采用PROH(A2组)及DMSO(B2组)慢速程序化冷冻和DMSO+PROH(C2组)及DMSO+EG(D2组)玻璃化冷冻方法,冻存家兔卵巢组织,解冻复苏后,以相应的4组新鲜组织为对照(A1-D1组),做HE染色,行组织形态学分析。结果:A1-D1组始基卵泡的形态正常率分别为90.1%、91.5%、91.8%、92.2%,其相对应的A2-D2组分别下降为67.6%、69.7%、70.5%、80.1%,差异均有统计学意义(P均<0.05)。冷冻组中A2组始基卵泡形态正常率最高,与B2、C2、D2组比,差异有显著性(P<0.05)。C2、D2组间比,差异无显著性(P>0.05)。各冷冻组合并后形态正常率始基卵泡为72.7%,初级卵泡为55.7%,两者比较有统计学差异(P<0.05)。4个冷冻组中均可见卵巢组织结构受损的表现。结论:4种冷冻解冻方法对卵巢皮质中各级卵泡及卵巢组织结构均造成一定程度的损害,使各级卵泡的形态正常率明显下降,卵巢间质细胞连接变得疏松;PROH慢速程序化冷冻法明显优于DMSO法及玻璃化法,较适合卵巢组织中始基卵泡的保存;冻存卵巢组织对初级卵泡的影响大于始基卵泡。     

兔卵巢组织玻璃化冷冻的实验研究

目的:探讨玻璃化冷冻法保存兔卵巢组织的效果。方法:随机将25只新西兰雌兔分为对照组(5只)、慢速冷冻组(10只)和玻璃化冷冻组(10只),比较各组冻融前后卵巢组织学、超微结构、卵泡凋亡(原位末端标记法,TUNEL)和子宫系膜内移植后卵巢功能的恢复情况。结果:新鲜组织、慢速冷冻复苏组织和玻璃化冷冻复苏组织中正常形态卵泡比例分别为87.36%、81.96%和82.72%,两冷冻组正常卵泡比例均低于对照组,差异有统计学意义?P(0.05),但玻璃化冷冻组与慢速冷冻组差异无统计学意义(P>0.05)。3组间卵泡凋亡比率分别为21.4%、13.5%和17.1%,差异无统计学意义(P>0.05);3组移植后兔动情周期出现率均为100%,动情周期出现天数差异无统计学意义?P>0.05);移植存活的卵巢组织内可见各级形态正常的卵泡发育。结论:玻璃化冷冻可有效保存卵巢组织的结构和功能,是一种简单、可行的兔卵巢组织冷冻保存法。     

两种冷冻方法对人类卵巢组织卵泡形态和组织增殖活性的影响

目的:探讨玻璃化冷冻和慢速冷冻何者更适于冻存人卵巢组织。方法:将10例因卵巢良性囊肿剔除术获取的人卵巢皮质组织切成薄片后随机分配到新鲜卵巢组(A组)、玻璃化冷冻组(B组)和慢速冷冻组(C组),通过光学显微镜和透射电子显微镜观察比较卵泡形态变化,免疫组织化学检测组织细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达变化。结果:A、B、C组中形态正常的原始卵泡比例分别占71.4%、70.1%、52.3%;形态正常的初级卵泡比例分别占76.0%、43.5%、31.8%;C组中形态正常的原始卵泡比例和初级卵泡比例均明显低于A、B组(P<0.05);B组形态正常的原始卵泡比例和初级卵泡比例与A组相比无统计学差异(P>0.05)。A、B组中形态正常的原始卵泡超微结构无明显改变,但B组中初级卵泡和C组中原始卵泡和初级卵泡的超微结构存在一定程度的改变。PCNA阳性表达主要见于卵母细胞、颗粒细胞和卵巢组织间质细胞,3组中均有PCNA表达,且表达无统计学差异。结论:玻璃化冷冻较慢速冷冻对人卵巢组织影响小,是一种较适宜的人卵巢组织冷冻保存方法。     

不同浓度保护剂对超速冻存小鼠卵巢组织的效果观察

目的:寻找适宜的小鼠卵巢组织超速冻存低温保护剂种类及浓度。方法:以不同浓度二甲亚砜(DMSO)和丙二醇(PROH)(1.5　mol/L、3　mol/L)作低温保护液时,观察超速冻存法对小鼠卵巢组织的冻存效果。解冻后行自体和异体卵巢的肾被膜下移植。通过对受体动情期的恢复及激素水平测定等方法对冻存效果进行观察。结果:低浓度组DMSO和PROH动情期的恢复率分别为75%和71%;血清E2分别为(10.5和16.8)×10-9　mmol/L,与作为对照的慢速程序法组无显著性差异(66.7%和100%;11.7×10-9　mmol/L和12.1×10-9　mmol/L)。高浓度动情期的恢复率分别为100%和62.5%;血清E2分别为14.1×10-9　mmol/L(DMSO)和7.4×10-9　mmol/L(PROH),与慢速组比也无显著性差异。结论:两种浓度的DMSO和PROH均适用于超速冻存法,尽管高浓度的DMSO在超速冻存时可取得较好的动情周期恢复率,但血清E2 水平的结果以低浓度的PROH为好。     

玻璃化冷冻法对小鼠MⅡ卵纺缍体及染色体的影响

目的:探讨玻璃化冷冻法对小鼠MⅡ卵纺缍体及染色体的毒性。方法:收集小鼠MⅡ卵,分A组(新鲜对照组)、B组、C组和D组(玻璃化冷冻法冻融后分别培养0h、1h和3h固定)及E组、F组和G组(MⅡ卵经玻璃化冷冻液处理后分别培养0h、1h和3h固定),共7组,固定后免疫荧光标记纺锤体和染色体。结果:各组纺锤体正常率无显著差异(P>0.05),染色体正常率:B组显著低于A组(50%vs 87.5%,P<0.01),E组(47.62%)和F组(45%)显著低于A组和G组(75%)(P<0.05)。纺锤体和染色体均正常率:B组显著低于A组(41.67%vs 75%,P<0.05),E组(47.62%)和F组(45%)显著低于A组和G组(75%)(P<0.05)。B、C、D及E、F、G组的细胞骨架正常率依次提高,且玻璃化冷冻组(B组、C组和D组)和冷冻液暴露组(E组、F组和G组)相应时段(0h、1h及3h)比较(即B组与E组、C组与F组及D组与G组比较)均无显著差异(P>0.05)。结论:冷冻保护剂的细胞毒性在玻璃化冷冻损伤中起主要作用,但它对纺缍体的损伤是可逆的。     

银制封闭式冷冻载体改善人卵巢组织异种移植效果的研究

目的:探讨银制封闭式玻璃化冷冻载体促进人卵巢组织冷冻后移植严重免疫缺陷(SCID)鼠新生血管效果。方法:收集2015年4月至2016年6月在我院妇科手术治疗的患者卵巢组织共8例,每例患者标本随机等量分配到银制封闭式冷冻管及传统封闭式冷冻管玻璃化冷冻保存。选取40只SCID鼠,分为银制封闭式玻璃化冷冻管组及传统封闭式玻璃化冷冻管组(每组20只),分别移植两种封闭式玻璃化冷冻法复苏后的卵巢皮质到SCID鼠皮下,测定CD31反映卵巢皮质新生血管,比较两组人卵巢组织冷冻复苏后移植SCID鼠皮下保存效果。结果:移植后3天和7天,两组中卵巢皮质新生血管数差异无统计学意义(P0.05);移植后14天和21天,银制封闭式玻璃化冷冻管组中卵巢皮质新生血管数高于传统封闭式玻璃化冷冻管组(P0.05)。结论:银制封闭式玻璃化冷冻管与传统封闭式玻璃化冷冻管相比能更好地保存卵巢皮质功能,在深低温保存人卵巢组织中具有应用价值。     

细胞松弛素B预处理人卵行玻璃化冻融后纺锤体与染色体变化的研究

目的:探讨细胞松弛素B(cytochalasin B,CCB)预处理对改善人卵玻璃化冷冻的效果。方法:收集常规IVF-ET或ICSI-ET周期中成熟卵母细胞71枚,随机分成4组行玻璃化冷冻。A组(17枚)、B组(20枚)、C组(17枚)分别用CCB预处理20min、30min、40min后行玻璃化冷冻,D组(17枚)不用CCB处理直接玻璃化冷冻。冻存3周后融冻卵母细胞,复苏的卵母细胞行荧光染色固定,在共聚焦显微镜下观察各组卵母细胞纺锤体及染色体形态结构。结果:A、B、C、D各组间的复苏率(70.59%、64.71%、50.00%和64.71%)无统计学差异(P>0.05),4组间的纺锤体及染色体正常形态率(27.27%,30.00%,45.46%及33.33%)亦无统计学差异(P>0.05)。结论:冷冻使成熟卵母细胞纺锤体及染色体的正常形态结构受到一定程度的破坏,CCB并不能保护卵母细胞纺锤体及染色体在冻融过程中的损伤。     

人成熟卵母细胞玻璃化冻存时长对体外受精-胚胎移植结局的影响

目的:探讨玻璃化冷冻人成熟卵母细胞的时长是否会影响解冻后卵细胞的复苏率、受精率和临床妊娠结局。方法:回顾性分析2013年5月至2018年6月就诊于北京大学第三医院生殖医学中心行成熟卵母细胞玻璃化冷冻,随后进行解冻受精形成胚胎培养移植的110例患者114个冷冻卵母细胞周期的临床资料。根据卵细胞冻存时间分为3组,A组(冻存时间≤3个月)42例,B组(3个月<冻存时间≤12个月)42例,C组(冻存时间>12个月)30例,比较3组的卵细胞解冻复苏率、受精率、可利用胚胎率、优质胚胎率、临床妊娠率和活产率等指标。结果:114个冷冻卵母细胞周期中最短冻存时间4天,最长32个月,共行胚胎移植周期114个,其中新鲜胚胎移植周期77个,解冻胚胎移植周期37个。共解冻成熟卵母细胞1578枚,复苏率为77.69%(1226/1578)、受精率为69.35%(774/1116)、卵裂率为93.41%(723/774)、可移植胚胎率为42.19%(305/723)、优质胚胎率为33.06%(239/723)、每冻卵活产率为2.47%(39/1578)。3组年龄、不孕年限、基础卵泡刺激素(FSH)水平、窦卵泡数、解冻卵细胞数和男方精液情况等基本信息差异无统计学意义(P>0.05),而A组体质量指数(BMI)明显大于B组(P=0.038);3组的解冻复苏率、受精率、卵裂率、可利用胚胎率、优质胚胎率、临床妊娠率、早期流产率和活产率的差异均无统计学意义(P>0.05)。随访25例活产新生儿均未发现先天畸形。结论:人成熟卵母细胞的发育潜能不会随着冷冻时间的延长而减低,玻璃化冷冻卵母细胞可获得比较满意的复苏效果。     

壬基酚孕期经口染毒对F1代昆明小鼠卵巢发育的影响

目的:观察壬基酚孕期暴露对F1代昆明小鼠卵巢发育的影响。方法:交配后7d起,对孕鼠分别每日灌胃壬基酚(NP)(分别为1.2mg/kg、12mg/kg、120mg/kg),对照组灌胃花生油,直至交配后17d,每组7只。子代小鼠出生14d时取卵巢组织病理学检查,计数各级卵泡。观察子代雌鼠观察阴道开口时间和规律动情周期出现时间。子代雌鼠成年3月龄后,于动情前期处死,放免法测定血清E2、FSH浓度,酶联免疫吸附法测定血清抑制素B浓度,取卵巢组织行病理学检查,计数各级卵泡。结果:NP低剂量组阴道开口出现时间提前(P<0.05);低、中剂量组规律动情周期出现时间提前并可见动情周期延长(P<0.05);高剂量组性成熟期始基卵泡数减少(P<0.05),血清抑制素B水平降低(P<0.05);各用药组动情前期血清E2水平降低(P<0.05),FSH水平无明显变化。用药组体质量较对照组明显升高(P<0.05)。结论:壬基酚胎仔宫内暴露,在较低剂量时可影响小鼠的动情起始及动情周期,在较高剂量时可降低卵巢储备,并可影响成年后小鼠雌激素水平。     

不同冷冻方法对小鼠不同成熟时期卵母细胞纺锤体的影响

目的:探讨不同冷冻方法对小鼠成熟期(MⅡ期)及生发泡期(GV期)卵母细胞的纺锤体及胚胎发育的影响。方法:收集GV期和有纺锤体的MⅡ期小鼠卵母细胞,随机分为3组:慢速冷冻-快速复温组、超高速玻璃化冷冻组和对照组(未冷冻组)。Polscope观察解冻0、3、6h后存活的MⅡ期及体外培养成熟GV期卵母细胞的纺锤体,有明显纺锤体的行卵胞浆内单精子显微注射受精,评价胚胎发育。结果:(1)超高速玻璃化GV组的存活率、卵裂率均显著高于慢冻GV组(P<0.05);(2)两冷冻MⅡ组解冻后0、3及6h纺锤体出现率和优质胚胎率均显著低于对照MⅡ组(P<0.05);(3)超高速玻璃化GV组体外成熟后纺锤体的出现率、优质胚胎率均显著高于超高速玻璃化MⅡ组(P<0.05)。结论:慢速冷冻-快速复温法对小鼠不同成熟时期卵母细胞的纺锤体损伤较大;超高速玻璃化冷冻对小鼠生发泡期卵母细胞纺锤体的影响则较小,是一种简便、快捷、高效的冷冻方法。     

Production of the first offspring from oocytes derived from fresh and cryopreserved pre-antral follicles of adult mice

Although mammalian ovaries contain hundreds of thousands of pre-antral follicles, fewer than 1% of these reach maturity and ovulation. Obtaining immature eggs from the pre-antral follicles of ovarian tissue could increase the possibility of preserving fertility in women undergoing anti-cancer treatment, and in women who wish to delay pregnancy and child raising until they are older. This study reports the birth of 10 healthy mouse pups derived from oocytes obtained from pre-antral follicles after adult ovary tissue cryopreservation and allotransplantation. High in-vitro maturation (55.1%), fertilization (76.3%) and cleavage (98.3%) rates were achieved using these oocytes, and there was no significant difference between the vitrified and control samples except in maturation rate (55.1 versus 72.8%, P < 0.05). After an ultra-rapid vitrification procedure, the warmed tissue fragments were transplanted beneath the kidney capsule of severe combined immunodeficient mice for onward in-vivo culture. Within 10 days of culture, 138 full size oocytes developed from the 456 transplanted pre-antral follicles. In-vivo growth of follicles was followed by in-vitro oocyte maturation, in-vitro fertilization and subsequent embryo transfer, leading to the birth of 10 healthy pups. These results may lead to increasing the possibility of preserving fertility by cryopreservation of ovarian tissue.     

βB2晶状体蛋白对小鼠卵巢发育及动情周期的影响

目的:初步探讨βB2晶状体蛋白(Crybb2)参与调节生殖过程的作用机制。方法:选取11-13周龄βB2基因敲除(KO组,n=19)与野生型C57BL/C(WT组,n=23)雌性小鼠,阴道涂片观察动情周期变化;HE染色观察卵巢病理变化;光学显微镜下计数卵巢最大切面原始卵泡、初级卵泡、闭锁卵泡;Western blotting和免疫组织化学确定βB2晶状体蛋白在卵巢组织中的表达与定位。结果:βB2晶状体蛋白主要表达在WT组小鼠卵巢颗粒细胞内。与WT组小鼠相比,KO组小鼠卵巢相对重量减轻,动情周期紊乱,原始卵泡、初级卵泡减少,闭锁卵泡增多。结论:βB2基因敲除小鼠的动情周期及卵巢发育异常,βB2晶状体蛋白对小鼠卵巢的发育有重要影响。     

冻融人卵巢组织与体细胞共培养对卵泡生长发育和卵巢组织内分泌影响

目的评价冻融人卵巢组织与人早孕蜕膜细胞共培养对卵巢组织内分泌和卵泡生长发育的影响。方法 2008年3月至8月将冻融的人卵巢组织与人早孕蜕膜单层细胞共培养。实验分四组:A组:经玻璃化冻融卵巢组织与人早孕蜕膜单层细胞共培养;B组:经程序化冻融卵巢组织与人早孕蜕膜单层细胞共培养;C组:经玻璃化冻融卵巢组织单独培养;D组:经程序化冻融卵巢组织单独培养。冻融卵巢组织在共培养体系中培养14d,培养期间隔天吸取1次培养液,测定培养液中雌二醇、孕酮含量,并比较培养前后冻融卵巢组织中总体卵泡存活率(TFSR)、卵泡生长率(GFR)。结果 A组和B组,TFSR培养前后比较差异无统计学意义(P>0.05),GFR培养前后比较差异有统计学意义(P<0.01);C组和D组,培养前后TFSR、GFR比较差异有统计学意义(P<0.01)。TFSR、GFR培养后A组和B组比较,差异无统计学意义,C组和D组比较差异亦无统计学意义。A组与C组、D组、B组与C组、D组分别比较TFSR、GFR均差异有统计学意义(P<0.01)。四组间雌二醇、孕酮水平差异有统计学意义(P<0.01)。结论两种冷冻方法冻融的卵巢组织经体外培养仍具有内分泌功能,原始卵泡...     

Effect of mouse ovarian tissue cryopreservation by vitrification with Rapid-i closed system

Purpose

Currently, open systems are mainly used for cryopreservation of ovarian tissue, oocytes, and embryos, but there is a potential risk of contamination. This study was performed to assess ovarian tissue cryopreservation by a closed vitrification system (Rapid-i vitrification system?), which is already used clinically for oocyte/embryo cryopreservation.

Methods

Ovaries of C57BL/6J mice were frozen and thawed by using the Rapid-i vitrification system? (Rapid-i) followed by implantation into recipient mice. Hematoxylin-eosin staining was performed for histological examination of the frozen-thawed ovaries to assess follicle grade. Fertility after implantation of the ovaries was assessed from the live birth rate and the number of live pups.

Results

There was no significant difference in grade 1 primary follicles between fresh ovaries (control group, 94.2?±?2.9%) and frozen-thawed ovaries (Rapid-i group, 87.1?±?1.8%). However, there was a significant decrease in grade 1 early and late secondary follicles in the Rapid-i group compared with the control group. The live-birth rate was significantly lower in the Rapid-i group compared with the control group (29.2 vs. 83.3%, p?<?0.05). On the other hand, there was no significant difference in the average number of live pups between the control group and the Rapid-i group (3?±?0.4 vs. 2.7?±?0.3).

Conclusions

The Rapid-i seems to be effective for cryopreservation of mouse ovarian tissue. Under appropriate conditions, the Rapid-i could be employed for ovarian tissue cryopreservation and preservation of fertility in humans.

     

玻璃化冷冻保存羊卵巢组织异种移植的实验研究

目的:探讨羊卵巢组织玻璃化冷冻复苏后异种移植的卵泡生长发育情况。方法:取绵羊的卵巢,将卵巢皮质切块,应用玻璃化快速冷冻法保存。羊卵巢组织片复苏后在裸鼠的颈部皮下移植,每只裸鼠移植2块组织,于移植1个月后获取移植物,HE染色观察存活卵泡的情况。结果:共移植组织16块,取材时肉眼可见其中一块组织纤维化萎缩,镜下见此块组织纤维化,移植组织存活率87.5%(14/16)。HE染色观察每只移植小鼠的2块移植物中基本只有1块有可视卵泡。1只鼠未见可视卵泡;1只鼠见1个不典型原始卵泡;1只鼠有2个不典型原始卵泡;余下5只鼠的移植卵巢组织中均可见多个典型的存活卵泡。结论:羊卵巢组织经冷冻复苏后能够成功移植于裸鼠的颈部皮下,大部分卵泡处于良好的存活状态。