CTLA4Ig抑制BMP2基因转染的MSCs诱导的免疫应答

目的通过腺病毒介导人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)及人骨形态发生蛋白2(BMP2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达,探讨CTLA4Ig对BMP2转染的异基因MSCs诱导的免疫应答的抑制作用。方法以CTLA4Ig和BMP2重组腺病毒转染MSCs。ELISA法检测包装的病毒感染MSCs后,CTLA4Ig及BMP2蛋白的表达;观察CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。结果腺病毒载体介导CTLA4Ig和BMP2体外感染的MSCs能够分泌CTLA4Ig及BMP2蛋白,且CTLA4Ig融合蛋白可以有效抑制AdBMP2基因转染的MSCs的刺激作用。结论给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗可有效的抑制AdBMP2转染的异基因MSCs引起的免疫应答,诱导MSCs移植耐受;为BMP2基因修饰的同种异体间的MSCs移植提供了实验依据。     

CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植的体外实验研究

目的 探索重组腺病毒载体（Recombinant adenovirus,rAdv）介导CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植免疫耐受的分子机制。方法 构建CTLA4Ig重组腺病毒载体,转染猪树突状细胞（Dendritic Cell,DC）,以猪表皮细胞匀浆液为刺激原,观察DC递呈猪表皮抗原刺激人T细胞增殖、活化及信号转导的影响;同时,以CTLA4Ig转染小鼠DC细胞,观察该DC膜表面分子CD40、CD80表达。结果 CTLA4Ig转染DC能显著抑制人外周血T淋巴细胞增殖能力（P＜0.01）和T细胞肌醇磷脂信号系统转导活性,IL－2分泌亦受到明显抑制（P＜0.05）;转染CTLA4Ig的小鼠DC膜表面分子CD80表达降低（P＜0.05）。结论 腺病毒介导CTLA4Ig基因转染转皮能诱导人外周血T淋巴细胞免疫耐受。     

CTLA4Ig和CD40LIg基因修饰骨髓间充质干细胞在异种胰岛移植排斥反应中的作用

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)和T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)在异种胰岛移植排斥反应中的作用及其可能的机制。方法将SD大鼠胰岛细胞移植到Wistar糖尿病大鼠肾包膜下,建立SD-Wistar大鼠的异种胰岛移植模型,用携带CTLA4Ig和CD40LIg基因重组腺病毒感染的MSCs进行干预治疗。取造模成功的糖尿病大鼠45只,按随机数字表法分为3组(每组15只):对照组只植入胰岛细胞;单纯MSCs组植入胰岛细胞和MSCs;基因转染MSCs组植入胰岛细胞及CTLA4Ig和CD40LIg基因转染的MSCs。观察胰岛移植后糖尿病大鼠的生存情况、血糖变化和移植物病理形态学的改变,检测移植物CTLA4Ig、CD40LIg和胰岛素的表达以及胰岛移植大鼠细胞因子水平的变化。结果①糖尿病大鼠血糖在移植后2 d降至正常,对照组血糖平均在移植后8 d升高,单纯MSCs组和基因转染MSCs组血糖分别在21 d和49 d升高。②对照组、单纯MSCs组和基因转染MSCs组,移植物存活时间分别为(10.2±2.1)、(23.5±6.8)和(52.1±7.3...     

CTLA4Ig基因表达对鼠皮肤移植免疫抑制作用的研究

目的　探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法　供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4Ig导入Wistar大鼠体内 ,用蛋白质斑点印迹实验检测血清中CTLA4Ig的表达 ,用腺病毒荧光抗体检测腺病毒在脏器的分布。同时还观测了各脏器的病理改变及移植物生存时间。结果　CTLA4Ig腺病毒在肝、脾、心、肺、肾均有明显分布 ,但实质细胞均未见严重损伤性改变。CTLA4Ig基因能在血清中的表达高峰时间一般在 7d左右 ,移植皮肤的生存显著长于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　从静脉注射导入的CTLA4Ig基因能在大鼠体内表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。     

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。方法 将CTLA4Ig cDNA插入腺病毒表达质粒；将重组质粒与病毒基因组质粒共转染293细胞，产生重组腺病毒；采用dot-ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后，以dot-ELISA法筛选到2个293细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑，PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig，为进行器官移植基因治疗研究提供了工具。     

重组腺病毒介导的CTLA4Ig基因在哺乳动物体内表达的研究

目的 了解CTLA4Ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法 用所构建的CTLA4Ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠，Wistar大鼠，兔，小香猪，羊体内，应用蛋白质斑点印记检测CTLA4Ig在以上动物血清中的表达情况，同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果 重组腺病毒转染7d后大鼠，小鼠血清出现CTLA4Ig持续表达2周。各动物未见异常死亡，各脏器未见明显病理改变。结论 CTLA4Ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠，Wistar大鼠。     

应用重组腺病毒载体制备人CTLA4Ig融合蛋白

目的在实验室水平制备并鉴定人CTLA4Ig融合蛋白.方法将人CTLA4Ig cDNA片段构入重组腺病毒载体中,用该表达载体感染293细胞并在其中表达人CTLA4Ig,再应用SPA亲合层析柱自细胞培养上清中纯化出该融合蛋白,以WESTERN印迹验证后,观察了所制备CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应的影响.结果经亲合层析柱洗下的蛋白为分子量为53.0kd的单一组分,经WESTERN印迹证实为CTLA4Ig,并发现所制备CTLA4Ig能呈剂量依赖性抑制混合淋巴细胞反应.结论本法成功制备了具有生物学活性的重组人CTLA4Ig融合蛋白.     

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞诱导特异性免疫耐受的实验研究

目的　通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs)中的表达 ,探讨CTLA4Ig体外诱导特异性免疫耐受的机制 ,为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植 (hematopoieticstemcelltransplantation ,HSCT) ,达到预防移植物抗宿主病 (graft versus hostdisease ,GVHD)和纠正预处理损伤的造血微环境 (hematopoieticinductivemicroenvironment,HIM)积累实验依据。方法　以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (mutiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs,利用亲和层析的方法纯化培养上清中的目的蛋白CTLA4Ig ,加入到混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)体系中 ,通过MTT显色观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应 ,以ELISA检测体系中IL 2的水平。结果　纯化的CTLA4Ig对MLR反应体系中淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用 ,且在一定范围内与CTLA4Ig的浓度呈依赖性关系 ;体系中IL 2水平与淋巴细胞数有相似的变化趋势 ,且成正相关 (γ =0 85 2 2 ) ;CTLA4Ig组的淋巴细胞数与IL 2水平与对照组相差显著 (P <0 0 5 )。结论　转染后BMSCs表达的目的蛋白CTLA4Ig能有效阻断B7/CD2 8共刺激信号途径 ,从而抑制T细胞活化 ,抑制IL 2的产生     

腺病毒介导CTLA4Ig基因转染骨髓基质细胞及其对CD34+细胞粘附力的影响

目的：通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞）Bone marrow stromal cells,BMSCs）中的表达，探讨CTLA4Ig基因修饰的BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力的变化，方法：以CTLA4Ig－重组腺病毒按感染复数（Mutiplicity of infetion,MOI)50转染BMSCs，免疫组的^3H-TdR标记CD34^ 细胞的cpm值观察CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞的粘附力变化，结果：免疫细胞化学染色示CTLA4Ig表达阳性率达85％（MOI＝50），弥漫性定位于细胞质，免疫磁体阳性选择获取的骨髓CD34^ 细胞纯度可高达97．8％，转染组与对照组BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力无显著差异（P＞0．05）。结论：CTLA4Ig－重组腺病毒能有效介导CTLA4Ig基因在BMSCs中表达，并对其粘附力无显著影响。     

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的：了解CTLA－4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率，为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法：用所构建的CTLA－4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞，应用免疫组化检测CTLA－4Ig的表达情况，结果：与重组腺病毒共培养6h使HeLa细胞获得转染，12h开始表达，36h表达达高峰；人成纤维细胞8h获得转染，24h开始表达，60h后达高峰，人脐静脉内皮细胞4h获得转染，12h开始表达，36h后达高峰。结论：CTLA－4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞。     

腺病毒介导的CTLA4Ig和OX40Ig基因转移诱导大鼠心脏移植物长期存活的作用

目的探讨腺病毒介导CTLA4Ig和OX40Ig基因转移延长异基因大鼠心脏移植物存活时间的作用及其相关机制。方法将Lewis大鼠随机分为5组对照组、空载病毒AdEGFP处理组、AdCTLA4Ig处理组、AdOX40Ig处理组和AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组。在心脏移植的同时,对照组不予其他处理,其他各组分别经尾静脉注射(1~5)×109pfu/ml AdEGFP、AdCTLA4Ig、AdOX40Ig、AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig进行耐受诱导,每天观察心脏移植物的存活情况,完全停跳的心脏经组织学证实后定为排斥。ELISA法测定目的基因的表达水平。混合淋巴细胞反应、过继转移实验、IL-2逆转实验和RT-PCR检测研究其诱导耐受的机制。结果心脏移植物的平均存活时间AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组(151.5d±42.8d),AdCTLA4Ig处理组(43.2d±11.1d),AdOX40Ig处理组(60.2d±11.4d)与对照组(5.7d±0.5d)和空载病毒AdEGFP处理组(5.2d±0.4d)比较明显延长(P均<0.01),并且AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组在延长移植物存活时间上明显优于AdCTLA4Ig和AdOX40Ig处理组(P均<0.01)。耐受Lewis大鼠脾细胞对供体DA大鼠脾细胞表现为低应答,并且该低应答状态能够被外源性白细胞介素-2(IL-2)部分逆转。过继转移结果说明该低应答状态能够转移给同系正常Lewis大鼠。在耐受大鼠体内发生了Th1/Th2型细胞因子偏移。结论AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig介导的基因转移能够在大鼠体内长期高效表达,并诱导异基因心脏移植物长期存活,其机制可能与T细胞无能、Th1/Th2型细胞因子偏移及其调节性T细胞等有关。     

腺病毒载体介导CTLA4Ig基因治疗小鼠变应性鼻炎

目的 检测CTLA4Ig-重组腺病毒载体（Ad-CTLA4Ig）在变应性鼻炎治疗中的作用。方法 采用卵清蛋白（OVA）致敏和激发诱导小鼠变应性鼻炎。实验组在OVA激发前30min予以Ad-CTA4Ig腹腔注射。未转CTLA4IgcDNA的腺病毒载体（Adv）作对照。比较各组动物鼻部症状和鼻粘膜形态学改变，并采用ELISA法测定血清中OVA－特异性IgE水平。结果 CTLA4Ig重组腺病毒实验组小鼠鼻部症状和鼻粘膜病理改变不明显，并且血清中OVA－特异性IgE水平明显低于对照组（P＜0.05）。结论 Ad-CTLA4Ig可防治小鼠应变性鼻炎的发生，提示CTLA4Ig-重组腺病毒载体有可能运用于临床变应性鼻炎的治疗。     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

局部CTLA4Ig转基因治疗大鼠小肠移植排斥

目的 :研究CTLA4Ig基因在小肠局部转染表达及其表达产物对小肠移植物存活的作用。方法 :移植前经肠系膜上动脉供给肠灌注脂质体包裹的CTLA4IgcDNA ,应用免疫组织学及RT PCR观察移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达。结果 :免疫组织学及RT PCR结果显示在移植后 2 8天内移植小肠中有CTLA4Ig转基因产物的表达 ,18例移植小肠中的 11例在受体内的存活时间超过 90天。结论 :经肠系膜上动脉体外灌注脂质体包裹的CTLA4IgcDNA可有效转染移植小肠 ,转染的移植小肠在受体内可长时间存活     

Inhibition of rejection in murine islet xenografts by CTLA4Ig and CD40LIg gene transfer

Background Costimulatory signals play a vital role in T cell activation. Blockade of costimulatory pathway by CTLA4Ig or CD40LIg have enhanced graft survival in experimental transplantation models yet mechanisms remain undetermined.We investigated the effects of CTLA4Ig and CD40LIg gene transfer on islet xenografts rejection in rats.Methods Human islets were infected with recombinant adenoviruses containing CTLA4Ig and CD40LIg genes and implanted beneath the kidney capsule of diabetic rats. Levels of blood sugar, morphological changes, and survival of grafts were recorded. Expressions of CTLA4Ig, CD40LIg and insulin were detected by immunohistochemical staining and cytokines levels were quantified by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Results Blood glucose levels in transplant rats decreased to normal level on the 2nd day post transplantation. The mean blood glucose in the control group, CTLA4Ig transfected group, CD40LIg transfected group and CTLA4Ig ＋CD40LIg cotransfected group increased on days 8, 24, 21, 68, post transplantation respectively. The grafts in control group, CTLA4Ig transfected group, CD40LIg transfected group and CTLA4Ig ＋ CD40LIg cotransfected group survived for （8±1）, （29±4）, （27±3）, and （74±10） days, respectively. Survival in CTLA4Ig ＋ CD40LIg cotransfected group was significantly longer. Survivals of CTLA4Ig transfected group and CD40LIg transfected group were significantly longer than control group. In controJ animals, serum interleukin-2 and tumor necrosis factor a concentration significantly increased within seven days post transplantation. Haematoxylin eosin staining of grafts showed live islets in situ of transplant rats without inflammatory cell infiltration. Immunohistochemical staining confirmed the expression of insulin at islets in all experimental groups.Conclusions Transfer of CTLA4Ig and CD40Llg genes, especially the cotransfer of both, inhibits rejection of murine islet xenografts. Downregulated expressions of Th1 cells related cytokines might be related to the beneficial effects.     

Effects of CTLA4-Ig Gene-modified Dendritic Cells on the Corneal Allografts

The success of corneal transplantationis most a-mongtransplant operation,but thei mmunorejectionisthe pri mary reasonfor the failure of corneal transplan-tation currently.Decreasing the i mmunologic rejectionis helpful to advance the success rate of the operation.Dendritic cells(DCs)are the most i mportant antigenpresenting cells(APC)[1]and have double functions inthei mmunity system.Langerhans cells(LC)are theDCs on the corneal epithelium.Recent studies indica-tedthat LCplayi mportant ro…     

CTLA4Ig基因修饰的BMSCs在GVHD发生中的意义

目的　通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs)中表达 ,探讨CTLA4Ig体外诱导T细胞特异性免疫耐受的可行性及其机制 ,并观察该基因修饰的BMSCs促进造血的功能。方法　以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (mutiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs,利用亲和层析的方法纯化培养上清中的目的蛋白CTLA4Ig,加入到混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)体系中 ,通过MTT显色观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应 ,以ELISA检测体系中IL 2的水平 ;通过BMSCs支持CD34+ 细胞扩增 ,观察基因修饰对其支持造血的影响。结果　纯化的CTLA4Ig对MLR反应体系中淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用 ,且在一定范围内与CTLA4Ig的浓度呈依赖性关系 ;体系中IL 2水平与淋巴细胞数有相似的变化趋势 ,且成正相关 (r =0 .85 2 2 ) ;CTLA4Ig组的淋巴细胞数与IL 2水平与对照组相差显著 (P <0 .0 5 ) ,但支持CD34+细胞扩增的能力无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论　CTLA4Ig的表达能有效阻断B7 CD2 8/CTLA4共刺激信号途径 ,从而抑制T细胞活化 ,抑制IL 2的产生 ;而该基因的表达未明显影响BMSCs支持造血的功能     

CTLA4Ig表达质粒的基因枪转染皮肤及细胞的实验研究

目的 利用基因枪技术提高CTLA4Ig的cDNA的转染效率。方法 设基因枪局部转染组，注射器局部注射组和肌肉注射组，并构建pCTLA4Ig-IRES2-EGFP表达载体，将质粒注射入皮肤，观察三种方法转移CTLA4Ig目的DNA的存留时间。同时，体外培养ECV，293细胞，用基因枪或逆转录病毒载体转染上述质粒，观察质粒的转染及表达情况。结果 基因枪转移基因至细胞，皮肤的效率明显好于其他方法，但对细胞，基因枪的初始压力不能太高，否则，细胞容易死亡。结论 基因枪转染CTLA4Ig质粒效率较高。     

间接抗原递呈途径在同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用研究

目的　探讨间接同种异型识别在体外培养的同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用。方法　体外分离培养人表皮细胞 (Epidermalcells ,EC)、异体人外周血淋巴细胞 (Peripheralbloolymphocytes ,PBL)和单个核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBM ,含单核细胞 )。将毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA4Ig)腺病毒载体转染EC。转染与未转染的EC中均加入异体PBL或PBM共同培养 ,应用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 ( 3H TdR)掺入法 ,测定各培养系中PBL、PBM增殖情况。结果　CTLA4Ig腺病毒载体能成功转染EC并表达相应蛋白。未转染的EC刺激异体PBL轻度增殖 (P <0 .0 5 ) ,以及刺激含单核细胞的PBM明显增殖 (P <0 .0 1) ;经CTLA4Ig腺病毒载体转染的EC刺激PBL、PBM增殖则明显减弱 (P <0 0 5 )。结论　间接同种异型识别在EC排斥中发挥了重要作用 ,CTLA4Ig能明显减轻该作用。     

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中，脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig-IRES2-EGFP转染PA317细胞，在G418选择压力下，通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA317细胞克隆，MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体，生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。结论 IRES序列调控CTLA4Ig与EGFP双基因在细胞中同时独立表达。