融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果

观察融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效应。方法：采用编码11个精氨酸（11R）的穿膜肽序列融合HSP70基因序列,构建重组腺病毒载体AdCMV-HSP70s、AdCMV-HSP70（无穿膜肽对照）和AdCMV-EGFV（空载体对照）。Western blotting、ELISA法检测重组腺病毒介导的HSP70基因在胃癌SCG-7901细胞中的表达,MTT检测重组腺病毒感染后HSP70分泌性表达对胃癌细胞的抑制作用。裸鼠移植瘤模型的抗瘤实验检测HSP70基因联合CIK细胞对胃癌移植瘤的抗瘤效应。结果：与AdCMV-HSP70感染细胞比,AdCMV-HSP70s感染细胞的HSP70表达量明显增加[胃癌SGC-7901细胞：（360.72±20.89） vs（121.01±15.94）ng/ml,P<0.05 ;胃黏膜上皮GES-1细胞：（188.62±10.82） vs（135.00±13.96） ng/ml,P<0.05]。融合11R的HSP70蛋白能够穿膜并分泌到细胞外后对胃癌细胞产生一定的增殖抑制作用[MOI=100 pfu/cell时,细胞存活率（66.33±4.33）% vs（101.33±7.64）%,P<0.01]。AdCMV-HSP70s+CIK联合治疗对胃癌移植瘤的抑制率显著高于AdCMV-HSP70+CIK组[（66.5±7.3)% vs (43.6±5.6)%, P<0.05],该组移植瘤组织间质中CD3+T细胞浸润数量也明显多于后者。结论：融合穿膜肽可明显促进HSP70蛋白的表达和分泌,和CIK细胞联合治疗能增强抗瘤免疫效应,从而显著抑制裸鼠胃癌移植瘤。     

5-FC/CD 自杀基因疗法结合热休克蛋白-多肽复合物瘤苗治疗小鼠黑色素瘤的研究

 目的　研究 5 -氟尿嘧啶 /胞嘧啶脱氨酶 (5 FC/ CD)基因疗法与热休克蛋白 -多肽复合物 (HSP- PC)瘤苗免疫疗法联合抗肿瘤效果。方法　将携带 CD基因的重组腺病毒注射到小鼠黑色素瘤体内 ,腹腔注射 5 - FC,同时皮下接种 HSP70 - PC。结果　经联合治疗后 ,70 %荷瘤小鼠肿瘤体积缩小、消退 ,小鼠存活期延长 ,肿瘤组织明显坏死 ,炎症细胞、CD+4 及 CD+8T细胞浸润明显。结论5 - FC/ CD基因疗法结合 HSP- PC瘤苗免疫疗法抗小鼠黑色素瘤作用显著 ,具有临床应用前景。     

骨髓间充质干细胞对小鼠Heps肝癌移植瘤组织作用的研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSC)接种于小鼠Heps肝癌移植瘤后局部免疫效应及肿瘤细胞促血管生成因子表达的变化,探讨MSC用于肝癌治疗的可能性及安全性.方法 体外贴壁培养法制备昆明小鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定MSC表型.4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对MSC 进行标记备用.随机取54只8周龄雄性昆明小鼠建立Heps肝癌移植瘤模型.移植瘤长径达0.5～0.8 cm时,随机分为MSC组、DAPI组、生理盐水 (NS) 对照组.MSC组及DAPI组分别向小鼠Heps 肝癌移植瘤内注射2×10~6 MSC及DAPI标记的MSC,观察荷瘤小鼠生存期.利用免疫组化法检测肿瘤组织中CD4 ~+T、CD8~+ T及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并行常规组织学检查.结果 MSC组平均生存期为45(95%CI:33-56) d,NS对照组平均生存期为33(95%CI:28-37)d,两组比较差异有统计学意义(P相似文献   

热休克蛋白72-甲胎蛋白抗原表位肽复合物抗小鼠肝癌Hepal-6细胞免疫的实验研究

目的:以热休克蛋白72(HSP72)-甲胎蛋白(AFP)抗原表位肽复合物免疫小鼠,研究该复合物针对AFP肿瘤是否具有特异性抗肿瘤免疫.方法:以HSP72-AFP多肽复合物皮下注射免疫昆明小鼠,并分别以AFP多肽和HSP72单独免疫小鼠为对照组.ELISA法检测免疫后小鼠血清IFN-γ水平、MTT法检测各免疫组小鼠淋巴细胞对肝癌Hepal-6细胞的杀伤作用、以小鼠体内瘤负荷实验评价蛋白复合物的免疫效应.结果:HSP72-AFP多肽复合物组小鼠血清IFN-γ水平、淋巴细胞对Hepal-6细胞的杀伤作用均显著高于AFP多肽和HSP72组(P＜0.01).HSP72-AFP多肽复合物组瘤体积也明显小于AFP多肽和HSP72免疫组(P＜0.01).结论:HSP72-AFP多肽复合物疫苗可诱导荷瘤小鼠产生针对AFP肿瘤的特异性细胞免疫,其对瘤细胞的杀伤效应明显优于两者单一的多肽纯化疫苗.表明HSP72-AFP多肽复合物可诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫.     

溶血性链球菌制剂的抗瘤作用及机理研究

本试验检测了溶血性链球菌制剂(HSP)的抗瘤活性。当对小鼠移植ECA细胞前三天及后三天各ip0.5mgHSP一次,荷瘤小鼠生存期明显延长。在荷瘤鼠中经HSP或CP诱导的中性粒细胞的抗瘤活性与未经诱导鼠的相比,差异有显著性(P<0.01),与非荷瘤鼠经HSP诱导的中性粒细胞抗瘤活性相比,差异也有显著性(P<0.05)。HSP、BCG、CP都能促进C_(57)BL/6小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子,巨噬细胞培养上清促进胸腺细胞增殖的最适剂量约为1:32,其中以HSP致生效果较好。     

癸酸能够活化CD8+ T细胞并提高其抗肿瘤免疫反应能力

目的：探究中链脂肪酸癸酸对CD8+ T细胞活化的影响,及其对CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应的作用和机制。方法：建立C57BL/6小鼠黑色素瘤B16F10 皮下荷瘤模型,随机分为癸酸组（10 mg/kg 癸酸灌胃）和对照组（等量溶剂灌胃）,观察癸酸对小鼠肿瘤生长以及生存率的影响,采用流式细胞术检测肿瘤微环境中浸润CD8+ T细胞的活化水平。建立B16F10-OVA和OT-I T细胞共培养体系,采用流式细胞术检测癸酸对CD8+ T细胞的肿瘤细胞杀伤能力的影响。采用α-CD8抗体清除B16F10 荷瘤小鼠体内CD8+ T细胞,观察对小鼠肿瘤体积的影响。小鼠原代CD8+ T细胞经癸酸处理后,采用WB、ELISA及qPCR、流式细胞术检测T细胞受体（TCR）活化、效应细胞因子产生以及增殖和代谢水平。在B16F10荷瘤小鼠模型中,观察α-PD-1抗体联合癸酸给药对小鼠肿瘤生长以及生存率的影响。结果：在小鼠黑色素瘤荷瘤模型中,与对照组相比,癸酸组小鼠移植瘤体积显著降低且生存率显著提高（均P<0.05）,肿瘤浸润CD8+ T细胞IFN-γ和TNF-α的表达水平显著升高（P<0.01）。经癸酸处理的OT-I T细胞对B16F10-OVA细胞的杀伤水平显著升高（P<0.01）。在荷瘤小鼠模型中用α-CD8 抗体清除CD8+ T 细胞后,癸酸对移植瘤的抑制作用显著降低（P<0.000 1）。小鼠原代CD8+ T细胞经癸酸处理后,TCR活化水平显著升高、细胞因子IL-2和IFN-γ的产生增多、线粒体代谢水平显著上调（均P<0.05）。在黑色素瘤荷瘤小鼠模型中,癸酸与α-PD-1抗体联用,能够显著抑制小鼠移植瘤生长并提高其生存率（均P<0.05）。结论：癸酸能够促进CD8+ T细胞活化、增强其抗肿瘤免疫反应能力。     

小鼠肠癌HSP70多肽复合物的纯化及其抗肿瘤免疫效应

目的:应用AKTA-purifier100液相层析系统,建立分离和纯化热休克蛋白70(HSP70)多肽复合物的方法,并观察其抗肿瘤免疫保护效应。方法:采用DE-AE-Sepharose离子交换层析和ADP-Ag-arose亲和层析,从热处理的BALB/c鼠源性结肠癌细胞(CT26)制备裂解液中分离、纯化HSP70多肽复合物,并通过主动免疫保护实验观察其抗肿瘤免疫效应。结果:纯化蛋白经鉴定为相对分子质量70×103左右的HSP70多肽复合物;平均1g湿重肿瘤细胞可获得63.63μgHSP70多肽复合物;HSP70主动免疫的小鼠可抵抗CT26细胞的攻击。结论:用此层析法可分离纯度较高的HSP70,并可诱导明显的抗肿瘤免疫保护效应。     

MCF-7荷瘤裸鼠不同树突状细胞亚群凋亡的研究

目的:通过建立MCF-7荷瘤裸鼠模型,研究树突状细胞(DCs)不同亚群的凋亡,为设计新的免疫治疗方法和新的疫苗提供详尽信息。方法:建立MCF-7裸鼠模型,随机分为荷瘤组和对照组,肿块达5 mm后处死裸鼠,取骨髓单个核细胞进行DCs诱导、分化,流式细胞仪上检测表面分子标志CD86、CD83、MHC-Ⅱ及CD34,AnnexinⅤ检测CD11c及CD123了解DCs亚群的凋亡率。结果:骨髓起源单个核细胞培养至第9天出现典型DCs形态特征,荷瘤组和对照组细胞均高表达CD86、CD83及MHC-Ⅱ,而CD34表达两组均较低。荷瘤组CD11c+CD123-细胞为(52.01±1.43)%,对照组为(56.36±1.76)%;CD123+CD11c-细胞荷瘤组为(32.19±1.71)%,对照组为(28.95±1.39)%。荷瘤组mDC凋亡率为(23.64±2.43)%,较对照组(20.05±2.49)%高,P<0.05。荷瘤组小鼠pDC凋亡率为(11.53±2.92)%,较对照组(14.96±2.96)%低,P<0.05。结论:MCF-7乳腺癌小鼠体内DCs存在mDC和pDC两种亚型,mDC凋亡率增加,使诱导Th1免疫反应能力减低;而pDC凋亡率减少,诱导体内免疫耐受的发生,机体抗肿瘤免疫反应能力因而下降。     

Th17细胞过继免疫治疗对荷弥漫大B细胞淋巴瘤小鼠肿瘤生长的影响

目的 探讨Th17细胞过继免疫治疗对荷弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)小鼠肿瘤生长的影响.方法 采用Mini MACS免疫磁珠分离纯化BALB/c小鼠脾来源的CD4+ CD62L+初始T细胞,采用"转化生长因子(TGF-β)、白细胞介素6(IL-6)、干扰素γ抗体(anti-IFN-γ)、白细胞介素4抗体(anti-IL-4)、白细胞介素23(IL-23)"因子组合体外诱导小鼠Th17细胞分化,采用ELISA法测定Th17细胞产生IL-17水平;采用DLBCL细胞株SUDHL-4接种SCID小鼠建立DLBCL荷瘤小鼠模型;选择0、8、18d(3组,5只小鼠/每组)对荷瘤小鼠进行Th17细胞过继免疫治疗,计算肿瘤体积,观察荷瘤小鼠生存期.结果 小鼠在接种SUDHL-4细胞8d左右均形成瘤结节,成瘤率为100％.与对照组小鼠相比,3个过继免疫治疗组小鼠肿瘤体积均明显缩小(P＜0.05),荷瘤小鼠生存期均显著延长(P＜0.05).结论 Th17细胞过继免疫治疗对DLBCL荷瘤小鼠具有抗肿瘤作用.     

序贯处理交联—免疫共沉淀法制备肺癌干细胞伴侣分子抗原肽瘤苗的研究

摘 要：［目的］ 探索制备肺癌干细胞伴侣分子肿瘤抗原肽复合物的方法。［方法］ 采用肿瘤干细胞微球体培养分离法进行肺癌干细胞的培养与富集。选择鸦胆子油乳和125放射性碘粒子序贯处理肺癌干细胞,诱导伴侣分子抗原肽表达,同时选用普通肺癌细胞作为对照。采用交联—免疫沉淀法分离与鉴定伴侣分子抗原肽复合物制作成肺癌干细胞和普通肺癌细胞瘤苗。将肺癌干细胞与普通肺癌细胞进行荷瘤小鼠实验对比治疗效果。［结果］ 通过肺癌干细胞微球体培养分离法,成功培养出肺癌细胞微球体。结果显示鸦胆子油乳联合125放射性碘粒子可充分诱导肺癌细胞及肺癌干细胞中伴侣分子抗原肽的合成,且表达量与鸦胆子油乳的浓度成正比。肺癌细胞和肺癌干细胞中HSP70、HSP90表达与生理盐水比较,差异均有统计学意义（P<0.001）。两种细胞抑制肿瘤生长作用、延长小鼠生存期上亦均有统计学差异（P<0.05）。［结论］ 鸦胆子油乳联合125放射性碘粒子序贯处理和交联—免疫共沉淀法可充分诱导、分离与鉴定肺癌细胞及肺癌干细胞伴侣分子抗原肽的合成,肺癌干细胞较肺癌细胞更多地表达伴侣分子抗原肽,可提高肿瘤细胞的免疫原性,制作的瘤苗疗效更好,以期在防治肺癌和其复发上有较好的应用价值。     

The study on the expression of membrane HSP70 protein in H22 cell and its immunoprotective mechanism against carcinoma

The mRNA and protein expression of HSP70 were studied using RT-PCR and FCM techniques. It's immune protective effects in vivo and the cytotoxicity in vitro were also observed. Results showed that cell viability didn't change under 42-43 degrees C, but declined in 44-45 degrees C; the level of HSP70 mRNA decreased initially (0.5-4.0 hour) but gradually resumed and increased from 8 to 12 hours at 42 degrees C. The positive cells expressed membrane HSP70 were significantly higher in heat shocked group than in a control group (P<0.001); the highest positive rate was 96.8% at 43 degrees C. The C3H mice immunized with heat shocked H22 cells could resist a secondary subcutaneous inoculation of parental H22 cells and their tumorigenic rate was significantly lower than that in mice immunized with parental H22 cells and RPMI 1640 control mice, which were 1/9.7/8 and 8/8, respectively. Their median survival time was also longer than that of parental cell group and RPMI 1640 control group, which were >90 days, 73.5 days, and 39.5 days, respectively. Through heat-treated tumor cell and lymphocyte mixed culture (TLMC), the induced lymphocytes had higher cytotoxic activities than that of splenic cells. The cytotoxicity against H22 cells reached 65.38% (2 hrs, 42 degrees C) and 67.84% (12 hrs, 43 degrees C) and could be blocked by anti-HSP70 McAb. Phenotype analysis revealed that the rate of TCR gammadelta+ cells rose with increasing cytotoxic activity, but no similar changes could be found in the CD4+ CD8+ TCR alphabeta+ subset. These results suggest that proper heat shock conditions can improve the immunogenicity of tumor cells and CD4- CD8- TCR gammadelta+ T carried on cytotoxic function via the HSP70 molecule.     

HIFU治疗后肿瘤抗原对树突状细胞的活化及其抗肿瘤效应

目的：探讨HIFU治疗小鼠H22抑制性肝癌后产生的肿瘤抗原对机体抗肿瘤免疫功能增强的机制。方法：正常小鼠骨髓中提取骨髓细胞，在rmIL-4、rmGM-CSF奈件下培养7d，制备小鼠骨髓树突状细胞，用HIFU治疗小鼠移植性肝癌后产生的肿瘤抗原活化树突状细胞，再用活化后的树突状细胞激活T淋巴细胞为细胞毒性T细胞，用MTT法检测CTL在体外特异性杀伤肿瘤靶细胞的能力。结果：B16肿瘤HSP70-肽复合物组和H22肿瘤HSP70-肽复合物组的脾淋巴细胞的增殖率均高于阴性对照组、H22肿瘤粗提物组和HIFU后H22肿瘤粗提物组，P〈0．001；但两组之间差异无统计学意义，P〉0．05。H22肿瘤HSP70-肽复合物组CTL对H22肿瘤细胞的杀伤率为70．0％，明显高于阴性对照组、H22肿瘤粗提物组和HIFU后H22肿瘤粗提物组（P〈0．001），但对非靶细胞B16肿瘤的杀伤率与上述各组的差异无统计学意义；B16肿瘤HSP70-肽复合物组CTL对B16肿瘤细胞的杀伤率为78．5％，对H22细胞的杀伤率为21．4％，表明CTL对肿瘤细胞的杀伤作用具有特异性。结论：HIFU治疗后坏死肿瘤组织中的HSP70-肽复合物作为肿瘤疫苗，通过活化DC和刺激T淋巴细胞增殖为CTL，发挥特异性抗肿瘤免疫功能。     

B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70的制备及其抗瘤效应

背景与目的:恶性B型淋巴细胞表面免疫球蛋白(surface membrane immunoglobulin,SmIg)表达的独特型决定簇(Idiotypic determinant,Id)不仅是该类肿瘤特异性标记,也是该类肿瘤的特异性抗原,可诱导机体对其产生特异性免疫应答,但由于Id是自体成分,分子量小,免疫原性较弱。人热休克蛋白70(heat shock protein,Hsp70)是一类重要的抗原提呈分子,能有效加强抗原肽的免疫原性。本研究通过制备慢性B型淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphatic leukemia,B-CLL)患者瘤细胞膜表面独特型单链抗体(Idiotypic determinant single-chain antibody,Id-ScFv)和Hsp70两种蛋白,在体外研究两者联合抗瘤作用并初步探讨其机制。方法:分别在大肠杆菌中表达Id-ScFv和Hsp70两种蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis)及ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)检测鉴定后,分别用金属螯合层析和离子交换层析纯化并在体外将这两种蛋白结合成复合物(Hsp70-Id)。用MTT法及检测Id-ScFv组、人Hsp70组及Hsp70-Id组刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖作用,以ELISA法检测各组培养上清中IL-12和TNF-α水平,并用流式细胞术检测各组PBMC亚群的变化。用活细胞计数法检测各组被激活的PBMC对慢性B细胞白血病细胞株Daudi、慢性髓性白血病细胞株K562和肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果:经SDS-PAGE电泳分析纯化后表达产物的分子量大约为30ku(Id-ScFv蛋白)和70ku(Hsp70蛋白),分别与其理论预期值相符。PBMC的增殖作用、培养上清中IL-12和TNF-琢水平,Hsp70-Id组明显强于Id-ScFv组和人Hsp70组(P<0.05),而Id-ScFv组和人Hsp70组明显强于阴性对照组(P<0.05)。流式细胞术检测显示在Hsp70-Id组、Id-ScFv组和人Hsp70组PBMC中CD8 T细胞亚群的百分率均有增加,其中Hsp70-Id组最明显。在Id-ScFv组和Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用较K562、HepG2细胞强(P<0.05),且Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用明显强于Id-ScFv组(P<0.001)。结论:成功获取B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70两种纯化蛋白;Hsp70-Id在体外可增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖、活化CD8 T细胞并诱导具有抗肿瘤作用的Th1型细胞因子的分泌有关。     

来源于成纤维细胞激活蛋白α的多肽疫苗FAPτ的抗肿瘤效应

目的 了解来源于成纤维细胞激活蛋白α的多肽疫苗 – FAPτ的抗肿瘤效应。方法 将抗原FAPτ与氟氏不完全佐剂混合均匀,在第1、14、21天于小鼠背部皮下多点注射进行免疫,于第17天给小鼠接种肿瘤细胞,记录小鼠肿瘤体积变化曲线及存活率曲线。肿瘤接种22天后对小鼠进行尾静脉取血并取脾脏分离脾脏淋巴细胞。ELISA检测小鼠血清内FAPτ抗体滴度;脾脏淋巴细胞体外经抗原FAPτ再次刺激,流式细胞仪检测CD8⁺ T细胞内IFN-?γ的产生。结果 FAPτ免疫组小鼠肿瘤生长速度低于PBS对照组,存活率高于PBS对照组。FAPτ 免疫组小鼠血清内产生较高的抗体滴度;其脾脏CD8⁺ T细胞内有更高水平的IFN-?γ表达。结论 多肽疫苗FAPτ能够有效激活机体的体液免疫应答和CD8⁺ T细胞免疫应答,显示出较强的抗肿瘤活性。     

熊果酸对小鼠H22 移植瘤的抑制作用研究

目的： 观察熊果酸 (ursolic acid,UA)对小鼠H22移植瘤的抑制作用并对其机制进行探讨。方法：将75只昆明种小鼠于左前腋下皮下接种H22肝癌细胞,24 h后随机分为5组,每组15只,模型组、环磷酰胺 (cyclophosphamide,CP)对照组[25 mg/ (kg·d)] 和UA低、中、高剂量药物组[50、100、150 mg/ (kg·d)]。UA各剂量组和CP对照组分别以相应剂量UA和CP灌胃,模型组以等体积花生油灌胃,每天灌胃1次,连续给药2周。末次给药24 h后,称小鼠体质量,摘除眼球取血后处死。无菌条件下完整剥离小鼠肿瘤及肝、肾、脾组织,计算抑瘤率及肝、肾、脾指数;HE染色观察肿瘤组织病理学改变;分离脾淋巴细胞,CCK8法测定小鼠脾淋巴细胞增殖活性;免疫组化法检测肿瘤组织中CD4+、CD8+ T细胞亚群的分布情况,计数CD4+ T细胞和CD8+ T细胞个数。并采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测血清中白细胞介素12 (interleukin-12,IL-12)的浓度。结果：UA各剂量组小鼠H22肿瘤质量增长均较缓慢,其中UA中、高剂量组肿瘤质量明显减小,与模型组比较,差异均具有统计学意义 (P<0.05);UA中、高剂量组抑瘤率分别为30.15%和39.80%。UA各剂量组肝、肾指数与模型组比较差异无统计学意义 (P>0.05),而脾指数则随UA剂量增加逐渐升高,其中,UA中、高剂量组脾指数与模型组比较差异具有统计学意义 (P<0.05)。HE染色病理观察结果显示,模型组肿瘤细胞生长旺盛,细胞体积较大,胞质丰富,少见坏死区域;UA干预组肿瘤组织中瘤细胞生长增殖明显受到抑制,肿瘤细胞数量减少,密度降低,排列稀疏,细胞核固缩深染或破裂,细胞间质较多,核浆比例减少,坏死区域明显增多。CCK8实验结果显示,随着UA剂量增加,脾淋巴细胞增殖活性逐渐升高,其中,UA中、高剂量组脾淋巴细胞增殖活性显著升高,与模型组间的差异具有统计学意义 (P<0.05)。免疫组化结果显示,UA中、高剂量组肿瘤组织中CD4+、CD8+ T细胞个数与模型组比较均明显增加,差异具有统计学意义 (P<0.05)。UA高、中、低剂量组血清中IL-12的含量均较模型组升高,差异均有统计学意义 (P<0.05);UA高剂量组与CP对照组相比亦显著升高 (P<0.05)。 结论：一定剂量UA可抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长,其作用机制可能与UA促进机体免疫器官发育和淋巴细胞增殖,增加CD4+、CD8+ T细胞向肿瘤组织浸润,并提高血清中IL-12等抗肿瘤活性细胞因子的浓度诱导细胞免疫有关。     

DNA vaccination of HSP105 leads to tumor rejection of colorectal cancer and melanoma in mice through activation of both CD4 T cells and CD8 T cells

We report that HSP105, identified by serological identification of antigens by recombinant expression cloning (SEREX), is overexpressed in a variety of human cancers, including colorectal, pancreatic, thyroid, esophageal, and breast carcinoma, but is not expressed in normal tissues except for the testis. The amino acid sequences and expression patterns of HSP105 are very similar in humans and mice. In this study, we set up a preclinical study to investigate the usefulness of a DNA vaccine producing mouse HSP105 whole protein for cancer immunotherapy in vivo using BALB/c and C57BL/6 mice, Colon26, a syngeneic endogenously HSP105-expressing colorectal cancer cell line, and B16.F10, a melanoma cell line. The DNA vaccine was used to stimulate HSP105-specific T-cell responses. Fifty percent of mice immunized with the HSP105 DNA vaccine completely suppressed the growth of subcutaneous Colon26 or B16.F10 cells accompanied by massive infiltration of both CD4+ T cells and CD8+ T cells into tumors. In cell transfer or depletion experiments we proved that both CD4+ T cells and CD8+ T cells induced by these vaccines play critical roles in the activation of antitumor immunity. Evidence of autoimmune reactions was not present in surviving mice that had rejected tumor cell challenges. We found that HSP105 was highly immunogenic in mice and that the HSP105 DNA vaccination induced antitumor immunity without causing autoimmunity. Therefore, HSP105 is an ideal tumor antigen that could be useful for immunotherapy or the prevention of various human tumors that overexpress HSP105, including colorectal cancer and melanoma.     

过继性免疫治疗对非小细胞肺癌患者外周血T细胞亚群的影响

目的 研究细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞治疗对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者外周血T细胞亚群及一般情况的影响。方法 采集非小细胞肺癌患者外周血,常规方法体外扩增CIK细胞,分三次回输患者体内,流式细胞仪检测非小细胞肺癌患者治疗前与治疗3次后T细胞亚群的变化,分析其与健康对照组相比外周血T细胞亚群的差异,并观察CIK细胞治疗前后患者一般情况变化。结果 与对照组相比,NSCLC患者外周血中CD3⁺ T 细胞比例、CD3⁺CD4⁺T细胞比例、CD4⁺/CD8⁺ 比值显著下降（P<0.05）,CD3⁺CD8⁺ T细胞比例显著升高（P<0.05）。CIK细胞治疗后与治疗前,CD3⁺ T 细胞比例、CD3⁺CD4⁺ T细胞比例、CD4⁺/CD8⁺ T细胞比值显著升高（P<0.05）,CD3⁺CD8⁺ T细胞比例显著降低（P<0.05）。CIK细胞治疗后与对照组相比,CD3⁺ T 细胞比例、CD4⁺/CD8⁺T细胞比值显著下降（P<0.05）。CD3⁺CD4⁺ T细胞比例、CD3⁺CD8⁺ T细胞比例升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。CIK细胞治疗前Tregs较对照组显著升高（P<0.05）。CIK细胞治疗后与治疗前相比,Tregs比例显著下降（P<0.05）。结论 CIK细胞输注治疗可以增强NSCLC患者的免疫功能,并改善患者的一般情况,提高生活质量,且未见明显不良反应。     

同种肿瘤来源的HSP70-PC对原位的大鼠膀胱肿瘤的治疗研究

 目的 研究用来自亚高温盆腔区域热疗后原位大鼠膀胱肿瘤的热休克蛋白70-肽复合物（HSP70-PC）对原位大鼠膀胱肿瘤的治疗作用机制。方法 经尿道膀胱灌注MNU制备出大鼠膀胱肿瘤动物模型。将动物随机分为A（肿瘤对照）组、B（HSP70-PC治疗）组、C（肿瘤细胞裂解液治疗）组，每组5只。皮下注射治疗1个月后检测膀胱及肿瘤湿重，肿瘤分期分级，TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数（AI），免疫组化检测肿瘤细胞增殖细胞核抗原指数（PCNA LI）、肿瘤组织中S-100蛋白阳性细胞率及CD8阳性细胞率、膀胱引流区域髂动脉及腹主动脉旁淋巴结中S-100蛋白阳性细胞率、脾脏S-100蛋白阳性细胞率及CD8阳性细胞率，ELISA法检测血清Rat IFN-γ含量。结果 膀胱及肿瘤湿重B组低于A、C组（P＜0.01）。A、C组间差异无显著性意义（P = 0.610）。B组肿瘤分期低于A、C组（P＜0.01）；A、C组间差异无显著性意义（P =1.00）。肿瘤分级各组间差异均无显著性意义（P =1.00）。B组肿瘤细胞AI、膀胱肿瘤组织中CD8阳性细胞率、血清Rat IFN-γ含量均高于A、C组（P＜0.01）；A、C组间差异均无显著性意义（P =0.870，0.597，0.979）。脾脏S-100蛋白阳性细胞率及CD8阳性细胞率由高到低依次为B、C、A组（P＜0.01）。肿瘤细胞PCNA LI、膀胱肿瘤组织中S-100蛋白阳性细胞率、淋巴结中S-100蛋白阳性细胞率三组之间差异均无显著性意义（P =0.808，0.718，0.847）。结论 皮下注射HSP70-PC可以上调原位的膀胱肿瘤大鼠的细胞免疫状态，促进肿瘤凋亡，但对肿瘤细胞增生无影响。     

HSP70-Id复合物修饰的树突状细胞体外诱导特异性抗肿瘤作用

目的观察人慢性B淋巴细胞性白血病（B-CLL）细胞的独特型抗原Id-ScFv与热休克蛋白70（HSP70）形成复合物修饰的树突状细胞（DC）体外诱导特异性抗肿瘤作用,并初步探讨其机制。方法将HSP70与Id-ScFv体外结合形成复合物HSP70-Id,修饰自人外周血单核细胞获取的DC。倒置相差显微镜观察DC的形态特征;流式细胞仪检测修饰前后DC的表型变化,酶联免疫吸咐试验（ELISA）检测DC分泌的白细胞介素12（IL-12）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测修饰的DC对自身淋巴细胞的激活和增殖作用,流式细胞仪检测激活的自身淋巴细胞T细胞亚群的变化,台盼蓝染色法检测其对Daudi、K562和HepG2等细胞的杀伤作用。结果DC体外诱导培养成功,HSP70-Id复合物可使DC成熟,镜下可见典型的DC形态,其CD1a表达率为20％-30％,CD83表达率〉72％,CD86和HLA-DR表达显著增加（P〈0．05）,上清中IL-12、TNF-α亦显著高于DC对照组（P〈0．01）。HSP70-Id复合物修饰的DC激活自身淋巴细胞,对Daudi细胞的杀伤率为71．24％,而对K562细胞杀伤作用较弱,对HepG2细胞无明显作用。其淋巴细胞亚群中,CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞的比例均显著增加,分别为56．51％和70．21％,CD4^＋T细胞／CD8^＋T细胞比值由空白对照组的1．49倒置为0．81。结论HSP70-Id复合物修饰的DC生物学活性增强,经其刺激后,传代培养的淋巴细胞可产生高效而特异性的抗肿瘤免疫效应,可能是CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞及DC协同作用的结果。