大鼠脾脏来源树突状细胞的分离培养及生物学特性

目的 建立从大鼠脾脏中分离单个核细胞并诱导及纯化树突状细胞(DC)的方法,并分析其生物学特性. 方法 采用胶原酶消化并裂解红细胞获得脾细胞悬液,密度梯度离心获得单个核细胞,单次贴壁法去除淋巴细胞.在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4的培养基中培养诱导DC,获得贴壁细胞群和悬浮细胞群.应用流式细胞仪测定OX62、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达. 结果 大鼠脾脏来源DC在体外培养7～8 d后OX62表达率达到高峰.在贴壁细胞中出现OX62的高表达,而CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达与悬浮细胞无统计学差异(P＞0.05). 结论 脾脏来源的单个核细胞经过7～8 d的培养,在贴壁细胞群中可收获大量DC,且贴壁DC更为幼稚.     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定。方法根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7d和14d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况。结果新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形,胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低。诱导分化7d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则;MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低。诱导分化14d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态;MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0%~86.2%。结论密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法。     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的 建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定.方法 根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30 ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7 d和14 d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况.结果 新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形, 胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低.诱导分化7 d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则; MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低.诱导分化14 d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态; MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0% ～86.2%.结论 密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF+IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法.     

大鼠脾脏来源树突状细胞的分离培养及生物学特性

目的建立从大鼠脾脏中分离单个核细胞并诱导及纯化树突状细胞(DC)的方法,并分析其生物学特性。方法采用胶原酶消化并裂解红细胞获得脾细胞悬液,密度梯度离心获得单个核细胞,单次贴壁法去除淋巴细胞。在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4的培养基中培养诱导DC,获得贴壁细胞群和悬浮细胞群。应用流式细胞仪测定OX62、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达。结果大鼠脾脏来源DC在体外培养7~8 d后OX62表达率达到高峰。在贴壁细胞中出现OX62的高表达,而CD80、CD86和MHC-II的表达与悬浮细胞无统计学差异(P>0.05)。结论脾脏来源的单个核细胞经过7~8 d的培养,在贴壁细胞群中可收获大量DC,且贴壁DC更为幼稚。     

大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导、扩增树突状细胞及其功能鉴定

目的：以大鼠骨髓造血干细胞为来源，建立体外诱导、扩增树突状细胞(dendritic cells，DC)的方法，并进行表型鉴定及功能检测。方法：从大鼠骨髓细胞中分离出造血干细胞，加入rGM-CSF、rIL-4和nrhTNF-α培养12天获得大量DC，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁珠分离纯化后的DC，进行形态学观察、表型检测及刺激T细胞增殖能力分析。结果：大鼠骨髓造血干细胞经诱导培养12天后，倒置显微镜和电镜下显示典型的DC形态和超微结构；流式细胞术分析显示细胞表面抗原高表达，其中OX62为62．19％；MHCⅠ为70．40％；MHCⅡ为78．28％；CDSO为55．58％；CD86为68．38％，是典型的大鼠DC表型特征，同种混合淋巴细胞反应结果显示，DC具有高效的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。结论：大鼠骨髓造血干细胞可成功诱导为具有典型形态特征及功能的DC，为进一步研究其在肿瘤免疫治疗中的应用打下基础。     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的:探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞(DC)分离培养树突状细胞的优化方法。方法:取正常成人新鲜血液,经密度梯度离心法,利用连续贴壁的方法获得单个核细胞,采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导产生成熟DC,倒置显微镜观察树突状细胞结构,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果:连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10%胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83 HLA-DR 及CD80 CD86 。结论:采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

大鼠骨髓主要细胞成分的分离获取及其免疫调节作用

目的:建立分离获取大鼠骨髓主要细胞成分的方法,了解其免疫调节作用,为骨髓主要细胞成分输注诱导同种异基因移植物免疫耐受奠定基础。方法:采用密度梯度离心法、红细胞裂解法及细胞培养等方法,分离纯化供体大鼠骨髓细胞(donor bone marrow cells,DBMC)、骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)、不成熟树突细胞(immature dendritic cells,imDC),经光镜、电镜形态学、FCM测定imDC表面OX-62、MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达、MSC表面CD80-CD86-和CD29表达等细胞表面标志的表型鉴定后,用MTT法检测DBMC、MSC和imDC对供受体混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocytesreaction,MLR)的免疫调节作用。结果:分离获取大鼠骨髓主要细胞成分纯度可达85%-90%,活力>95%,均经光镜、电镜形态学、FCM等表型鉴定合格,其中,imDC表面OX-62、MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达量分别是90.5%±16.4%、89.5%±6.2%、32.5%±9.2%和27.6%±8.3%;MSC表面CD80-C...     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的：探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞（DC）分离培养树突状细胞的优化方法。方法：取正常成人新鲜血液，经密度梯度离心法，利用连续贴壁的方法获得单个核细胞，采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF—α）诱导产生成熟DC，倒置显微镜观察树突状细胞结构，流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果：连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC，所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10％胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83^＋HLA—DR^＋及CD80^＋CD86^＋。结论：采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

大鼠髓系来源的树突状细胞的体外诱导及功能鉴定

目的探讨建立合适的大鼠骨髓源性未成熟树突状细胞(imDC)的培养方法,并对其生物学特性进行评价。方法分别以不同剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素(IL)-4诱导分化获得大鼠骨髓源性树突状细胞(DC),比较收获率及特异性标记蛋白(OX62)阳性的DC数量,获得最佳细胞因子浓度。并用流式细胞仪分析DC表型,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种T细胞增殖能力,ELISA法测定MLR上清IL-12、γ-免疫反应性纤维结合素(IFN-γ)水平。结果 GM-CSF 5 ng/ml可诱导出更高的收获率及OX62的阳性率。GM-CSF 5 ng/ml培养7 d的DC,表达中等水平的主要组织相容性(抗原)复合物Ⅱ类(MHC II)和低水平的CD86;其分泌少量IL-12;刺激同种T细胞增殖能力极低。脂多糖(LPS)刺激后MHCⅡ、CD86表达明显增加;分泌IL-12和IFN-γ增加;刺激同种T细胞增殖能力增强。结论 GM-CSF 5 ng/ml为诱导大鼠骨髓源性imDC的最佳剂量,培养7～9 d可以获得足够数量和纯度的imDC。