人铜锌超氧化物歧化酶的基因工程研究 Ⅱ.人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达

利用pUC 8为载体质粒,将合成的人Cu/Zn SOD基因置于Lac Z启动子的调控下,构建了含有该基因的表达质粒pCZS Ⅰ。首次成功地在大肠杆菌中表达了合成人Cu/Zn SOD的基因。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳薄层扫描分析证明,SOD基因的表达产物占细胞可溶性蛋白质的13％左右,用光扩增法捡测表达产物的酶活性,每毫克蛋白质为48.6 McCord Fridovich单位。     

人铜锌超氧化物歧化酶的基因工程研究——Ⅰ.人铜锌超氧化物歧化酶基因的合成与克隆

本文报道人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide Dismutase, SOD)基因的合成与克隆。采用大肠杆菌偏爱密码子,按入Cu/Zu SOD一级结构顺序编码。基因全长495个碱基对,合成时,分成26个基因片段分别合成。采用分级退火的方法,在T4 DNA连接酶作用下,将基因片段组装成完整的基因,经序列分析证明,合成的基因顺序与设计一致。     

人CD4基因在大肠杆菌中的表达

本文设计并化学合成了一对ＰＣＲ引物，以人ＣＤ４ｃＤＮＡ为模板，成功地扩增出人ＣＤ４Ｎ端两个结构域的编码基因（６００ｂｐ），并在此基因两端分别插入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点及起始和终止码。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将ＣＤ４基因克隆入ｐＵＣ１９质粒，经过ＰＣＲ和酶切鉴定得到ＣＤ４重组克隆ｐＴ４０３。ＤＮＡ序列分析结果表明，所克隆ＣＤ４基因与已发表的人ＣＤ４基因序列完全一致。将ＣＤ４基因     

人CD7胞外区基因在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达人白细胞分化抗原CD7胞外区蛋白。方法 采用PCR技术调整CD7基因的阅读框架,使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致,缺失了CD7cDNA基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子,构建CD7胞外区cDNA和生物素化蛋白基因融合的原核表达质粒PinPointxa3-CD7。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α表达,SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果。结果 融合蛋白的分子量约为30000u,Western blotting结果表明,表达的蛋白质可被抗CD7的单克隆抗体识别。结论 为研制抗CD7基因工程抗体奠定了基础。     

铜锌超氧化物歧化酶在风湿性疾病患者滑膜中的变化

通过关节镜技术采取膝关节滑膜３８例，将组织标本进行冷冻切片４－６μｍ厚，放－２０℃贮存备用，应用免疫组法测定滑膜中ＣｕＺｎ－ＳＯＤ的沉积，其中类风湿关节炎（ＲＡ）１６例；反应性关节炎（ＲｅＡ）１０例；骨性关节炎（ＯＡ）７例；非滑膜炎（Ｎｏｎ－Ｓ）５例。     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

人睫状神经营养因子基因在大肠杆菌中的表达

目的克隆人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出具有生物活性的ｈＣＮＴＦ蛋白。方法从人外周神经组织总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增得到编码人ＣＮＴＦ的全长ｃＤＮＡ片段，此片段经回收和纯化后克隆进ＰＧＥＭ－５Ｚｆ（＋）质粒载体，并进行了ＤＮＡ序列分析，然后进一步亚克隆进Ｔ７启动子表达载体，用ＩＰＴＧ在大肠杆菌宿主中诱导ｈＣＮＴＦ蛋白表达，并以体外培养的鸡胚背根神经节（ＤＲＧ）神经元测定了重组ｈＣＮＴＦ蛋白的神经营养活性。结果成功克隆了人ＣＮＴＦ基因，含重组ＣＮＴＦ质粒的大肠杆菌经０．４ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导３小时后，靶蛋白占细菌总蛋白的２５％以上。结论ｈＣＮＴＦ基因的克隆和高效表达为进一步研究其结构功能关系和临床应用打下了基础     

人转化生长因子-β基因在大肠杆菌中的高效表达

转化生长因子-β(transformiug growth factor-β)是一类具有多种生物学功能的多肽,具有广阔的实际应用前景。但TGF-β来源困难,仅靠从人和动物组织或血液中提纯,远不能满足科研和实际应用的需要。我们应用基因工程技术于1991年4月成功地在大肠杆菌中高效表达了人TGF-β。为今后TGF-β的科研和实验应用奠定了基础。     

人IL-24基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

IL-24既能抑制肿瘤细胞生长和血管形成并诱导肿瘤细胞凋亡，又能诱导免疫细胞分泌IL-6、TNF-α、IFN-γ等多种细胞因子。在对乳腺癌、肠癌、肺癌及胶质瘤等肿瘤基因治疗中有显著的抗肿瘤效果。目前有关建立IL-24基因表达系统，开展rhIL-24蛋白生物学特性研究及产品研制，国内外鲜见报道。本文为本项研究的起步。     

人Ⅱ型免疫缺陷病毒gag基因在大肠杆菌中的表达

目的：表达ＨＩＶ－２基因工程ｇａｇ抗原。方法：将编码ＨＩＶ－２型ｇａｇ的部分和全部ｐ５５ｇａｇ１／２基因,克隆到载体ｐＥＴ－１７ｂ后,分别在Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＩ２１中表达。结果;表达产物为５１和６１ｋＤ融合蛋白,并可与ＨＩＶ－２病人血清发生特异性反应。     

人TREM-1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的系统地研究TREM-1的生物学功能,克隆TREM-1的cDNA,构建原核表达载体后,使其在大肠杆菌中得到表达。方法用RT-PCR从临床患者外周血白细胞中扩增TREM-1 cDNA,将其克隆到克隆载体pGEM-3Z上。经酶切及PCR扩增鉴定、测序后,再克隆到原核表达载体pT7-PL上,转化大肠杆菌BL21(DE3 plys),以IPTG诱导大肠杆菌表达带有氨酸和人TREM-1蛋白组成的融合蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳初步鉴定,并对融合蛋白进行纯化。结果酶切电泳和DNA测序结果表明,成功地克隆了人TREM-1 eDNA;SDS-PAGE电泳结果显示相应分子质量37ku处有含人TREM-1融合蛋白的初步表达,证明了TREM-1原核表达的可行性。     

人睫状神经营养因子在基因在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ）基因，并大大肠杆菌宿主系统中高效表达出具有生物活性的ｈＣＮＴＦ蛋白。方法 从人外周神经组织总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增得到编码人ＣＮＴＦ的全长ｃＤＮＡＡ片段，此片段经回收和纯化后克隆进ＰＧＥＭ－５Ｚｆ（＋）质粒载体，并进行了ＤＮＡ序列分析，然后进一步亚克隆进Ｔ７启动子表达载体，用ＩＰＴＧ在大肠杆菌主中诱导ｈＣＮＴＦ蛋白表达，并以体外培     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

铜锌超氧化物歧化酶ELISA检测的应用

<正> 水文选用单克隆抗体酶免疫试剂盒(北京军区免疫检测中心产品)检测心血管系统和呼吸道系统患者血清中Cu Zn-SOD的含量,结果如下。 一、不同年龄健康人血清中Cu Zn-SOD含量:<20岁组(17例)为335.6±58.0ng/ml,40～59岁组(16例)为245.6±42.7ng/ml,60岁以上组(19例)为251.6±75.5ng/ml,提示<20岁组最高,与     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

人体铜伴侣蛋白Atox1在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术扩增出人体转铜伴侣蛋白Atox1和cDNA片段,直接克隆到PCRⅡ载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体PGEX－6p-2上,构成重组表达质粒PGEA,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得PGEA融合蛋白的表达。表达的融合蛋白经亲和层析、位点特异性蛋白酶切得到纯化的Atox1蛋白。     

间接血凝试验检测人铜锌超氧化物歧化酶(HCuZn SOD)

人铜锌超氧化物歧化酶是一种以超氧阴离子为底物的特异性酶,具有清除超氧阴离子的功能。我们采用纯化的SOD抗体致敏绵羊红细胞可以半定量的检测患者血清内Cu Zn SOD的含量,以待了解人体衰老、肿瘤等疾病与SOD的相关性。 我们用间接血凝法测定正常人(无特殊体征)血清标本275例,均值200±87.2ng/ml同