miRNA在哮喘儿童支气管肺泡灌洗液细胞中的表达和作用研究

目的探讨miRNA参与儿童哮喘发病的可能作用机制。方法选取2016年1月至2017年2月在浙江大学医学院附属儿童医院呼吸内科住院的哮喘患儿15例为哮喘组,同期在本院确诊为支气管异物的12例患儿（均在24h内取出异物）为对照组。使用miRNA芯片检测支气管肺泡灌洗液细胞中miRNA的表达水平,并用qRT-PCR进行验证,通过生物信息学数据筛选出可能靶基因E-钙黏蛋白（E-cadherin）,检测其表达水平。结果哮喘组患儿支气管肺泡灌洗液细胞中有65个miRNA与对照组存在差异表达,包括43个表达下调和22个表达上调的miRNA。其中miR-34/449家族的6个miRNA和miR-200家族的7个miRNA占所有表达下调miRNAs的30.2%。应用qRT-PCR验证两个miRNA家族中存在差异表达的miRNA,证实有10个miRNA与miRNA芯片结果一致,包括miR-34b-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-34c-3p、miR-200a-5p、miR-200a-3p、miR-200b-5p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-141-3p。与对照组相比,miR-34/449家族和miR-200家族的预测靶基因E-cadherin在哮喘组中呈低表达（P＜0.05）。结论部分miRNA参与了哮喘的发病,其中miR-34/449和miR-200家族可能通过调节E-cadherin的表达参与儿童哮喘的发病,为儿童哮喘的治疗提供新方向。     

横纹肌肉瘤相关差异miRNAs和靶基因的生物信息学分析

目的:运用生物信息学分析人正常横纹肌和横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)差异miRNAs和靶基因,为研究RMS提供新思路.方法:GEO2R分析RMS组织的差异miRNAs,利用Sangerbox绘制火山图.TargetScan、miRDB、miRwalk预测靶基因并利用Veen分析交集靶基因.Enrichr分析靶基因的GO富集分析和KEGG信号通路.Cytoscape结合生存分析筛选hub基因及miRNAs与hub基因的分子调控网络.结果:GEO2R分析发现2549个差异miRNAs,上调和下调miRNAs分别有1318个和1231个,根据|log2FCl＞1.5,P＜0.05筛选出6个差异miRNAs(上调:miR-410-3p 、miR-381-3p、miR-483-3p和miR-376a-3p,下调:miR-29c-3p和miR-145-5p);TargetScan、miRDB、miRwalk分别预测6个差异miRNAs的靶基因后Veen图取交集的靶基因共计1262个;GO富集和KEGG信号通路分析靶基因富集于RNA聚合酶Ⅱ的调控、调节干细胞多能性的信号通路、Hippo信号通路等过程;Cytoscape筛选出top10 hub基因后结合生存曲线分析显示FBXL3高表达,SPSB4、VHL、SMAD4、NRAS、KRAS低表达时患者预后较好.结论:利用生物信息学分析正常横纹肌和横纹肌肉瘤组织的差异miRNAs-靶基因,筛选出miR-145-5p (SPSB4、FBXL3、SMAD4、NRAS)、miR-29c-3p(VHL)、miR-381-3p(KRAS),可为横纹肌肉瘤的研究提供潜在的分子靶点.     

miRNA-146b-3p在早期非小细胞肺癌中的诊断价值

目的探讨miR-146b-3p在早期非小细胞肺癌、良性肺结节与健康人群外周循环血中的表达差异及诊断价值。方法通过RT-PCR测定118例早期非小细胞肺癌、42例良性肺结节与48例健康人群外周循环血中的6种miRNAs（miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p）的相对表达量,并进行统计学分析评价其在早期的诊断价值。结果相较于良性肺结节患者与健康人群,miR-146b-3p在非小细胞肺癌患者外周循环血中呈显著过表达。用ROC曲线来评价miR-146b-3p的诊断价值,在肺癌与良性结节组中： miR-146b-3p的曲线下面积为0.77,当取临界值0.01时,灵敏度为75%,特异性为71%;在肺癌与健康人组中： miR-146b-3p的曲线下面积为0.93,当取临界值0.72时,灵敏度为89%,特异性为84%。Logistic回归模型表明： 在肺癌与良性结节组中,年龄与miR-146b-3p为独立危险因素,其ROC曲线下面积为0.81,当取临界值0.85时,灵敏度为65%,特异性为89%;在肺癌与良性结节组中,miR-19a-3p与miR-146b-3p为独立危险因素,其ROC曲线下面积为0.98,当取临界值0.90时,灵敏度为94%,特异性为95%。结论miR-146b-3p对早期非小细胞肺癌、良性肺结节与健康人群有一定鉴别意义,可作为临床一种新的血液标志物。     

环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)通过调控miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p促进口腔鳞状细胞癌进展

目的：探讨环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞生物学功能中的作用及机制。方法：收集 30 例 OSCC 患者的临床组织,采用实时定量 PCR 检测 circ- FAT1、miR-181d-5p及miR-199a-5p在OSCC组织和细胞中的表达。通过StarBase和双荧光素酶报告基因实验验证 miR-181d- 5p/miR-199a-5p与circFAT1的靶向关系。利用CCK-8、Transwell、流式细胞术检测 circFAT1-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴对于 OSCC细胞活力、迁移、侵袭、凋亡和周期的影响。采用免疫印迹法结合LY294002处理检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果：在OSCC中circFAT1表达升高,miR-181d-5p、miR-199a-5p表达下降(P ＜ 0.001)。circFAT1可以同时靶向miR- 181d-5p和miR-199a-5p(P ＜ 0.01)。沉默circFAT1、过表达miR-181d及miR-199a-5p抑制了OSCC细胞活力、迁移、侵袭和周期进展、诱导凋亡,同时抑制PI3K/Akt/mTOR 通路的激活;过表达circFAT1、抑制miR-181d-5p及miR-199a-5p则发挥相反作用 (P ＜ 0.05)。miR-181d-5p、miR-199a-5p可部分逆转circFAT1对OSCC细胞生物学功能的影响(P＜0.05)。LY294002预处理逆转了过表达circFAT1对PI3K/Akt/mTOR通路和细胞活力的影响(P ＜ 0.05)。结论：circFAT1通过调控miR-181d-5p和miR-199a-5p 促进OSCC细胞恶性进展。     

miRNAs参与养血柔肝法治疗骨关节炎的生物信息学分析

目的 分析miRNAs在养血柔肝法“养血软坚胶囊”治疗骨关节炎中的生物学信息.方法 将40只SD大鼠进行前交叉切除(ACLT)造模成骨关节炎模型,模型验证造模成功后,随机分为模型组(n=20)和中药组(n=20).模型组不干预,中药组予大鼠灌胃饲养,药物采用养血柔肝法中成药养血软坚胶囊.4周后取材,提取关节软骨组织的RNA,制备文库,通过数据预处理、测序错误率分布检查、测序数据过滤、差异表达的miRNAs的鉴定、差异表达的miRNA的靶基因的鉴定、差异表达的miRNA的靶基因的功能分析、网络图构建等步骤,对差异表达的miRNAs进行数据分析.并RT-PCR验证所得结果.结果 中药组与模型组并共有35个miRNAs表达有差异.其中7个上调(共调控了1174个靶基因),28个下调(共调控了2216个靶基因);对差异miRNAs的靶基因进行蛋白互作网络分析(PPI)后,通过连接度最高的几个节点,获得了19个重要的靶基因.关节软骨中,中药组rno-miR-199a-5p、mo-miR-140-3p的表达高于模型组,中药组rno-miR-300-3p、mo-miR-9a-3p的表达低于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 养血柔肝法中药“养血软坚胶囊”可以调控骨关节炎大鼠模型的miR-199a-5p,miR-140-3p,miR-300-3p和miR-9a-3p等miRNAs.     

miR-30a-5p通过调节靶基因ARG1对急性缺血性脑卒中免疫应答的影响

目的:探讨miR-30a-5p通过调节靶基因精氨酸酶-1(ARG1)对急性缺血性脑卒中免疫应答的影响.方法:选取急性缺血性脑卒中患者60例为病例组,同期体检健康者60例作为对照组.RT-qPCR检测外周血候选miRNAs,miR-30a-5p及靶基因ARG1表达情况;将miR-30a-5p模拟物、阴性对照模拟物及mock转染到HL-60或RAW264.7细胞中,荧光素酶报告基因分析miR-30a-5p与ARG1的作用关系;RT-qPCR和Western blot检测ARG1 mRNA和蛋白的表达情况.结果:miR-30a-5p、miR-579-3p和Let-7e表达水平在病例组和对照组存在统计学差异(P<0.001),生物信息学预测miR-579-3p和Let-7e没有免疫调节相关的靶基因,而ARG1是miR-30a-5p潜在靶基因.荧光素酶报告基因实验证实ARG1是miR-30a-5p直接作用靶点,ARG1 mRNA在缺血性脑卒中外周血中明显上调(P<0.05).miR-30a-5p模拟物转染HL-60和/或RAW 264.7细胞24 h后,ARG1 mRNA和蛋白表达水平较mock和NC组明显降低(P<0.05).miR-30a-5p对LPS处理后的RAW 264.7细胞48 h后,miR-30a-5p模拟物组NO水平较mock和NC组明显升高(P<0.05).结论:miR-30a-5p及其靶基因ARG1是急性缺血性脑卒中重要的分子标志物之一,miR-30a-5p可能通过抑制靶向基因ARG1表达参与缺血性卒中免疫应答的病理生理过程.     

代谢综合征患者痰、郁证素与外周血miRNAs表达相关性临床研究

目的:探讨代谢综合征痰、郁证素与外周血miRNAs表达的相关性。方法:选择40~55岁女性代谢综合征患者,采用证素辨证并根据证素积分分为郁证组(痰积分≥100分、气滞积分≥70分,n=19)和非郁证组(痰积分≥100分、气滞积分70分,n=22),同时纳入40~55岁女性健康体检者为对照组(n=20)。采用Real-time PCR法对所有研究对象的外周血miRNAs(miR-15b-5p、miR-142-3p、miR-221-3p和miR-451a)表达进行检测。结果:与对照组比较,郁证组miR-15b-5p表达下降(P0.01),miR-142-3p、miR-221-3p(P0.05)、miR-451a(P0.01)表达上升;非郁证组miR-15b-5p(P0.01)、miR-221-3p(P0.01)表达下降,miR-142-3p(P0.01)、miR-451a表达上升。与非郁证组比较,郁证组miR-15b-5p(P0.05)、miR-221-3p(P0.01)、miR-451a(P0.01)表达上升。结论:40~55岁女性代谢综合征患者痰、郁证素与外周血miR-15b-5p、miR-142-3p、miR-221-3p和miR-451a的表达存在一定的相关性。     

miR-181b-5p负调控CYLD的表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的 探讨miR-181b-5p通过下调CYLD的表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-181b-5p在膀胱癌细胞系(T24、UM-UC-3、5637)和人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)中的表达水平。在T24和UM-UC-3细胞中转染miR-181b-5p模拟物 (miR-181b-5p组)和miR-NC(对照组),CCK-8实验和克隆形成实验检测过表达miR-181b-5p对T24和UM-UC-3细胞增殖的影响,Transwell实验检测过表达miR-181b-5p对T24和UM-UC-3细胞迁移和侵袭的影响。采用生物信息学预测miR-181b-5p潜在下游靶基因CYLD,双荧光素酶报告基因实验验证miR-181b-5p是否与CYLD的3′-UTR结合,qRT-PCR检测过表达miR-181b-5p对CYLD mRNA的影响,Western blot法检测过表达miR-181b-5p对CYLD蛋白的影响。在T24和UM-UC-3细胞中沉默CYLD的表达,采用CCK8实验、克隆形成实验和Transwell实验检测沉默CYLD对T24和UM-UC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 与SV-HUC-1比较,膀胱癌细胞系中miR-181b-5p的表达水平升高(P<0.05)。与对照比较,过表达miR-181b-5p和沉默CYLD均促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,过表达miR-181b-5p 明显降低野生型CYLD 的荧光素酶活性(P<0.05)。qRT-PCR和Western blot法结果显示过表达miR-181b-5p显著下调CYLD mRNA和蛋白的水平(P<0.05)。结论 miR-181b-5p通过负调控CYLD的表达促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

miR-181b-5p在胆绿素治疗脑缺血再灌注损伤中的靶基因预测及鉴定

目的:对Small RNA测序中筛选出的mo-miR-181b-5p进行靶基因预测、生物信息学分析及鉴定,以期为miR-181b-5p在胆绿素治疗大鼠脑缺血再灌注损伤中的生物学作用奠定基础.方法:分别用TargetScan、miRDB、miRwalk 3个数据库预测mo-miR-181b-5p的靶基因,取3个数据库的交集靶基因进行基因功能富集分析(gene ontology)及信号通路富集分析(KEGG pathway analysis).采用双荧光素酶基因报告实验对靶基因进行验证,同时通过RT-QPCR和Western blot检测大鼠血管内皮细胞中过表达miR-181b-5p后内皮细胞特异性分子1(Esm1)的表达变化.结果:3个数据库交集的靶基因共有28个,这些交集靶基因主要富集于调节刺激反应(P=0.013)、调节细胞增长(P=0.014)、积极调控(P=0.048)等生物过程GO条目中;而细胞成分层面主要富集于细胞内膜结合细胞器(P=0.045)、黏附连接(P=0.049)等GO条目中;分子功能层面,靶基因主要富集于与mRNA 5'-UTR结合(P=0.017)、受体结合(P=0.032)、蛋白质结合(P=0.046)等GO条目中.信号通路主要富集于突触小泡循环(P=0.024)、基础转录因子(P=0.040)、RIG-I样受体信号通路(P=0.047)等通路中.双荧光素酶基因报告实验结果揭示了miR-181b-5p可以靶向调控Esm1基因.另外,RT-QPCR和Western blot结果显示在大鼠血管内皮细胞中过表达miR-181b-5p可负向调控Esm1.结论:mo-miR-181b-5p可能通过靶向调控Esm1基因而在胆绿素治疗大鼠脑缺血再灌注损伤中发挥生物活性作用.     

miRNA分子在肺结核患者单核细胞中的表达及意义

目的分析肺结核患者(TB)外周血单核细胞中miR-34a-5p和miR-708-5p的表达水平,并探讨其临床诊断价值。方法选取TB患者和健康对照(HD)各25例,应用Taq Man q PCR技术测定两组人群外周血单核细胞中miR-34a-5p和miR-708-5p表达水平,以U6 sn RNA作为内参。应用ROC曲线评价miR-34a-5p和miR-708-5p诊断TB的临床意义。结果 miR-34a-5p在TB患者中的表达水平为(10.08±0.68),显著高于HD的(7.67±0.36),差异有统计学意义(P<0.01);miR-708-5p在TB患者中的表达水平显著高于HD的(13.52±0.98 Vs 7.71±0.57),差异有统计学意义(P<0.01)。ROC曲线分析表明在肺结核诊断中,miR-34a-5p的敏感性、特异性分别为72%、76%;miR-708-5p的敏感性、特异性为76%、76%。结论 miR-34a-5p和miR-708-5p分子在TB患者外周血单核细胞中异常表达,对TB辅助诊断具有一定参考价值。