人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及形态学观察

目的:探讨子宫内膜异位症(endometriosis,EM)异位子宫内膜细胞原代培养方法,并比较EM在位及异位子宫内膜细胞与正常对照在位子宫内膜细胞形态的差异。方法:采用改良EM细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜及电子显微镜下观察细胞形态差异。结果:正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率分别为91.67%、93.75%和75.00%。EM异位、在位子宫内膜腺上皮细胞与正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似,但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多,核增大。EM异位子宫内膜间质细胞较EM在位及正常在位子宫内膜间质细胞小,且细胞膜表面有较多的微绒毛和胞浆突起。结论:注意取材方式,采用改良原代培养方法,可以提高EM异位子宫内膜细胞培养成功率。EM异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞超微结构与正常妇女及EM在位子宫内膜细胞有显著不同。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

子宫内膜异位症原代细胞培养及纤维化相关蛋白检测

目的 检测在位子宫内膜组织、子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）异位病灶组织及正常人子宫内膜组织分离提纯子宫内膜间质细胞及相应间质细胞中纤维化相关蛋白表达水平及差异。方法 在严格无菌条件下,刮勺刮取新鲜子宫内膜组织,冰盒运输,采用改良EMs原代细胞培养方法分离培养。并通过细胞爬片免疫组织化学方法,对分离提纯的细胞进行鉴定。蛋白免疫印迹方法检测对比分离提纯的细胞与相应组织纤维化相关蛋白表达的差异。结果 EMs在位内膜组织间质细胞原代分离12例均成功,成功率100%（成功指标：指细胞在培养瓶中贴壁生长并稳定传代）。EMs异位组织分离培养12例成功11例,成功率为91.7%。正常人子宫内膜组织分离9例成功8例,成功率为88.9%。人子宫内膜异位症异位间质细胞（human ectopic endometrial stromal cells,HEcESCs）与人子宫内膜异位症在位间质细胞（human eutopic endometrial stromal cells,HEuESCs）及正常人在位子宫内膜间质细胞（human normal endometrial stromal cells,HEnESCs）普通光镜观察无明显差异。但免疫组织化学、蛋白免疫印迹结果表明：HEcESCs纤维化相关蛋白的表达水平明显高于HEuESCs及HEnESCs两者纤维化相关蛋白表达水平（P<0.01）,而HEuESCs与HEnESCs纤维化相关蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）,各间质细胞纤维化相关蛋白的表达与其相应组织水平相一致。结论 采用改良EMs间质细胞原代培养方法,可以降低EMs子宫内膜间质细胞培养难度,并保持较高的细胞培养成功率。HEcESCs较HEuESCs及HEnESCs纤维化相关蛋白表达明显增高,即子宫内膜异位症患者,异位病灶在组织水平出现了明确的纤维化。     

子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养及鉴定

目的 探讨子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养,为进一步研究子宫腺肌病发病机制提供体外细胞模型. 方法 采用酶解、筛网分离、贴壁法分离异位内膜细胞.采用免疫细胞化学法进行细胞鉴定. 结果 经此法分离培养异位细胞培养成功率可达75.0%,消化得到的异位细胞种类较多,不容易分离提纯,腺细胞占6.5%,间质细胞占13.3%,平滑肌细胞占80.2%. 结论 采用酶解、筛网分离、贴壁法可以获得子宫腺肌病的异位细胞,不能获得纯度较高异位腺细胞,子宫腺肌病异位腺细胞提纯需要进一步探讨.     

人子宫内膜间质细胞原代培养及生物学行为的研究

目的探讨人子宫内膜间质细胞原代培养方法,并比较子宫内膜异位症(EMS)异位内膜间质细胞与正常子宫内膜间质细胞形态及生物学行为的差异,为EMS细胞模型的建立提供可靠依据。方法采用改良人子宫内膜间质细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜下观察细胞形态差异,采用CCK8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况。结果正常子宫内膜间质细胞及EMS异位子宫内膜间质细胞分离培养成功率分别为93.33%、86.67%。两种间质细胞在生长速度、形态及生物学行为方面均具有明显差异。子宫内膜异位症异位内膜间质细胞(ESC)比正常子宫内膜间质细胞(NSC)增殖旺盛,增殖48 h、72 h时ESC的细胞相对增殖率明显高于NSC,差异均有统计学意义(P48h0.001;P72h0.001)。24 h、48 h、96 h的NSC凋亡率明显高于ESC,差异均有统计学意义(P0.001)。72 h时,NSC、ESC凋亡率比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论采用改良原代培养方法,可以明显提高人子宫内膜间质细胞培养成功率。体外细胞模型中异位内膜间质细胞的生长特性与子宫内膜异位症的疾病特点是一致的,可以成为疾病细胞机制研究的理想模型。     

子宫内膜异位症在位子宫内膜间质及腺上皮细胞高纯度分离培养技术的改进

目的对子宫内膜异位症(EMs)患者在位子宫内膜间质及腺上皮细胞进行高纯度分离、培养,改进子宫内膜细胞常规培养方法。方法通过酶解、过滤及贴壁纯化,分离和培养7例EMs组及5例正常组在位子宫内膜间质及腺上皮细胞,其中延长EMs组子宫内膜细胞消化时间及缩短其后的贴壁等待时间。结果 12例子宫内膜标本中10例培养成功,原代培养的间质细胞纯度率可达97%以上,原代培养的腺上皮细胞纯度率约95%。改良分离方法后获得的EMs组和正常组的间质及腺上皮细胞纯度及活性均提高。结论 EMs在位子宫内膜分离过程中延长消化时间及缩短贴壁时间,可作为对子宫内膜常规培养方法的改进。     

人子宫内膜异位症异位及在位内膜间质细胞分离与培养

目的：建立子宫内膜异位症（EMs）异位、在位内膜间质细胞的体外细胞模型,实时观察间质细胞形态变化。方法胶原酶消化异位、在位内膜组织,二次筛网过滤结合低速离心法分离纯化间质细胞,应用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,并进行传代培养,观察细胞生长状况及细胞形态差异。结果培养成功率91．3％,间质细胞纯度达95％;异位间质细胞9代内、在位及对照组间质细胞11代内,细胞形态及活性并无明显改变。结论子宫内膜间质细胞可为子宫内膜异位症研究提供较好的细胞模型。     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

子宫内膜异位症体外细胞模型的建立

目的从子宫内膜组织分离腺上皮细胞和间质细胞，建立子宫内膜异位症体外多细胞模型。方法收集子宫内膜异位症和其他良性疾病的在位子宫内膜，采用高浓度胶原酶消化法进行内膜细胞的原代培养，以及传代培养。观察两组细胞形态，SABC免疫细胞化学进行细胞鉴定，MTT法绘制两组细胞的生长曲线。结果高浓度胶原酶消化后，子宫内膜异位症组和对照组腺上皮细胞和间质细胞大部分在48h内都能贴壁；腺细胞平均生长时间为6周；间质细胞平均生长时间为15周。腺上皮细胞角蛋白（cytokeratin）免疫细胞化学染色呈阳性，渡形蛋白（vimentin）为阴性；间质细胞角蛋白染色为阴性，而波形蛋白为阳性。两组生长曲线接近。结论高浓度胶原酶消化法建立子宫内膜异位症体外多细胞模型简单、易行。子宫内膜异位症在位内膜细胞的形态、生长和正常内膜细胞无明显差异。可以用作研究子宫内膜异位症细胞基因型特征、及其他因素对异位内膜细胞的影响的模型。     

子宫腺肌病中PTEN和Akt的表达及其相关性研究

目的探讨子宫腺肌病病灶中10号染色体缺失张力蛋白磷酸酶(PTEN)和蛋白激酶B（PKB/Akt）的蛋白表达情况,旨在为子宫腺肌病的发生发展以及治疗提供理论依据。方法采用免疫组织化学SP法检测子宫腺肌病异位内膜(30例)、在位内膜（27例）、正常子宫内膜(20例)的腺上皮细胞和间质细胞中PTEN、Akt、磷酸化Akt （P Akt）蛋白的表达并进行比较。结果PTEN蛋白在腺上皮细胞中的表达,正常子宫内膜表达高于在位内膜和异位内膜（P＜0.05,P＜0.01）,子宫腺肌病在位内膜的表达高于子宫腺肌病异位内膜的表达（P＜0.01);Akt、P Akt蛋白在子宫腺肌病异位内膜的腺上皮细胞中的表达强度高于在位内膜（P＜0.05）和正常子宫内膜(P＜0.01),其在位内膜腺上皮细胞中的表达强度高于正常子宫内膜(P＜0.01)。PTEN蛋白在间质细胞中的表达,正常子宫内膜明显高于子宫腺肌病的在位内膜和异位内膜（P＜0.05）,但在位内膜与异位内膜之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）;Akt、P Akt蛋白在间质细胞中的表达,异位和在位内膜明显高于正常内膜,异位内膜和在位内膜两组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。PTEN与Akt、PTEN与P Akt在子宫腺肌病异位内膜、在位子宫内膜和正常子弓内膜中的表达均呈负相关（r＝-0.444;r＝-0.546）。结论PTEN蛋白表达在子宫腺肌病的在位、异位内膜中减少;Akt、P Akt蛋白表达增加。PTEN蛋白低表达不能有效的抑制Akt的激活,从而对子宫腺肌病的发生与发展起重要的作用。     

子宫腺肌病在位、异位内膜组织中VEGF及Flk1的表达

目的:探讨子宫腺肌病患者在位、异位内膜组织中血管内皮生长因子(VEGF)及受体1(Flk-1)的表达情况及其相关性。方法:采用SP法检测98例子宫腺肌病患者在位、异位内膜及44例正常体检者(对照组)子宫内膜组织中的VEGF及Flk-1的表达。结果:子宫腺肌病异位内膜、在位内膜中VEGF、Flk-1蛋白阳性表达与对照组差异均有统计学意义(P均<0.01);VEGF、Flk-1蛋白阳性表达在异位、在位内膜中及各增生期与分泌期比较差异均有统计学意义(P均<0.01);VEGF及Flk-1阳性表达在异位、在位内膜中均有相关性(P<0.05)。结论:子宫腺肌病患者在位、异位子宫内膜组织中VEGF及Flk-1高表达,二者可能在子宫腺肌病的发生、发展中发挥重要作用。     

GRIM-19在子宫腺肌病中的表达及促进疾病发展的机制研究

目的 研究诱导细胞凋亡相关基因-19(GRIM-19)在子宫腺肌病患者子宫内膜组织中的表达水平,并探讨其在疾病发生发展中的分子机制.方法 取30例子宫腺肌病患者异位和在位内膜组织,采用免疫组织化学和Western blot检测内膜组织中GRIM-19、磷酸化信号转导及转录激活蛋白3(pSTAT3)和内皮生长因子(VEGF)的表达水平.采用TUNEL检测内膜组织凋亡,CD34抗体直接检测内膜组织新生血管形成.构建GRIM-19 siRNA和重组质粒,转染Ishikawa细胞后检测下游信号分子pSTAT3、信号转导和转录激活因子3(STAT3)和VEGF的变化.结果 与对照组相比,子宫腺肌病患者在位内膜和异位内膜组织中GRIM-19表达水平降低.在位内膜和异位内膜组织中细胞凋亡减少,微血管密度、pSTAT3和VEGF表达水平升高.转染Ishikawa细胞,下调GRIM-19表达可显著激活pSTAT3和VEGF.结论 GRIM-19通过抑制细胞凋亡和增加新生血管形成,促进子宫腺肌病的发生发展.     

Survivin在子宫腺肌病的表达及其与Bcl-2、Bax相关性的研究

目的 探讨凋亡抑制基因Survivin在子宫腺肌病的表达及其与Bcl-2、Bax的相关性.方法 应用免疫组织化学S-P法,检测46例子宫腺肌病异位及在位内膜组织中Survivin、Bcl-2、Bax蛋白的表达,并与正常在位子宫内膜组织30例进行对照.结果 子宫腺肌病异位内膜组织中Survivin蛋白阳性表达率为69.57%,明显高于正常在位内膜组织的表达率6.67%(P＜0.05),并且异位内膜组织中Survivin蛋白表达与月经周期无相关性(P＜0.05);Survivin蛋白表达与Bel-2蛋白呈正相关(P＜0.01),而与Bax蛋白呈负相关(P＜0.01).结论 Survivin可通过抑制异位内膜细胞凋亡,对子宫腺肌病的发生、发展起作用;Survivin与Bcl-2、Bax在子宫腺肌病的发生、发展中分别起协同和拮抗作用.     

神经生长因子对子宫腺肌病基质细胞生存率及雌激素受体α表达的影响

目的研究神经生长因子（NGF）对子宫腺肌病患者离体培养在位子宫内膜基质细胞雌激素受体仅表达的影响。方法用10ng／ml、50ng／ml和100ng／ml的神经生长因子分别对体外原代培养人子宫内膜细胞进行干预,用MTT法测定内膜基质细胞生长的增殖情况,用Westen—blotting测定50ng／mlNGF对病例组基质细胞雌激素受体仪表达的变化。结果50ng／ml的NGF可促进子宫内膜基质细胞增殖,细胞存活率为82．61％,比其他浓度NGF显著升高（P〈0．05）;50ng／mlNGF对病例组和对照组不同细胞雌激素受体表达有影响,病例组腺上皮细胞和基质细胞总体均数差异均具有统计学意义（P〈0．01）。结论50ng／ml的NGF可促进子宫腺肌病在位内膜基质细胞增殖及腺上皮细胞和基质细胞雌激素受体仅表达。     

HGF、c-Met、MVD在子宫腺肌病异位、在位内膜中的表达及意义

目的:研究肝细胞生长因子及其受体c-Met在子宫腺肌病患者异位内膜、在位内膜及正常子宫内膜中的表达水平,在子宫腺肌病患者血管生成中的作用,探讨HGF/c-Met与子宫腺肌病的关系及可能的发病机制。方法:采用免疫组化S-P法检测30例(增生期20例、分泌期10例)经病理诊断为子宫腺肌症患者的异位、在位内膜组织及20例正常子宫内膜组织中HGF、c-Met、MVD的表达水平。结果:HGF、c-Met在异位内膜组、在位内膜组及对照组均有表达,阳性表达率及表达强度异位内膜组及在位内膜组均高于对照组(P<0.05),异位内膜组高于在位内膜组,且各组分泌期的表达均高于增生期。MVD在异位内膜组表达最高,在位内膜组次之,对照组最低。MVD计数随着HGF和c-Met的表达增强而增加。异位内膜组和在位内膜组HGF、c-Met、MVD的表达均存在两两正相关(P<0.05),对照组HGF与c-Met、HGF与MVD的表达呈正相关,c-Met与MVD的表达不相关。结论:HGF、c-Met参与了子宫腺肌病的发生,其机制与HGF/c-Met通路促进了新生血管生成有关。     

Galectin-3、MMP-9和VEGF在子宫腺肌病组织中的表达及意义*

目的 探讨半乳糖凝集素3（Galectin-3）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）在子宫腺肌病在位内膜、异位内膜组织中的表达和意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting分别检测Galectin-3、MMP-9和VEGF在20例子宫腺肌病在位内膜组织和20例正常对照内膜组织中mRNA和蛋白的相对表达。免疫组织化学法分别检测Galectin-3、MMP-9和VEGF在40例子宫腺肌病在位内膜、异位内膜组织和40例正常对照内膜组织中蛋白的表达,分析其在异位内膜组织中高表达的相关性。结果 与正常对照内膜比较,Galectin-3、MMP-9和VEGF在子宫腺肌病在位内膜组织中mRNA相对表达量升高（P?<0.05）,蛋白相对表达量也升高（P?<0.05）。与正常对照内膜比较,Galectin-3和VEGF在子宫腺肌病内膜中高表达（P?<0.05）。Galectin-3和MMP-9（r?=0.493,P?=0.001）、Galecein-3和VEGF（r?=0.616,P?=0.000）、MMP-9和VEGF（r?=0.441,P?=0.004）高表达之间均呈正相关。结论 Galectin-3、VEGF和MMP-9在子宫腺肌病内膜组织中表达升高且呈正相关,可能共同参与子宫腺肌病的发生和异位侵袭。     

RhoE/Rnd3蛋白在子宫腺肌病中的表达及意义

目的探讨RhoE/Rnd3蛋白在子宫腺肌病组织中的表达及其潜在的临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测32例正常子宫(对照组)内膜、平滑肌组织及38例子宫腺肌病组织(实验组)中在位内膜(A组)、异位内膜(B组)、平滑肌组织中RhoE/Rnd3蛋白的组织定位和表达程度,分析对比其差异。结果①腺上皮细胞:RhoE/Rnd3蛋白在对照组腺体细胞中的表达均高于实验组在位内膜腺体细胞(t=11.3,P<0.05)及异位内膜腺体细胞(t=9.33,P<0.05);在子宫腺肌病在位内膜腺体细胞与异位内膜腺体细胞中的表达差异无统计学意义(t=1.63,P>0.05);②间质细胞及平滑肌:RhoE/Rnd3蛋白在3组内膜间质细胞及对照组-实验组平滑肌细胞中表达差异均无统计学意义(P>0.05);③子宫腺肌病内膜腺体细胞中RhoE/Rnd3蛋白的表达水平与患者的病程有关,病程超过2年的患者组织中,RhoE/Rnd3蛋白的表达水平明显低于病程不足2年的患者(P<0.05)。结论RhoE/Rnd3蛋白在子宫腺肌病的发生发展中发挥重要作用,有可能是一个重要的肿瘤抑制基因。     

子宫腺肌症中ERPR的表达

目的:探讨雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor,PR)在子宫腺肌症发生中的作用。方法:采用免疫组织化学方法,对54例子宫腺肌症患者的在位内膜和异位内膜以及36例正常对照组ER、PR的蛋白表达进行研究。结果:ER在异位子宫内膜组的阳性表达率和表达强度均明显低于在位内膜组和正常对照组(P均<0.01);PR在异位子宫内膜组的阳性表达率和表达强度低于在位内膜组和正常对照组(P<0.05,P<0.01),PR的表达强度在在位内膜组与对照组之间有显著性差异(P<0.05);ER、PR在子宫腺肌病异位子宫内膜中的表达呈中度的正相关(rs=0.622,P<0.01)。结论:ER、PR的下调是采用性激素治疗腺肌病不敏感的原因之一。     

孕激素受体亚型在子宫腺肌病中的表达及意义

目的了解孕激素受体亚型(PR-A、PR-B)在子宫腺肌病异位病灶、在位内膜中的表达,探讨其在子宫腺肌病发生及治疗中的作用。方法采用免疫组化抗生物素蛋白-过氧化物酶染色法(SP法)检测子宫腺肌病患者(21例)病灶及其在位内膜及对照组(19例)子宫内膜标本中孕激素受体亚型的表达。结果PR-A、PR-B蛋白在异位病灶中广泛表达,表达强度显著低于其在位内膜和对照组内膜。研究组在位内膜间质内PR-A蛋白表达明显低于对照组在位内膜。结论异位病灶内PR蛋白的低表达及研究组在位内膜间质PR-A蛋白的低表达可能参与了该病的发病过程,可能与"孕激素抵抗"有关。