硼替佐米对LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的观察泛素-蛋白酶体抑制剂(UPI)硼替佐米对LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响。方法取12只周龄为8w的雄性LDLR-/-小鼠,适应性喂养1w,随机将12只小鼠分为高脂饮食+硼替佐米组(6只)和高脂饮食+生理盐水组(6只)。将上述2组小鼠分别给予硼替佐米(50μg·kg~(-1))和同等剂量生理盐水进行腹腔注射,1w2次,共8w。处死小鼠,取主动脉根部,观察主动脉根部的病理变化;利用免疫组化方法检测VSMC中激活型caspase-3的表达水平。利用Tunel技术检测VSMC凋亡,计算凋亡指数。结果光镜下苏木精-伊红染色显示盐水组小鼠主动脉根部内膜出现较多泡沫细胞、内膜广泛增厚,硼替佐米组主动脉根部内膜局部增厚,泡沫细胞的数量较少。硼替佐米组小鼠主动脉根部激活型caspase-3表达高于生理盐水组(0.048±0.0133 vs 0.021±0.008,P <0.05)。硼替佐米组小鼠主动脉根部凋亡率较生理盐水组明显增高(0.302±0.105 vs 0.164±0.039,P <0.05)。结论蛋白酶体抑制剂硼替佐米可通过诱导VSMC凋亡从而延缓LDLR-/-小鼠主动脉动脉粥样硬化的进展,其机制可能与调控激活型caspase-3表达有关。     

胶质瘤细胞系摄取BPA实验研究

目的　探讨孵育时间和细胞周期对胶质瘤细胞摄取BPA(p boronophenylalanine)的影响 ,进一步阐明BPA的胶质瘤细胞选择性作用机制。方法　将C6 ,BT 32 5 ,SHG 4 4胶质瘤细胞和原代大鼠星形胶质细胞培养在含BPA的培养液中 ,分别培养 4h、8h、12h、16h、2 0h和 2 4h后 ,采用感应耦合等离子体原子发射光谱 (ICP AES)法测定细胞内硼的含量。培养 2 4h后 ,流式细胞仪分选G0 /G1和G2 /M期的细胞 ,ICP AES法分别测定细胞内硼的水平。结果　三种胶质瘤细胞在每个检测时间点的细胞内硼含量均显著高于对照组胶质细胞 (P <0 .0 1)。三种胶质瘤细胞G2 /M期与G0 /G1期相比硼含量均明显增高 (P <0 .0 5 ) ,而星形胶质细胞两期差异不明显。C6、SHG 4 4和BT 32 5与星形胶质细胞G0 /G1期的硼浓度比分别为 1.4 6、1.5 1和 1.4 0 ,G2 /M期的硼浓度比分别为 3.6 5、3.96和3.76。结论　有丝分裂的过程可以加强胶质瘤对BPA的吸收 ,这一过程可能与胶质瘤细胞对BPA的主动运输有关。主动运输可能是BPA对胶质瘤选择性作用的基础     

NAAG肽酶基因剔除小鼠模型的建立及鉴定

目的 建立N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)肽酶基因剔除小鼠模型,为在体研究NAAG肽酶基因的生物学功能并揭示其在脑损伤后继发性脑损害进程中的所起的作用创造条件.方法 根据小鼠NAAG肽酶基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体NAAG-KO-pBR322,以电穿孔方法将基因剔除载体导入胚胎干细胞(ES),应用G418和更昔洛韦进行正负筛选,获得双抗性克隆,聚合酶链式反应(PCR)鉴定并测序获得正确同源重组的ES细胞克隆.结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得11只嵌合率＞50％嵌合体雄性小鼠,嵌合体小鼠与C57 BL/6J雌鼠交配后获得11只杂合子小鼠,其中雄性7只,雌性4只.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得7只纯合子小鼠,PCR鉴定其基因型,逆转录PCR (RT-PCR)提示该基因鼠未表达NAAG肽酶.结论 我们成功建立了NAAG肽酶基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象;初步的表型观察未发现NAAG肽酶基因剔除小鼠出现异常改变.     

骨髓基质细胞分化为神经元样细胞后与皮质神经元间突触的建立

目的 观察与大脑皮质神经元共培养的骨髓基质细胞(BMSCs)经诱导分化成神经元样细胞后,与脑皮质神经元之间形成功能性突触的情况.方法 无菌条件下取绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓,用贴壁筛选法体外培养获得GFP转基因小鼠BMSCs(GFP-GM-BMSCs),在体外培养、扩增、纯化.取第3代GFP-GM-BMSCs,种植到源于小鼠大脑的原代皮质神经元和胶质细胞中,培养介质为加有20 ng/mL表皮生长因子(EGF)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基(Neurobasal-A+2%B27),体外模拟建立细胞移植的共培养体系.共培养第10天,利用FM1-43荧光染料染色活动突触小泡的特性,通过荧光显微镜观察共培养的两种细胞之间形成的突触.结果 与神经元共培养的GFP-GM-BMSCs在含有EGF、bFGF的无血清培养基中7 d后分化为神经元样细胞.共培养10 d后,FM1-43染色阳性的突触囊泡明显增加,主要位于神经元样细胞胞体、突起及其末端结构上.结论 在体外模拟细胞移植共培养体系中,分化自GFP-GM-BMSCs的神经元样细胞能与神经元之间形成突触样连接.     

成年小鼠嗅球神经干细胞的培养和鉴定

目的 建立完善的成年小鼠嗅球神经千细胞分离培养和鉴定方法,探索新的成年神经干细胞种子来源. 方法 用无血清方法 分离培养成年小鼠嗅球来源的神经干细胞;用克隆培养、5-溴2-脱氧尿嘧啶核昔(BrdU)整合的方法 检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法 检测BrdU、神经干细胞标记物巢蛋白(nestin)和SOX2、分化的细胞标记物Tuj1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、04的表达. 结果 从成年小鼠嗅球能够分离、培养出具有自我更新、增殖能力的神经球.构成神经球的细胞呈nestin和SOX2阳性,它们分化后产生TuJ1阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、04阳性的少突胶质细胞. 结论 成年小鼠嗅球存在神经干细胞,其能够在体外进行培养、增殖、分化.是神经干细胞的新的种子来源.     

小鼠局灶性脑缺血后细胞凋亡及尼莫地平的影响

目的观察小鼠缺血区脑组织中细胞凋亡情况以及尼莫地平的影响.方法经右侧颈总动脉将尼龙单丝线栓至大脑中动脉造成永久性缺血模型,经尾静脉及腹腔注射尼莫地平,在流式细胞仪上测定凋亡细胞峰.结果细胞凋亡峰于脑缺血后3 d出现,单缺组最高,术前给药组最低,术后给药组介于两者之间.单缺组、术前给药组和术后给药组细胞凋亡率分别为(19.24±8.13)%、(6.40±2.15)%和(10.17±3.48)%.结论小鼠大脑中动脉闭塞后细胞凋亡峰于脑缺血后3 d出现,尼莫地平可减轻脑缺血区细胞凋亡.     

小鼠神经胶质细胞培养上清IL-6水平与脑不对称性的关系

目的　 通过体外培养小鼠大脑皮层神经胶质细胞 ,探讨该细胞分泌IL 6与脑不对称性的关系。 方法　分别取新生小鼠左、右两侧大脑皮层胶质细胞培养于 2 4孔板内 ;俟细胞长满孔底后 ,用细菌脂多糖 (LPS)刺激 ,培养 2 4h后收集上清并测定IL 6水平。结果　正常对照组胶质细胞培养上清中可检测出较低水平的IL 6 ,其趋势为右侧高于左侧 ,但统计学上无显著性差别 (P >0 .0 5 ) ;LPS刺激组IL 6水平明显增高 (P <0 .0 5 ) ,且右侧IL 6水平明显高于左侧 (P <0 .0 5 )。结论　 左、右两侧大脑皮层胶质细胞对LPS刺激的反应性存在差异 ,右侧显著高于左侧 ,这种异质性可能部分介导了脑不对称对免疫功能的影响     

转基因小鼠中bcl-xl基因的过表达在小鼠大脑中动脉栓塞中的保护作用

目的观察bcl-xl基因的过表达对小鼠大脑中动脉栓塞的保护作用,探讨其作用机制。方法通过建立bclxl转基因小鼠,经传代及检测后证实,该转基因小鼠中存在着bclxl基因的过表达,然后将该模型小鼠与同种系野生型小鼠同时行线栓永久性阻塞大脑中动脉,在缺血24h时测其神经功能评分,观察转基因小鼠与野生型小鼠的差别。在缺血后不同时间点测其梗死体积,观察梗死体积的动态变化。用TUNEL法观察小鼠的脑组织缺血后不同时间点再灌注时凋亡细胞的数量和分布情况。用免疫组化方法观察梗死前后两种小鼠脑组织中bcl-xl的表达量的差异。结果缺血24h后转基因小鼠的神经功能评分低于野生型小鼠(P<0.05)。缺血后3、24、72h,转基因小鼠的梗死体积均明显低于野生型小鼠,差异有显著性意义。TUNEL显示在缺血再灌注后的不同时间点,转基因小鼠皮质缺血区内的凋亡细胞数明显少于野生型小鼠,差异有显著性意义。免疫组化结果显示,梗死前后转基因小鼠的皮质细胞bclxl的表达量均明显高于野生型小鼠(P<0.05),且梗死后两种小鼠体内的bclxl的表达量均较梗死前增加(P<0.05)。结论在规范化的标准条件下,转基因小鼠中bclxl基因的过表达能够降低脑梗死的体积并改善小鼠的神经功能;过表达bclxl基因的这种效应可能是通过抑制细胞凋亡而实现的。     

C型Niemann-Pick病小鼠P27kipl表达异常与神经元变性和星形胶质细胞增生

目的探讨细胞周期蛋白抑制物P27kipl在NPC小鼠模型中神经元变性、死亡及星形胶质细胞增生中的作用.方法利用免疫组化和免疫荧光技术检测NPC-1小鼠脑部P27kipl表达及胶质细胞增殖的情况.结果 P27pipl在野生型小鼠大脑皮质、海马、基底节、脑干广泛的神经元及小脑Purkinje细胞均有较强的表达, 而且在部分胶质细胞也存在免疫反应性, 而在NPC小鼠的基底节、脑干神经元及小脑Purkinje细胞中P27kipl的表达明显弱于野生型小鼠.GFAP阳性星形胶质细胞出现P27kipl表达上调, 其细胞数在NPC小鼠大脑皮质、海马及脑干(尤其在桥脑处)显著增多, 提示星形胶质细胞异常增生.结论在NPC小鼠中枢神经元发生病变的同时, 星形胶质细胞也发生了明显的病理性增生, 细胞周期蛋白酶抑制物P27kipl失调参与了这一病理过程.     

Clip170和Clasp1在小鼠神经系统中的表达及在自噬中作用

目的 探讨微管正端示踪蛋白Clip170和Clasp1在小鼠神经系统中表达分布以及在细胞自噬蛋白降解通路中的作用.方法 以1.5个月龄C57BL/6J野生型小鼠为材料,使用蛋白印迹(Western blot)检测Clip170和Clasp1在小鼠眼、脑、脊髓和坐骨神经中表达情况,以HEK293细胞为材料,使用转染和We...     

树突状细胞瘤苗抗脑胶质细胞瘤作用体外实验研究

目的通过体外实验探讨应用树突状细胞制备的肿瘤疫苗抗脑胶质瘤的作用机制.方法培养大鼠树突状细胞,冻融法制备胶质瘤抗原,以肿瘤抗原致敏树突状细胞而制备胶质瘤疫苗.将实验动物分为4组,分别将胶质瘤疫苗、树突状细胞、生理盐水注入正常大鼠体内,到达预定时间取出大鼠脾脏,四噻唑蓝(MTT)法检测大鼠淋巴细胞活性.结果一次输入胶质瘤疫苗的正常大鼠的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显低于3次输入胶质瘤疫苗的正常大鼠;比较输入培养8 d的树突状细胞和输入生理盐水的大鼠,其淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性无统计学差异.结论应用树突状细胞制备胶质瘤疫苗可明显激活体内抗肿瘤免疫反应.     

胶质瘤抗血管生成治疗的实验研究

目的 研究VEGF反义寡脱氧核苷酸(AODN)对大鼠C6胶质瘤生长的影响,探讨抗血管生成作为胶质瘤辅助治疗新途径的可能性。方法 制备大鼠皮下C6胶质瘤模型,在接种细胞后不同时间点局部给予VEGF-AODN和其他处理因素,观察皮下肿瘤形成情况,测量肿瘤体积及重量,TUNEL法和电镜技术检测瘤细胞凋亡。结果 接种72h后开始局部注射反义寡核苷酸,使大鼠皮下C6胶质瘤的成瘤潜伏期延长,为(25.13±3.00)d,肿瘤重量减轻,为(1.13±0.17)g;皮下局部肿瘤形成后连续注射AODN,使肿瘤体积缩小,瘤细胞凋亡增加,瘤内坏死区扩大,但对细胞增殖无明显影响;电镜观察到AODN治疗组微血管基膜增厚,管径变小。结论 抗血管生成治疗可望成为胶质瘤治疗的一种辅助手段,具有临床应用前景。     

骨髓基质干细胞移植对大鼠胶质瘤局部微环境的影响

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对脑胶质瘤模型大鼠(荷瘤大鼠)胶质瘤的影响。方法:观察BMSCs培养上清液对C6胶质瘤细胞增殖活性、细胞周期的影响。观察脑内移植BMSCs对胶质瘤核增殖抗原(PCNA)表达阳性率、脑内胶质瘤微血管计数的影响及荷瘤鼠生存期的改变。结果:BMSCs培养上清液对胶质瘤细胞增殖没有明显的影响;BMSCs可抑制肿瘤边缘及卫星灶的肿瘤增殖,对肿瘤内部的细胞增殖没有明显影响。移植BMSCs后肿瘤边缘及卫星灶的微血管计数未见明显改变。移植BMSCs后的荷瘤大鼠脑内胶质瘤水肿有所减轻。结论:BMSCs移植可轻度抑制荷瘤鼠脑内胶质瘤细胞的增殖。     

Immunotherapy of rat glioma without accumulation of CD4~+CD25~+FOXP3~+ regulatory T cells

Immunotherapy may be used for the treatment of glioblastoma multiforme;however,the induced immune response is inadequate when either T cells or dendritic cells are used alone.In this study,we established a novel vaccine procedure in rats,using dendritic cells pulsed with C6 tumor cell lysates in combination with adoptive transfer of T lymphocytes from syngenic donors.On day 21 after tumor inoculation,all the rats were sacrificed,the brains were harvested for calculation of glioma volume,cytolytic T lymphocyte responses were measured by cytotoxic assay,and the frequency of regulatory T lymphocytes(CD4+CD25+FOXP3+) in the peripheral blood was investigated by flow cytometric analysis.The survival rate of rats bearing C6 glioma was observed.Results showed that the co-immunization strategy had significant anti-tumor potential against the pre-established C6 glioma,and induced a strong cytolytic T lymphocyte response in rats.The frequency of peripheral blood CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T lymphocytes was significantly decreased following the combination therapy,and the rats survived for a longer period.Experimental findings indicate that the combined immunotherapy of glioma cell lysate-pulsed dendritic cell vaccination following adoptive transfer of T cells can effectively inhibit the growth of gliomas in rats,boost anti-tumor immunity and produce a sustained immune response while avoiding the accumulation of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T lymphocytes.     

大鼠脑内C6胶质瘤模型的建立

目的建立稳定可靠的大鼠脑内C6胶质瘤模型。方法取20只健康成年SD大鼠,用立体定向技术将含1×106个C6胶质瘤细胞的悬液15μl缓慢接种于大鼠左侧尾状核区;接种后3周时随机挑选其中10只大鼠麻醉后行MRI检查,观察肿瘤影像学表现,随后处死大鼠取出肿瘤组织,行免疫组化及HE染色检测肿瘤生长情况;另外9只(麻醉死亡1只)大鼠继续饲养直至死亡,观察其生存时间。结果1只接种肿瘤细胞后出现短暂体重下降,但未出现明显神经系统体征,饲养60 d后尸检未见肿瘤生长;其余18只大鼠颅内均有肿瘤生长且无颅外转移现象,病理学检查结果显示脑内肿瘤呈浸润生长,可见新生血管,胶质纤维酸性蛋白表达阳性。荷瘤鼠生存时间为25~47 d,平均(32.78±2.34)d。结论采用立体定向方法向大鼠尾状核区种植C6细胞可获得较为稳定、可靠的胶质瘤动物模型,能够满足胶质瘤动物实验研究的需要。     

反义AKT2 cDNA治疗C6胶质瘤的体内外实验研究

目的研究反义AKT2(antisense AKT2，AS—AKT2)cDNA对鼠脑胶质瘤细胞系C6的生长抑制作用。方法将AS—AKT2 cDNA构建体转染鼠脑胶质瘤细胞系C6，原位杂交和蛋白印迹鉴定后，应用PCNA阳性率和MTT法检测细胞增殖能力，TUNEL法计算凋亡指数。应用立体定向技术将C6细胞和转染反义AKT2 cDNA的C6细胞种植到SD大鼠的右侧尾状核作为对照组和转染组；并对颅内已经形成C6胶质瘤的大鼠进行脂质体包裹的AS—AKT2 cDNA和空载体治疗；MRI动态监测大鼠颅内肿瘤生长情况，并检测标本AKT2和PCNA表达以及细胞的凋亡情况。结果转染AS—AKT2 cDNA后C6细胞AKT2表达显著抑制，增殖减慢，凋亡指数增加。反义治疗组和转染组大鼠生存时间明显延长；转染组和治疗组肿瘤标本AKT2表达下降或消失，PCNA阳性率降低，可见大量凋亡细胞，而对照组和空载组标本几乎没有凋亡细胞。结论体内外实验证明AS—AKT2 cDNA可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的重要优选靶的。     

LAK细胞及活化ETC联合移植治疗大鼠脑胶质瘤

目的：探讨以LAK细胞联合活化胸腺细胞（ETC）行瘤腔内移植治疗大鼠脑胶质瘤的效果。方法：进行LAK细胞,活化ETC体外杀瘤细胞活性比较,观察联合移植对荷瘤大鼠的作用,结果：联合移植组大鼠的生存期显延长,电镜观察瘤细胞空泡变性,胶质细胞增生,与对照组相比CD4,CD4／CD8均升高（P＜0．01）,CD8降低,胸腺不发生萎缩与凋亡,结论：联合移植对脑胶质瘤有治疗作用并且对荷瘤大鼠的免疫功能具有明显的改善作用。     

The 9LLUC/Wistar rat glioma model is not suitable for immunotherapy

The availability of a well-characterized animal brain tumor model will play an important role in identifying treatments for human brain tumors. Wistar rats bearing 9L glioma cells can develop solid, well-circumcised tumors, and may be a useful animal model for the evaluation of various therapeutic approaches for gliosarcomas. In this study, the 9L/Wistar rat glioma model was produced by intracerebral implantation of 9LLUC glioma cells syngenic to Fischer 344 (F344) rats. Bioluminescence imaging showed that tumors progressively grew from day 7 to day 21 in 9LLUC/F344 rats, and tumor regression was found in some 9LLUC/Wistar rats. Hematoxylin-eosin staining verified that intracranial tumors were gliomas. Immunohistochemistry results demonstrated that no CD4- and CD8-positive cells were found in the syngeneic 9LLUC/F344 model. However, many infiltrating CD4- and CD8-positive cells were observed within the tumors of the 9LLUC/Wistar model. Our data suggests that compared with 9L/F344 rats, 9L glioma Wistar rats may not be suitable for evaluating brain glioma immunotherapies, even though the model induced an immune response and exhibited tumor regression.     

大鼠骨髓基质细胞移植治疗胶质瘤的实验研究

目的将Wistar大鼠骨髓基质细胞体外移植入C6胶质瘤大鼠模型,观察其生物学特性及大鼠存活状态。方法建立C6载瘤模型和骨髓基质细胞移植治疗模型;待术后生长至3w和4w时行MRI检测;不同时间段内大鼠脑标本行免疫组化染色。结果骨髓基质细胞移植组模型平均生存时间为4.03w;对照组平均生存时间为3.88w;且其平均肿瘤体积与对照组无明显差异。大鼠体内移植体外培养5月余的骨髓基质细胞未发现肿物生成。骨髓基质细胞包绕在胶质瘤周围,对胶质瘤细胞有定向靶向作用。结论骨髓基质细胞对胶质瘤有定向靶向作用,可以安全的作为生物载体转染目的基因治疗胶质瘤。     

Improved lipid-mediated gene transfer in C6 glioma cells and primary glial cells using FuGene

Gene therapy is a potent method to counteract neurodegeneration by introducing genetic information encoding neuroprotective factors. In this study cationic lipids were used to transfer DNA into C6 glioma cells and primary glial cells. When comparing the novel compound FuGene with other commercially-available lipids, it was found that FuGene markedly enhanced gene transfer of a beta-galactosidase reporter plasmid into C6 glioma cells. FuGene had several advantages compared to other lipids, such as a very low toxicity and the capability of transfection under serum conditions. When optimizing, a DNA-lipid ratio of 150 ng DNA/1 microl FuGene and a concentration of 3 microl FuGene/1 ml medium was found to be optimal. The incubation time peaked after 8 h and the expression time reached an optimum between 2 and 6 days. When cells were transfected on 3 consecutive days for 6 h each ('boosting'), the transfection efficiency was markedly enhanced in primary glial cells. When using endotoxin-free DNA the transfection efficiency could be enhanced up to 3 times. The optimal transfection efficiency in C6 glioma cells and in primary glial cells was found to be 16.3 +/- 0.3% and 5.1 +/- 0.37% of total cells, respectively. In conclusion this study shows that the novel compound FuGene has a very high potential to transfer DNA into cells of glial origin, and it might be an interesting canditate for ex vivo and in vivo gene therapeutic approaches.