损伤后脑膜成纤维细胞对星形胶质细胞活性及胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的 体外观察损伤后脑膜成纤维细胞对星形胶质细胞活性及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法 体外分别培养SD大鼠大脑皮层的星形胶质细胞和大脑脑膜的成纤维细胞,经GFAP和纤维粘连蛋白(FN)免疫荧光染色鉴定后,将损伤后成纤维细胞来源条件培养基与星形胶质细胞共培养,根据成纤维细胞损伤时间不同分为正常对照组(A组)、损伤4h组(B组)、损伤24 h组(C组)、损伤72 h组(D组),应用CCK8试剂检测星形胶质细胞的活性,通过GFAP免疫荧光染色观察星形胶质细胞GFAP表达.将损伤的成纤维细胞与星形胶质细胞接触共培养72 h,根据与成纤维细胞的距离,将星形胶质细胞分为近(J)组和远(Y)组,通过FN和GFAP双重免疫荧光细胞化学染色观察GFAP表达.结果 B组星形胶质细胞活性低于A、C、D组(P＜0.05);非接触共培养时,C组星形胶质细胞GFAP表达强度显著高于B、D组(P＜0.05);接触共培养时,J组星形胶质细胞的GFAP表达强度显著高于Y组(P＜0.05).结论 损伤后脑膜成纤维细胞能触发星形胶质细胞反应性胶质化.     

人胚胎干细胞源神经球条件培养液对大鼠施万细胞增殖和迁移的影响

目的: 探讨人胚胎干细胞源神经球条件培养液(human embryonic stem cell-derived neurospheres conditioned medium, hESCN-CM)对施万细胞增殖和迁移的影响及其潜在的机制。方法: 取3~5 d SD大鼠双侧坐骨神经,分离纯化施万细胞,用免疫荧光染色法进行鉴定。分别用0%、50%和100% hESCN-CM刺激施万细胞,CCK 8实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,实时荧光定量PCR检测Nt3、Vegf、Ngf、Bfgf、Igf-1等mRNA的表达。结果： 免疫荧光染色结果显示,施万细胞S100特异性表达可达99%。CCK-8实验显示,与0% hESCN-CM相比,50% hESCN-CM刺激后施万细胞增殖明显增强,100% hESCN-CM刺激后施万细胞增殖明显降低(P均<0.05)。划痕实验显示,刺激6 h,与0% hESCN-CM刺激后施万细胞相比,50%和100% hESCN-CM刺激后施万细胞迁移明显增强(P<0.05);刺激12 h,50% hESCN-CM刺激后施万细胞迁移明显增强(P<0.01),100% hESCN-CM差异无统计学意义。荧光定量PCR结果显示, 与0%hESCN-CM相比,50%hESCN-CM刺激后施万细胞Nt3、Vegf、Ngf、Bfgf等mRNA表达明显增加(P<0.05)。结论： hESCN-CM可能通过上调Nt3、Vegf、Ngf、Bfgf等mRNA表达促进施万细胞增殖和迁移。     

坐骨神经缺损后损伤近端神经组织microRNA表达变化

目的:研究大鼠坐骨神经缺损后损伤近端神经组织中microRNA(miRNA)的表达变化。方法:采用miRNA芯片检测神经缺损0h(对照组),3h和6h(实验组)损伤近端神经组织miRNA的表达情况,应用real time Taqman PCR对芯片结果进行验证。结果:3h实验组与对照组比较发生上调和下调1.5倍以上的miRNA分别有4个和3个,6h实验组与对照组比较发生上调和下调1.5倍以上的miRNA分别有11个和6个,real time TaqmanPCR检测miR-132和miR-223的表达变化与芯片检测结果一致。结论:大鼠坐骨神经缺损3h和6h后损伤近端神经组织中miRNA的表达谱发生改变。     

miRNA-338促进施万细胞成髓鞘

目的:探讨在周围神经损伤后miR-338对大鼠施万细胞髓鞘形成的调控作用及机制.方法:采用实时荧光定量PCR检测损伤后坐骨神经中miR-338的表达变化;采用体外背根节神经元与施万细胞共培养实验,MBP染色检测miR-338模拟物对施万细胞再分化和成髓鞘的作用;芯片检测过表达miR-338对体外培养的施万细胞转录组的影...     

施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法:大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养,观察神经干细胞的形态变化,并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果:相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起;与单独培养组相比,免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多;GFAP表达阳性细胞数少。结论:施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖,并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

组织工程化神经的体外构建

目的:体外构建组织工程化神经,为周围神经缺损修复提供新的有效方法。方法:施万细胞与丝素蛋白神经移植物生物反应器中培养7d后,于丝素蛋白神经移植物两端各植入胚胎SD大鼠背根神经节(DRG),继续培养2w,3w和4w,采用免疫细胞化学方法、透射电镜和扫描电镜观察丝素蛋白神经移植物中神经细胞的生长状态。结果:施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养2w后,施万细胞和DRG发出的神经突起沿着丝素纤维,呈条带状纵向平行生长;3w后透射电镜观察到髓鞘形成;4w后扫描电镜显示梭形的施万细胞与DRG发出的神经突起呈纵向平行生长,并有类似基质样结构形成。结论:施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共同培养成功进行体外构建组织工程化神经。     

坐骨神经损伤中HMGB1对施万细胞迁移作用的研究

目的：研究周围神经损伤后高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)在损伤神经远侧端的细胞定位及表达变化,探讨HMGB1对施万细胞(Schwann cells,SCs)迁移特性的影响,阐明HMGB1功能作用的细胞学基础。方法：建立Sprague-Dawley(SD)大鼠坐骨神经损伤模型,采用免疫荧光组织双标化学染色观察神经损伤后HMGB1的定位和表达情况,新生1～3 d SD大鼠取材体外培养SCs并进行纯化,利用Transwell小室检测HMGB1对SCs迁移的影响。结果：大鼠坐骨神经中HMGB1和S100共定位,主要定位于细胞核内,损伤后远侧端HMGB1表达明显升高;体外培养的SCs经过纯化后排列整齐、胞体透亮,纯度可达95%以上,可用于后续体外试验;HMGB1蛋白能够促进SCs迁移。结论：HMGB1参与损伤坐骨神经远侧端SCs的功能调节。     

Sonic hedgehog促进血管外膜成纤维细胞表型转化并发生增殖迁移

目的 研究sonic hedgehog(shh)在血管外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化中的作用.方法 体外培养血管外膜成纤维细胞,免疫荧光、激光共聚焦显微成像、免疫印迹以及实时定量聚合酶链式反应检测蛋白和基因表达,Ki67、细胞生长曲线评价细胞增殖情况,划痕实验观察细胞迁移情况,α-肌动蛋白评价细胞表型转化情况.结果 shh在体外培养的血管外膜成纤维细胞中有表达,加入外源性的shh后(3.5μg/ml),Ki67~+的成纤维细胞增多,划痕区域的细胞覆盖率增大、成纤维细胞内出现α-肌动蛋白的表达;加入cyclopamine(40μmol/L)抑制内源性的shh信号通路后,Ki67~+的成纤维细胞减少,划痕区域的细胞覆盖率减小.结论 shh能够促进成纤维细胞增殖、迁移、向肌成纤维细胞转化.     

Stathmin通过促进伪足形成介导TNF-α诱导的皮肤成纤维细胞迁移

目的 探索stathmin在肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激模拟的创面愈合早期炎症反应中,对皮肤成纤维细胞迁移的作用及初步机制.方法 TNF-α刺激人真皮成纤维细胞模拟体外创面愈合早期炎症反应,通过免疫荧光观察TNF-α对伪足生成的影响,细胞划痕实验观察迁移的改变,免疫荧光及Western blot观察TNF-α对st...     

静电纺丝素蛋白-PLGA神经移植物的生物相容性评价

目的:初步探讨静电纺人工神经移植物丝素蛋白-PLGA神经导管(electrospun silk fibroin-PLGA nerve conduits,SP-NGCS)的生物相容性。方法:(1)体外实验:SP-NGCS与施万细胞共培养,形态观察与MTT检测。(2)体内试验:将SP-NGCS植入大白兔皮下,术后2W,4W,8W,12W,24W取材,切片后观察局部组织反应。结果:施万细胞生长状态良好,无毒性反应,且肉眼观察和形态组织学染色观察,组织炎症反应轻微,SP-NGCS在24W时大部分降解。结论:SP-NGCS生物相容性良好,是理想的人工神经移植物。     

大鼠坐骨神经损伤中GAP—43免疫电镜初步观察

目的：进一步研究ＧＡＰ－４３（生长相关蛋白４３）在周围神经损伤和再生中的表达部位及其作用。方法：采用免疫电镜技术对６只大鼠坐骨神经损伤和再衙的ＧＡＰ－４３表达情况作初步观察。结果：电镜观察发现大鼠腰骶髓神经元、背根神经节神经元、胶质细胞等胞浆和胞核表密集的ＧＡＰ－４３免疫反应颗粒沉积。结论：据结果和笔者筠有的ＧＡＰ－４３免疫组化研究，发现周围神经损伤和再生中，可引起ＧＡＰ－４３较广泛斩表达；其表达     

腺样囊性癌SACC-83细胞对雪旺氏细胞的促生长作用

目的:观察在体外共培养中腺样囊性癌细胞对由坐骨神经生长出的雪旺氏细胞的影响。方法:将腺样囊性癌细胞、舌癌细胞及成纤维细胞分别与小鼠坐骨神经共培养,制备细胞玻片并行S100免疫组化染色实验。结果:腺样囊性癌细胞可促进由坐骨神经长出的雪旺氏细胞增生;经S100免疫组化染色,阳性为雪旺细胞;阴性为成纤维细胞。结论:坐骨神经与腺样囊性癌细胞共培养可促进雪旺氏细胞增生。     

周围神经断端桥接后数量放大效应的研究

目的证实周围神经横截面不对等修复时神经纤维数量的放大效应。方法选用雄性Sprague-Dawley大鼠50只,分为A、B、C、D、E5组。A、B、C3组将大鼠坐骨神经切断后,A组近端保留完整断端与远端坐骨神经用甲壳质套管留置2mm间隙套接,B组在近端5mm处将坐骨神经中的腓总神经束结扎切断,将胫神经束与远端坐骨神经套接,C组在近端5mm处将坐骨神经中的胫神经束结扎切断,将腓总神经神经束与远端坐骨神经套接;D、E两组将胫神经在分叉处远端5mm组将胫神经切断;D组结扎切断2／3近端纤维,将剩余神经纤维与远端胫神经进行甲壳质套管套接,E组将全部近端纤维与远端胫神经进行甲壳质套管套接。1、2、4、12周后分别取材进行组织学和电生理研究。结果采用SPSS软件进行统计学分析。结果12周后电生理检查发现,各组诱发出的最大波幅下面积B、C两组小于A组（均P〈0．05）,D组小于E组（P〈0．05）。A组与B、C组之间,D、E组之间感觉神经传导速度相近。锇酸染色有髓神经纤维计数：各组远端均大于近端：A组远端比近端增加34．4％,B组增加39．6％,C组增加80．4％,D组增加101．1％,E组增加48．9％（P〈0．05）。结论在周围神经桥接后,远端神经纤维数量明显大于近端,存在神经纤维数量的放大;同源的神经桥接的放大效应大于非同源的神经。临床上较细神经修复远端粗大神经是可能的。     

大鼠坐骨神经再生过程中的施万细胞自噬作用

目的 探讨大鼠坐骨神经再生过程中的细胞自噬作用。方法 横切大鼠坐骨神经制作wallerian变性模型．分别于造模后0、0．5、1．0、1．5、2．0、3．0、4、5、7、10、15d取远断端组织行电镜结构观察。结果 轴突在第0．5天时从髓鞘脱离，溃变呈空泡状。第2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片，神经膜细胞(Schwann cell，施万细胞)内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片，并与溶酶体融合形成自噬泡，呈酸性磷酸酶(AcPase)阳性。第4天时内膜区偶见幼稚细胞，1周后见大量幼稚细胞。第7天后施万细胞内自噬泡数量开始减少。实验全程偶见巨噬细胞，内有吞噬泡。结论大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经施万细胞自噬清除。施万细胞脱分化为施万细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程。     

Fas 配体(FasL)在大鼠损伤坐骨神经中的表达及其功能研究*

目的：采用分子生物学技术分析大鼠坐骨神经损伤后坐骨神经远端Wallerian溃变(Wallerian degeneration, WD)过程中,Fas配体(Fas ligand, FasL)的表达变化,并通过干扰FasL的表达分析FasL在施万细胞(Schwann cells, SCs)中的功能,探讨FasL在周围神经损伤修复与再生过程中的作用机制。方法：建立大鼠损伤坐骨神经WD模型,采用Real-time PCR和Western Blot的方法,分析FasL在大鼠坐骨神经WD过程中的表达变化,并通过培养和纯化的SCs,siRNA干扰FasL的表达分析FasL在SCs中的功能。结果：大鼠坐骨神经损伤后,在WD过程中,FasL的表达量显著升高,FasL siRNA干扰后SCs的增殖和迁移均增加,且引起SCs其他相关基因的表达变化。结论：大鼠坐骨神经损伤后,FasL的表达发生变化并影响SCs的生物学功能,提示FasL在周围神经损伤修复与再生过程中发挥了一定的作用。     

坐骨神经损伤后生长相关蛋白表达的免疫组化研究

目的：探讨周围神经在损伤后远侧端生长相关蛋白（GA9－43）的表达。方法：切除SD大鼠－侧坐骨神经5mm,造成坐骨神经缺损伤模型,两周后用免疫组化法检测损伤远侧端神经组织中GAP－43的表达,结果：损伤神经远侧端雪旺细胞表可见棕色阳性产物,而正常神经组织中未见阳性反应产物。结论：损伤神经远侧端雪旺细胞中可见GAP－43表达,在正常神经组织中GAP－43低表达或无表达。     

成年大鼠周围神经损伤后远侧端雪旺细胞变化的体外研究

目的:体外观察大鼠坐骨神经损伤不同时间段远侧端雪旺细胞的变化。方法:切断成年SD大鼠坐骨神经,以远侧端为研究对象,术后1、2周和1个月取材,进行雪旺细胞体外培养,倒置相差显微镜,S-100免疫荧光染色及激光扫描共聚焦显微镜观察雪旺细胞的形态,MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期。结果:神经被切断后,雪旺细胞形态发生改变,1月组最明显;细胞活力和增殖能力也发生变化,切断1周组活力和增殖能力最强,随后逐渐变弱。结论:周围神经损伤后雪旺细胞形态发生变化,细胞的活力和增殖能力随着时间的推移逐渐下降但仍未停止增殖。     

周围神经65KD蛋白对培养鼠胚脊髓运动神经元的影响

目的：为了解周围神经损伤后期远侧端特异性表达的６５ＫＤ蛋白对鼠胚脊髓神经元的影响。方法：选用ＳＤ大鼠坐骨神经横断后２周的动物模型，自然凝胶系统电泳分析损务后神经远侧端中的蛋白组分，将６５ＫＤ蛋白区带胶条与１４天鼠胚脊髓运动神经元联合培养，结果：损伤后２周的坐骨神经元侧端中特异性地出现表达增强的６５ＫＤ蛋白；与含６５ＫＤ蛋白区带胶条联合培养的脊髓运动神经元细胞存活数量多，突起生长旺盛，结论：坐骨神经     

GDNF在大鼠坐骨神经损伤后的表达变化研究

目的观察坐骨神经损伤后胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的表达变化.方法分别制作成年SD大鼠坐骨神经夹伤（用血管钳压榨坐骨神经,达二度损伤）、切断伤（于梨状肌下孔下方1cm切断坐骨神经）动物模型,于损伤后第1、2、4、6、8周取材,按ABC法进行免疫组织化学分析.结果（1）正常坐骨神经中有较弱GDNF表达;（2）坐骨神经损伤后GDNF的表达增强;（3）坐骨神经损伤方式不同,GDNF的表达变化方式不完全相同;切断组神经组织GDNF的表达先增强后减弱,远段神经GDNF的表达于第2周达高峰,近段于第4周达高峰.夹伤组损伤远、近段神经组织GDNF表达变化基本相同,呈缓慢递增趋势,于第8周时表达最强.结论在损伤刺激下周围神经组织出现GDNF的高表达,并呈现出一定的规律性,参照此规律运用外源性GDNF治疗神经损伤可能会取得较好疗效.