蛋白A-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建与表达

绿色荧光蛋白 (GFP)是一种生物发光蛋白。GFP作为基因表达标记物或融合蛋白标记在动物、植物、微生物的研究中广泛应用。本实验将gfp基因与蛋白A基因重组 ,在大肠杆菌中融合表达为A GFP蛋白。根据gfp基因与质粒载体pRIT2T的序列 ,设计一对引物 ,以PCR技术扩增gfp基因序列 ,克隆到表达载体pRIT2T的EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点 ,与载体中的A蛋白基因融合。重组质粒转化大肠杆菌Top10 ,菌落在 36 5nm紫外光下呈现明亮的绿色荧光。本研究成功构建并表达了GFP与蛋白A的重组质粒 ,为开展GFP的研究及应用提供了生物工程工具的前体。     

重组慢病毒载体介导不同启动子驱动的绿色荧光蛋白在多种(不同)细胞中的表达影响

目的比较不同启动子的慢病毒转导细胞后,在不同细胞系中驱动绿色荧光蛋白表达的效率高低。方法采用3种不同启动子的转移质粒,与包装质粒共转染293T细胞,转染60 h后,收集慢病毒上清。用等量的三种慢病毒液转导5种细胞系(293A、MOLT-4、PC3、DU145及RM1),72 h后,荧光显微镜下观察转导效果;流式细胞仪计数转导效率。结果不同启动子(Ubiquitin,EF1α,CMV)在5种细胞系中驱动绿色荧光蛋白的表达及转导效率不同。在293A和PC3细胞中,CMV为最强启动子,转导率分别为(94.83±2.87)%和(20.90±3.15)%;但在MOLT-4和DU145细胞中,EF1α为最强启动子,转导率分别为(74.27±2.14)%和(25.13±4.95)%;在RM1细胞中,Ubiquitin为最强启动子,转导率为(16.77±0.38)%。结论在慢病毒载体介导基因表达研究中,要考虑选取合理的细胞和启动子以获得高效的转导效率。     

绿色荧光蛋白在细菌学研究中的应用

本文介绍了绿色荧光蛋白的基本特征及其在细菌学研究领域中的主要应用。     

绿色荧光蛋白在细胞学研究中的应用

本文介绍了绿色荧光蛋白的基本特征及其在细菌学研究领域中的主要应用 。     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

慢性重型乙型肝炎患者的巨细胞病毒-pp65抗原与乙型肝炎病毒DNA、乙型肝炎e抗原及白细胞相关性研究

目的探讨慢性重型乙型肝炎患者CMV-pp65抗原与HBV DNA、HBe Ag及白细胞等因素的相关性。方法采用免疫组化二步法检测100例慢性重型乙型肝炎患者的CMV-pp65抗原,荧光定量PCR方法检测HBV DNA,酶联免疫吸附法测定HBe Ag,电阻抗法检测白细胞。结果 CMV-pp65抗原阳性组和阴性组HBV DNA病毒载量差异无统计学意义(Z=-1.185,P0.05)。CMV-pp65抗原阳性组血清HBe Ag阳性14例,阴性组HBe Ag阳性31例,阳性组HBe Ag阳性率低于阴性组,差异有统计学意义(χ2=6.377,P0.05)。CMV-pp65抗原阳性组血白细胞水平低于阴性组,差异有统计学意义(t=4.554,P0.05)。结论 CMV-pp65抗原血症与血清HBe Ag阳性和白细胞水平呈负相关,与HBV DNA病毒载量无相关性。血清HBe Ag阴性和白细胞水平降低,可能是慢性重型乙型肝炎患者合并活动性CMV感染的危险因素之一。     

乙肝病毒标志物微粒子酶免疫法检测结果与前S1抗原及DNA的对比分析

[目的]探讨采用微粒子荧光免疫分析法（MEIA）检测乙肝病毒（CHB）感染者血清标志与pre-S1、HBV-DNA、血清ALT、AST的相关性。[方法]分别采用美国微粒子免疫荧光分析法（MEIA）,荧光定量PCR法.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患者血清中的前S1抗原。同时用酶法对丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）进行检测。[结果]435例CHB感染者preS1、HBV-DNA、阳性检出率分别为66.9%和70.3%,两种方法符合率为95%（P﹥0.05）。在HBeAg阳性组与阴性组中preS1、HBV-DNA检出率分别为88.2%、95.8%、53.4%、54.1%,差异有统计学意义（P均﹤0.01）。[结论]pre-S1与HBV-DNA及HBeAg高度相关,pre-S1是一项重要的反映CHB感染和复制的指标。     

RNA干扰技术抑制哺乳动物细胞绿色荧光蛋白表达的研究

目的本研究旨在探讨阳离子脂质体的体外转染效率、化学合成双链RNA(dsRNA)诱导RNA干扰(RNAi)的效应强度及其作用特点,为采用RNAi技术开展基因治疗提供实验依据。方法①采用磷酸钙沉淀法构建293T/GFP细胞株。②体外化学合成dsRNA,经由三种不同的阳离子脂质体TransIT-TKO,Oligofectamine reagent,Lipofectamine2000导入293T/GFP细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪测定荧光强度的变化,观察不同阳离子脂质体的体外转染效率。③采用dsRNA-Lipofectamine2000复合物转染293T/GFP细胞。dsRNA分设5个不同的浓度(0.01,0.02,0.04,0.08,0.16μmol/L)转染细胞48h以观察剂量效应关系。dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl转染细胞,于4个不同的时间点(12h,24h,48h,72h)观察时间效应关系。结果绿色荧光蛋白序列特异性dsRNA(dsRNA-eGFP)经由三种不同的阳离子脂质体导入细胞均可产生RNAi效应,序列非特异性dsRNA(dsRNA-unrelated)无抑制效应。在三种不同的阳离子脂质体中,Lipofectamine2000的转染效率最强,转染48h可将293T/GFP细胞荧光强度降低约80%,与空白载体组比较差异显著,TransIT-TKO组,Oligofectamine reagent组分别降低41.02%、37.45%,与空白载体组比较无显著性差异,而且TransIT-TKO、Oligofectamine的细胞毒性较强。结果还表明dsRNA/Lipo-fectamine2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性,dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl/6孔培养板转染细胞48h的抑制效应最强。结论①体外化学合成的dsRNA可有效诱导哺乳动物细胞出现序列特异性基因沉默效应。②三种不同的阳离子脂质体中Lipofectamine2000的转染效率最强,且细胞毒性轻微。③dsRNA/Lipofectamine2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性。     

绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

不同产地甘草对HepG2.2.15细胞表达乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原的影响

目的通过体外实验比较不同产地的甘草提取液对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用,为甘草药材的质量评价及抗病毒新药的研发提供科学依据。方法体外培养人肝癌细胞株(Hep G2.2.15)细胞,以拉米夫定作阳性对照药物,噻唑蓝(MTT)法检测甘肃、内蒙古甘草、甘草酸、甘草苷对细胞的生长抑制作用,分别计算抑制率和半数毒性浓度(TC50);酶联免疫吸附(ELISA)法检测药物对细胞表达的乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)和乙型肝炎e抗原(HBe Ag)的影响,分别计算抑制率和半数抑制浓度(EC50),最后计算治疗指数(TI)以进行抗HBV作用评价。结果甘肃、内蒙古甘草具有抑制Hep G2.2.15细胞生长,随着药物浓度增大,其抑制率也随之增大。甘肃甘草对HBs Ag、HBe Ag抑制作用的TI值为11.570、6.760,内蒙古甘草为8.360、5.020。结论甘肃、内蒙古甘草提取液在体外均有明显抑制HBV作用,甘肃甘草作用更强。     

神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的探索大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)的体外培养,探讨NSCs作为基因靶细胞,以及逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记NSCs的可行性.方法胚胎大鼠脑组织分离神经干细胞,无血清培养,免疫组织化学技术鉴定.用Lipofectin将pLEGFP-N1逆转录病毒载体导入PA317包装细胞,用G418筛选获得抗性细胞克隆,扩增抗性细胞并收集病毒上清;病毒上清感染神经干细胞,用G418筛选,荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆,并做免疫组化鉴定;进一步培养扩增,做传代细胞的分化鉴定.结果培养出大鼠胚胎神经干细胞.荧光显微镜下检测感染逆转录病毒的神经干细胞,以及免疫组化鉴定,均显示EGFP获得良好表达;而且感染细胞能够被诱导分化为神经元和神经胶质细胞.结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;神经干细胞可直接作为基因靶细胞;利用逆转录病毒载体,建立稳定表达EGFP的神经干细胞系具有可行性,为进一步做标记细胞移植研究奠定基础.     

GFP-MOMP融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的 构建GFP-MOMP融合蛋白真核表达重组质粒pEGFP／MOMP，利用脂质体体外转染Heb细胞，观察MOIMP在真核细胞中的表达。方法 PCR法从D型Ct基因组中扩增MOMP全长基因，克隆至pEGFP真核表达载体的相应位点，进行序列分析和酶切鉴定后，脂质体介导重组体pEGFP／MOMP转染Heb细胞，荧光显微镜、Western blot鉴定MOMP基因的表达。结果 PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMID基因片段；成功的构建真核表达重组体pEGFP／MOMP；重组质粒pEGFP／MOMP在HeLa表达出约71kDa大小的融合蛋白。结论 GFP-MOMP能够在体外真核细胞中表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能及核酸疫苗的制备提供实验依据。     

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的 构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达。方法 PCR扩增M-CSF基因，定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，脂质体介导将pEGFP-CSF转染人NH3T3细胞，以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，RT-PCR检测结果显示RT～PCR扩增产物与M～CSF目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的。nRNA。结论 真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础。     

分子生物学中报告基因的主要类型及应用现状

报告基因技术在分子生物学领域中已经广泛应用于基因表达调控、启动子活性分析、信号转导、受体功能鉴定以及基因治疗、药物筛选等领域,而且随着技术和检测方法的进步,不断有新的更加灵敏和非损伤性的报告基因出现,尤其是一些不影响细胞繁殖、能够实时检测的荧光报告基因的发展更为迅速.该文从报告基因的使用现状出发,对其主要的种类、特征、...     

普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化

目的通过原核表达获得普马拉病毒重组核蛋白。方法采用RT-PCR方法,从感染普马拉病毒的鼠肺标本中扩增得到编码核蛋白1-117 aa的基因片段。将截短的核蛋白基因片段插入原核表达载体PQE30构建重组质粒,转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,利用N i-NTA Agarose对表达产物进行纯化。结果重组蛋白得到了高效表达。表达产物分子量15 000,在菌体中主要以可溶性蛋白形式存在。通过亲和层析,得到了纯化的重组蛋白。结论普马拉病毒重组核蛋白基因片段得到了有效表达。     

P,P''''-DDE对睾丸支持细胞雄激素结合蛋白表达的影响

[目的]研究雄激素结合蛋白在P,P'-DDE致雄性大鼠生殖内分泌干扰过程中的作用机制。[方法]对大鼠睾丸支持细胞离体原代培养4-5 d;设溶剂(DMSO)及阴性对照,以终浓度为30、50、80、100 μmol／L的P,P'-DDE作用于支持细胞24h,计数200个细胞,计算支持细胞存活率;分别以浓度为10、30、50 μmol/LP,P’-DDE作用于支持细胞24h, 运用一步法RT-PCR检测支持细胞内雄激素结合蛋白基因mRNA水平。[结果]P,P'-DDE在50μmol／L及以下浓度作用 24 h后,支持细胞存活率>90％,而80μmol/L组仅45％;染毒24 h后,对照组及10、30、50 μmol/L的P,P’-DDE组支持细胞内雄激素结合蛋白mRNA灰度比值分别为0．3140±0．1020、0．3920±0．0949、0．5837±0．1221、0．6490±0．1718,随 p,p'-DDE所给浓度的增高而逐渐升高,且30、50 μmol/L组与对照组差异存在显著性(P<0．05),呈剂量依赖关系。[结论] p,p'-DDE作用于睾丸支持细胞后,雄激素结合蛋白基因转录水平可明显升高,从而表达增强,促进雄激素结合蛋白的生成,代偿性地维持生精过程。     

人肺癌组织耐药基因（MDR1）表达及意义

应用ＰＣＲ定量分析技术对１０４例肺癌患者的ＭＤＲ１基因进行了前瞻性研究，结果发现，初治患者６９％（５５／８０）有ＭＤＲ１基因表达增高，而经过治疗的患者１００％（２４／２４）有ＭＤＲ１基因表达增高，其中小细胞肺癌（ＳＣＬＣ）的增高有显著意义（Ｐ＜０．０１），在没有经过治疗的患者，２１％（１８／８０）ＭＤＲ１表达量处于高水平，而经过治疗的患者，７５％（１８／２４）ＭＤＲ１表达量较高（Ｐ＜０．０１）。ＭＤＲ１基因高表达的患者化疗有效率明显低于ＭＤＲ１不表达或低表达的患者，其中以ＳＣＬＣ患者最为明显（Ｐ＜０．０１）。结果表明，检测肺癌患者尤其是ＳＣＬＣ患者的ＭＤＲ１基因的表达情况，对临床指导化疗非常重要。     

中国2006年麻疹野病毒血溶素基因特征分析

目的研究中国2006年流行的麻疹野病毒代表株血溶素蛋白（Fusion Protein,F）基因的分子特征,与其他年份毒株相比分析F基因的变异规律。方法从2006年各省（自治区、直辖市）送检的麻疹野病毒中选取9株代表株,使用逆转录-聚合酶链反应扩增病毒的F基因全长,并进行核苷酸序列测定,同时与中国疫苗株及其他年份毒株进行序列比对及基因亲缘性关系分析。结果2006年9株中国流行麻疹野病毒代表株,其核苷酸同源性为98．5％-99．8％,氨基酸同源性为99％-100％;与中国疫苗株沪。相比,其核苷酸同源性为95．4％-96．2％,氨基酸同源性为96．7％～97．2％;与1999～2003年代表株相比,其核苷酸同源性为97．9％-99．7％,氨基酸同源性为98．1％-100％。F基因3个糖基化位点（第32、64、70位氨基酸）、对病毒整合功能起着重要作用的第112位精氨酸（Arg）、第195位亮氨酸（Leu）未发生改变。结论中国2006年流行的麻疹病毒F基因变异不大,与其他年份毒株相比变异也不明显。F蛋白的重要功能位点未发生变异,F蛋白的变异与2006年麻疹流行无相关性。但由于F蛋白对病毒感染细胞和促使机体产生抗体具有重要意义,对F蛋白变异规律进行常规监测,对了解麻疹病毒变异规律和评价疫苗的保护效果具有重要意义。     

13株中国麻疹野病毒血溶素蛋白基因特征分析

目的分析1999～2003年中国（未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同）流行的H,基因型麻疹野病毒代表株血溶素蛋白（Fusion Protein,F）基因的分子特征。方法从1999～2003年中国分离的麻疹野病毒株中,选取13株H1基因型代表株,包括H1a基因亚型麻疹野病毒8株和H1b基因亚型麻疹野病毒5株。使用逆转录一聚合酶链反应扩增病毒的F基因全长,并进行核苷酸序列测定,同时与中国疫苗株及其它国家的A、D2、D6、D7、E基因型参考株进行序列比对及基因亲缘性关系分析。结果1999～2003年13株中国流行麻疹野病毒代表株中,核苷酸同源性为98．1％～99．0％,氨基酸同源性为98．1％～100．0％,与中国疫苗株沪191相比,其核苷酸同源性为95．7％～96．2％,氨基酸同源性为96．9％～97．2％;而与其它基因型相比,核苷酸同源性为94．4％～96．2％。F基因3个糖基化位点（第32、64、70位氨基酸）、对病毒融合功能起着重要作用的第112位精氨酸、第195位亮氨酸未发生改变。结论1999～2003年中国流行的H1基因型麻疹野病毒的F基因无明显差异,F蛋白上已知的重要功能位点未发生变异,推测中国流行的麻疹野病毒F蛋白的结构和功能未发生较大改变,但由于F蛋白是重要的功能蛋白,对F蛋白核苷酸和氨基酸的变异规律进行常规监测,对了解麻疹野病毒流行特点及其遗传变异规律具有重要意义。     

铅对心肌细胞膜脂、膜蛋白运动影响特征的研究

采用荧光偏振及ＥＳＲ（电子自旋共振）技术观察铅对心肌细胞膜脂、膜蛋白运动的影响。与对照组相比,１～１００μｍｏｌ／Ｌ铅可使荧光偏振度Ｐ值及微粘度η值呈增加趋势,但无显著性差异。在同一剂量相同作用时间下,铅对τＣ值有明显影响,在１～５０μｍｏｌ／Ｌ范围内呈剂量反应关系,即随铅剂量增大,τＣ值增大。τＣ增大,膜蛋白运动减慢;τＣ减小,膜蛋白运动加快。提示铅对心肌细胞膜蛋白的影响大于膜脂。