低强度超声波对辐射后血管内皮细胞影响的体外研究

[目的]探索低强度超声波对辐射后血管内皮细胞增殖功能和酪胺酸激酶膜受体(KDR)表达的作用。[方法]体外培养的第3代血管内皮细胞以5×10~4/孔的浓度接种于6孔板内,分别接受0、3、6、9Gy4个剂量~(60)γ射线的辐射,实验组接受低强度超声波仪的干预(功率:0.8W/cm~2,频率:1.6mHz);对照组低强度超声波仪的功率设为0;检测细胞的增殖和KDR的表达。[结果]剂量为0、3、6Gy时,第8天的细胞记数(×10~4/孔)实验组分别为:22.07±1.83、21.67±1.45、12.76±0.74,对照组分别为:20.08±0.49、8.44±1.48、4.76±0.13,实验组的细胞数明显增多(P<0.05);同时细胞融合时间也明显缩短;辐射剂量为0、3Gy时,实验组KDR表达分别呈阳性和弱阳性,较对照组KDR表达均有所增强。[结论]低强度超声波对辐射后血管内皮细胞的增殖功能和KDR的表达均有提高作用。     

电离辐射对大鼠类成骨细胞的影响

【目的】探讨不同剂量电离辐射后大鼠类成骨细胞生物学性状的改变。【方法】成骨细胞通过酶消化法从SD大鼠乳鼠颅骨中获取传代 ;将第 2代细胞分别进行 0、1、4、6、9Gy的 γ线辐射 ,检测成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌量。【结果】细胞增殖、功能和分化受γ线电离辐射抑制的程度不同 ,1Gy时增殖即受到抑制 ,骨钙素分泌量在 4Gy时才受到显著地抑制 ,而碱性磷酸酶活性值甚至在 6Gy下抑制作用才有意义。【结论】电离辐射后 ,成骨细胞的增殖、功能和分化均受到抑制 ,但各指标对电离辐射的敏感性不同。     

大黄酸-雌酮对大鼠成骨细胞增殖和分化的作用

【目的】研究大黄酸-雌酮（LC-1）对原代培养大鼠成骨细胞增殖和分化的作用。【方法】酶消化法分离培养SD乳鼠颅盖骨成骨细胞；采取MTT法测定细胞增殖，磷酸苯二钠法（pNPP）测定细胞内外碱性磷酸酶（ALP）活性，研究不同浓度LC-1对成骨细胞增殖和分化能力的影响，并与雌酚酮和大黄酸的作用进行比较。【结果】给药3d后，与空白对照组相比：10^-6mol／L LC-1组、10^-7mol／L LC-1组和10^-7mol／L雌酚酮组明显促进成骨细胞增殖和增加细胞内外ALP活性（P〈0．05）；大黄酸抑制成骨细胞增殖，其中10^-6mol／L组有明显差异（P〈0．05），同时有增加细胞ALP活性的趋势，但无统计学差异。【结论】大黄酸-雌酮在体外可以促进成骨细胞增殖和分化。     

补骨脂素对酒精诱导的成骨细胞增殖的影响

【目的】观察补骨脂素对酒精诱导的成骨细胞增殖的影响,探讨补骨脂素防治酒性性骨质疏松的机制。【方法】采用碱性磷酸酶(ALP)染色法鉴定从大鼠乳鼠头盖骨分离的成骨细胞。将鉴定成功的成骨细胞随机分为4组:空白对照组、酒精组(即模型组)、补骨脂素组、补骨脂素+酒精组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖情况。【结果】与空白对照组比较,酒精组24、48、72、96 h各时间点成骨细胞增殖活性均显著降低(P0.05),补骨脂素组各时间点成骨细胞增殖活性虽升高,但差异均无统计学意义(P0.05)。与酒精组比较,补骨脂素+酒精组24 h成骨细胞增殖活性显著升高(P0.05),2组48、72、96 h细胞增殖活性差异均无统计学意义(P0.05)。【结论】补骨脂素对体外酒精诱导的成骨细胞增殖有促进作用。     

大豆异黄酮对体外培养成骨细胞作用的实验研究

目的研究大豆异黄酮对体外培养成骨细胞增值及分化等.方法大豆异黄酮加入新生SD大鼠颅骨分离培养的成骨细胞中.用噻唑蓝( MTT )比色法检测细胞增殖情况;用对硝基酚磷酸盐法测定成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、用放免法测定OB骨钙素( BGP)含量,以反映OB的分化状况.结果用大豆异黄酮体外培养大鼠成骨细胞MTT吸光值明显增加,成骨细胞ALP活性显著升高,成骨细胞BGP分泌显著增加(p<0.05).结论大豆异黄酮具有促进成骨细胞增殖分化的作用,其作用程度低于雌激素.大豆异黄酮的弱雌激素作用可能是其防治绝经后骨质疏松的重要机制.     

熟地黄含药血清对成骨细胞及分泌胰岛样生长因子1的影响

目的：探讨熟地黄含药血清对新生SD大鼠成骨细胞（ OB）增殖及胰岛样生长因子1（ IGF-1）分泌的影响。方法：采用1日龄SD大鼠分离培养OB;熟地黄水煎剂分高、中、低3个剂量组对SD大鼠灌胃,生理盐水作为对照组,8 d后取大鼠血清加入培养,每组分别培养24、48、72 h,用MTT法、pNPP法分别检测熟地黄含药血清对OB增殖及ALP活性的影响,用ELISA法测定培养上清中IGF-1的含量。结果：与对照组比较,在24、48、72 h时间点熟地黄含药血清高、中、低剂量组OB增殖程度显著升高,且高剂量组促进增殖效果较好（ P〈0.05）;与对照组比较,熟地黄含药血清高、中、低剂量组ALP 活性显著增强,且高剂量组较高（ P〈0.05）;在48 h时间点熟地黄含药血清高、中、低浓度组IGF-1分泌量升高,且高剂量组分泌量较高（ P〈0.05）。结论：熟地黄含药血清能够促进成骨细胞的增殖与分化,同时促进成骨细胞分泌IGF-1的作用。     

骨炎定促进血管内皮细胞增殖的血清药理学研究

【目的】观察补肾益气活血方骨炎定对血管内皮细胞增殖的影响。【方法】将新西兰兔随机分为空白组和骨炎定低、中、高剂量组(剂量分别为2.5、5、10 g/kg);以骨炎定高剂量灌胃给药,连续7 d,于最后1次给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h分别取血,分离含药血清,作用于人脐静脉内皮细胞,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同时相的骨炎定含药血清对血管内皮细胞的增殖作用;并取给药后2 h含药血清,部分灭活,比较灭活血清与不灭活血清对血管内皮细胞增殖的影响,以及检测不灭活含药血清不同作用时间(12、24、36 h)对内皮细胞增殖的影响;以骨炎定低、中、高剂量灌胃给药,连续7 d,取最后1次给药后2 h含药血清,观察不同剂量骨炎定对血管内皮细胞增殖的影响。【结果】高剂量骨炎定给药后0.5~4 h制备的含药血清对血管内皮细胞增殖均有显著促进作用(均P<0.01),其中以给药后2 h者作用最强;灭活与不灭活血清均对血管内皮细胞增殖具有促进作用(P<0.01),且后者作用强于前者(P<0.05);不灭活含药血清作用12、24、36 h后均对血管内皮细胞增殖具有促进作用(P<0.01),且呈时效关系;低、中、高剂量骨炎定含药血清均对血管内皮细胞具有促进作用(P<0.01),并呈量效关系。【结论】补肾益气活血方骨炎定对血管内皮细胞增殖具有促进作用。     

VEGF对兔骨髓基质干细胞成骨诱导及成骨细胞分化与增殖影响的体外研究

目的探讨体外条件下成骨诱导剂和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的联合应用对兔骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)成骨分化过程中细胞增殖和分化的影响,为骨组织工程研究提供实验基础。方法取2月龄新西兰大耳白兔,麻醉后抽取股骨骨髓进行BMSCs原代细胞培养,取生长良好的第三代BMSCs进行分组培养。空白组:完全培养基培养;对照组:完全培养基中加入成骨诱导剂;实验组:完全培养基中加入成骨诱导剂及VEGF(10ng/ml)。MTT法检测诱导BMSCs成骨分化过程中细胞生长与增殖情况并绘制生长曲线;倒置相差显微镜、光学显微镜及扫描电镜观察诱导BMSCs成骨分化过程细胞的形态特征;茜素红(Alizarin Red S,ARS)染色鉴定钙结节;碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、ALP活性及RT-PCR检测I型胶原(Collagen typeⅠ,colⅠ)mRNA表达;免疫组化染色检测诱导后细胞中VEGF蛋白表达情况。结果 1诱导BMSCs向成骨细胞分化后细胞呈圆形或多边型,短柱状或立方形,细胞表面有短的突起与相邻细胞连接。2茜素红染色光学显微镜下可见实验组和对照组均有散在的红色团块即钙结节。3二组中ALP染色均可见细胞浆内有黑色的碱性磷酸酶颗粒,但实验组ALP染色阳性细胞数多于对照组(P<0.05)。4诱导培养的成骨细胞ALP活性测定实验组和对照组ALP活性早期较低,以后逐渐增高,第四天起,实验组明显高于对照组(P<0.05)。5MTT法检测细胞增殖状态,实验组细胞增殖速度高于对照组,6~8d细胞增殖速度加快,二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。6RT-PCR检测成骨细胞colⅠmRNA表达,诱导后实验组和对照组均可见colⅠmRNA表达,实验组colⅠmRNA的表达强度高于对照组。7免疫组化染色显示BMSCs的VEGF蛋白呈阴性表达,而诱导分化后的成骨细胞实验组与对照组均可见有VEGF蛋白表达且实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1BMSCs在成骨诱导剂作用下可向成骨细胞诱导,成为骨组织工程中理想的种子细胞。2 VEGF可促进成骨细胞的增殖和分化,当与成骨细胞诱导剂联合应用时,能够提高成骨细胞的增殖能力、增强成骨细胞的ALP活性,二者的协同作用共同促进了BMSCs向成骨细胞的增殖和分化,将有望提高骨缺损修复的治疗效果。     

血管内皮生长因子及其受体在舌癌细胞中表达及意义

【目的】探讨人舌癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR、Flt-1的表达,进一步认识VEGF在舌癌生长过程中的作用机制。【方法】以人脐静脉血管内皮细胞ECV304和小鼠成纤维细胞系L929作为对照,应用免疫组化染色和RT-PCR方法,检测体外培养的人舌癌细胞系Tca8113、GNM中VEGF及其受体的表达。【结果】GNM、Tca8113中皆有VEGF表达,Tca8113表达KDR和FLT-1,GNM表达KDR。【结论】在舌癌的生长过程中可能存在VEGF的自分泌机制。     

阿托伐他汀对血管内皮细胞增殖过程中FKBP12基因表达的影响

目的探讨不同浓度阿托伐他汀对血管内皮细胞（VEC）增殖过程中FK506结合蛋白12（FKBP12）表达的影响。方法培养大鼠VEC并传代,检测Ⅷ因子相关抗原。观察其不同浓度阿托伐他汀作用下的VEC增殖情况和不同时期FKBP12 mRNA水平的表达。结果阿托伐他汀抑制大鼠血管内皮细胞的增殖过程,抑制血管内皮细胞增殖过程中FKBP12的表达,该作用呈时间依赖性和剂量依赖性;在阿托伐他汀作用下,大鼠血管内皮细胞数随浓度的增加和作用时间的延长呈相对减少趋势。结论阿托伐他汀抑制血管内皮细胞的增殖过程,抑制血管内皮细胞增殖过程中FKBP12的表达,且呈时间-剂量依赖性。     

血瘀证兔血清对培养的血管内皮细胞活性因子基因表达的影响

【目的】探索血瘀证形成和发展过程中血管内皮细胞活性因子内皮素和一氧化氮 (NO)改变的分子机理。【方法】用半定量RT -PCR方法 ,观察血瘀证兔模型血清对体外培养的血管内皮细胞内皮素 (ET)和组成型NO合成酶 (constitutivenitricoxidesynthase ,cNOS)基因表达的影响。【结果】血瘀证动物模型血清导致体外培养的内皮细胞中ET - 1mRNA表达升高 (P <0 .0 1) ,cNOSmRNA表达下降 (P <0 .0 1) ,两者呈显著负相关 (r=- 0 .857,P <0 .0 1)。【结论】血管内皮细胞中ET基因高表达及cNOS基因低表达导致的二者平衡失调在血瘀证形成和发展过程中起着重要作用。     

人血管内皮生长因子（VEGF165）在大肠杆菌中的表达及鉴定

【目的】克隆人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。【方法】用PCR技术，从人心脏cDNA库中扩增VEGF165 cDNA，并定向克隆入原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165 Western—blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖的特性，用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。【结果】从人心脏cDNA库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的VEGF165 cDNA长576bp，编码191个氨基酸残基，序列与献报道一致。SDS-PAGE电泳显示，经IPTG诱导，高效表达出25ku的rVEGF165，主要存在于包涵体中，约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示，复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静脉血管内皮细胞增殖。【结论】克隆、测定了人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。     

血管内皮生长因子及其受体在舌癌细胞中表达及意义

【目的】探讨人舌癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR、Flt-1的表达，进一步认识VEGF在舌癌生长过程中的作用机制。【方法】 以人脐静脉血管内皮细胞ECV304和小鼠成纤维细胞系L929作为对照，应用免疫组化染色和RT-PCR方法，检测体外培养的人舌癌细胞系Tca8ll3、GNM中VEGF及其受体的表达。【结果】GNM、Tca8113中皆有VEGF表达，Tca8113表达KDR和FLT-1,GNM表达KDR。【结论】在舌癌的生长过程中可能存在VEGF的自分泌机制。     

凉血通瘀方对血管内皮细胞增殖、分泌及相关信号通路蛋白表达的影响

目的通过研究凉血通瘀方对血管内皮细胞(VEC)增殖、分泌及相关信号通路蛋白表达的影响,探讨其治疗出血性中风的作用机理。方法体外培养血管内皮细胞,1mmol/L过氧化氢(H_2O_2)造成血管内皮细胞氧化损伤模型;MTT法检测细胞增殖活性,倒置显微镜观察细胞形态,Hochst法观察细胞凋亡,化学法检测细胞上清NO、TNOS和iNOS的表达,Western blot法检测细胞NF-κB、P53、caspase-3和P21蛋白的表达。结果与H_2O_2模型组相比较,高、中、低剂量组的凉血通瘀方能明显提高VEC的增殖活力,显著增加细胞上清液中NO、TNOS和iNOS的表达水平;中剂量组凉血通瘀方能改善细胞形态,减少细胞凋亡,降低NF-κB、P53、caspase-3和P21蛋白的表达。结论凉血通瘀方通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高细胞NO的分泌和TNOS、iNOS的活性,降低NF-κB、P53、caspase-3和P21信号通路蛋白的表达,从而保护血管内皮细胞是凉血通瘀方治疗出血性中风的作用机理。     

骨宝含药血清对成骨细胞碱性磷酸酶活性及护骨素mRNA表达的影响

目的：观察骨宝含药血清对SD大鼠成骨细胞（OB）中护骨素（OPG）mRNA表达的影响。方法：①将20只10月龄SD雌性大鼠随机分为2组,每组10只,分别为骨宝组和生理盐水对照组,制备含药血清和空白血清,MTT法确定最佳添加剂量;②取1d龄SD大鼠颅骨分离培养OB,分为骨宝含药血清组和对照组,磷酸对硝基苯酯法（PNPP法）检测OB碱性磷酸酶（ALP）活性,荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）检测OB中OPG mRNA的表达。结果：①15%浓度的骨宝含药血清对OB的增殖具有明显的促进作用（P〈0.05）;②骨宝含药血清组中OB的ALP活性2.527±0.185高于对照组1.839±0.040（P〈0.05）,骨宝含药血清组中OB的OPG mRNA表达量1.457±0.031高于对照组0.852±0.090（P〈0.05）。结论：骨宝含药血清能上调OB中OPGmRNA的表达,增强OB的ALP活性,可能是骨宝防治骨质疏松症的作用机制之一。     

镉对体外培养成骨细胞增殖、凋亡、分化及矿化的影响

目的探讨镉对体外培养成骨细胞（osteoblast,OB）增殖、凋亡、分化及矿化的影响。方法用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养;成骨细胞与不同浓度的Cd2＋作用后,MTT法测定细胞增殖;AO/EB双染法进行凋亡形态学观察;PNPP法检测碱性磷酸酶活性;矿化结节计数和面积测量分析镉对成骨细胞矿化能力的影响。结果各剂量组氯化镉均可抑制成骨细胞增殖,其中2.0μmol/L以上剂量组与对照组相比差异有统计学显著意义（P〈0.01）;16.0μmol/L、32.0μmol/L剂量组OB可见较多凋亡细胞;各时点、各剂量组氯化镉均能抑制ALP活性,尤其是48h以上影响作用更明显（P〈0.01）;0.5μmol/L、1.0μmol/L浓度的氯化镉可明显抑制成骨细胞矿化能力。结论镉离子可以抑制成骨细胞增殖、分化及矿化能力,促进成骨细胞凋亡,对成骨细胞的骨形成能力有明显抑制作用。     

成骨细胞与血管内皮细胞直接混合培养的体外实验研究

目的　通过观察不同比例和不同时间成骨细胞和血管内皮细胞直接混合培养时细胞增殖和功能的变化 ,选择适宜的两种细胞直接混合培养比例及时间 ,为骨组织工程血管化研究提供理论基础。方法　取兔骨膜成骨细胞 (RPOB)和肾血管内皮细胞 (RRVEC) ,以成骨和内皮细胞数目比 1∶2 ,1∶1和 2∶1直接混合培养 4 ,8,12d ,通过细胞计数、碱性磷酸酶 (ALP)活性测定及　3 H -脯氨酸掺入试验观察细胞增殖分化能力及功能状态。结果　 2∶1组细胞 4d增殖最活跃 (P <0 .0 5 ) ,8d和 12d细胞增殖减慢。ALP活性和　3 H -脯氨酸掺入呈时间依赖性增长 ,其中共培养 12dALP活性组间无差异 ,但　3 H -脯氨酸掺入较高 ,与其他各组差异显著 (P <0 .0 5 )。结论　成骨细胞和血管内皮细胞 2∶1直接混合培养 12d ,功能活跃 ,适宜组织工程研究。     

当归补血汤对内皮细胞增殖和粘附分子表达的影响

目的　了解当归补血汤对内皮细胞增殖及分泌粘附分子 (ICAM- 1)的影响 ,探讨当归补血汤对造血调控的机理。方法　建立人脐静脉内皮细胞体外培养模型 ,将 HU VEC与当归补血汤不同剂量 (0、4、40、40 0和40 0 0 μg/ m l)一起培养 ,以流式细胞分析术测定内皮细胞增殖周期 ,同时对粘附分子进行测定。结果　当归补血汤能够促进内皮细胞分泌粘附分子 ,对照组 CD5 4(ICAM- 1)仅有少量表达 ,而实验组 CD5 4(ICAM- 1)表达明显较对照组增多 (P<0 .0 5 )。细胞周期分析结果表明 ,实验组与对照组相比 ,有更多的细胞处于 S期 (P<0 .0 5 )。提示当归补血汤能够促进细胞由静止期进入增殖期。结论　当归补血汤能够促进内皮细胞的增殖以及细胞粘附分子的表达。     

ZNF580过表达对内皮细胞血管内皮生长因子的表达及增殖能力的影响

【目的】研究人锌指蛋白新基因ZNF580过表达对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及增殖能力的变化,为探讨ZNF580基因功能提供科学依据。【方法】重组质粒pEGFP-ZNF580经LipofectamineTM2000脂质体转染法转染EA.hy926细胞,48h后荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在内皮细胞中的表达情况;应用半定量RT-PCR、Western blotting及ELISE法检测转染前后内皮细胞ZNF580和VEGFmRNA、蛋白表达的变化;运用MTT实验检测转染前后内皮细胞增殖能力的改变。【结果】荧光显微镜下示融合蛋白ZNF580-EGFP在EA.hy926细胞核中表达;ZNF580基因过表达后,内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05),且其增殖能力显著升高(P<0.01)。【结论】ZNF580可以调控EA.hy926细胞VEGF的表达,且ZNF580在内皮细胞增殖过程中具有重要的调节作用。     

蜂胶黄酮对大鼠颅骨成骨细胞增殖分化及BMP2表达的影响

目的 探讨蜂胶黄酮对体外培养大鼠颅骨成骨细胞增殖分化以及骨形态发生蛋白2(BMP2)表达的影响.方法 提取新生大鼠颅骨成骨细胞制作体外培养模型,用不同浓度的蜂胶黄酮刺激分离培养的大鼠成骨细胞,然后用噻唑蓝(MTT)法测定蜂胶黄酮对体外培养成骨细胞的增殖作用,用氨基安替吡啉测酚法测成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,并通过免疫组织化学方法 观察成骨细胞BMP2的表达.结果 添加蜂胶黄酮体外培养24 h后,100μg/L剂量组较对照组有明显的提高;48 h后,5、10和100μg/L剂量组与对照组比,增殖率均显著提高;添加蜂胶黄酮的中剂量组和高剂量组的BMP2表达在24 h和48 h都显著高于零剂量组.培养72 h后,10、50和100μg/L剂量组与对照组比,增殖率均有明显的提高;50μg/L和100μg/L剂量组与对照组相比ALP活性均显著性提高.结论 蜂胶黄酮可以增加成骨细胞的增殖和分化,促进骨组织的形成,可用来预防骨质疏松症.