幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)DNA疫苗。方法 扩增全长napA(编码HP-NAP)，将其与克隆载体pBT连接，经测序及同源性分析后，将相应片段亚克隆入真核表达载体pIRES，经双酶切及PCR鉴定。结果 PCR扩增-435bp产物，核苷酸序列测定及BLAST分析表明，所克隆序列与基因库中Hp悉尼株(SS1)napA核苷酸及蛋白质的同源性均为98％。ANTHEPROT软件预测其蛋白质具有良好的疏水性和抗原性。经PCR及双酶切鉴定，证实成功构建携带，napA的重组真核表达质粒plRES-napA。结论 成功构建并鉴定了HP-NAP重组DNA疫苗，为进一步研究其免疫原性及研制口服DNA疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白抗体水平与胃癌的相关性

目的 探讨幽门螺杆菌(HP)中性粒细胞激活蛋白(NAP)抗体水平与胃癌的相关性.方法 应用ELISA方法,对正常人和HP感染患者外周血中的NAP抗体水平进行检测,并用PCR方法检测HP临床菌株中nap基因存在状况.结果 所有检测的HP临床菌株中都存在napA基因;正常人血清中NAP抗体阳性率为42.6%;胃癌患者血清HP-NAP抗体阳性率为97.5%,明显高于胃溃疡患者92.9%和慢性胃炎患者85.7%的抗体阳性率;胃癌患者NAP抗体水平明显高于胃炎患者,但与胃溃疡患者无明显差异;NAP抗体水平与患者年龄无明显相关性.结论 NAP抗体水平与胃癌有一定相关性,提示NAP蛋白可能有致胃癌的作用.本研究为HP相关性胃癌的致病机制、诊断和疫苗研究提供基础.     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.     

幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因napA克隆及序列分析

目的：从幽门螺杆菌(H．pylori)中克隆中性白细胞激活蛋白基因napA并构建重组载体。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-HP27基因组DNA作模板;根据H．pylori J99全基因组序列设计napA PCR引物,高保真酶扩增napA片断;限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒,T4 DNA酶连接酶切产物,重组质粒转化E．coli TBIT程菌,蓝白斑试验筛选阳性克隆;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物学软件进行序列分析。结果：DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB-napA的EcoR I和Sal I位点之间切出一个435bp的DNA片断,测序结果与J99 napA同源性为96．5％,与H．pylori其他菌株的同源性为92％～97％。结论：成功构建H．pylori中性白细胞激活蛋白基因的重组质粒pNEB-napA;序列分析表明HP-napA是一类高度保守的原核型基因,可作为H．pylori疫苗候选基因。     

幽门螺杆菌UreB核酸疫苗的构建

目的:构建含幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)基因的核酸疫苗.方法:抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用PCR技术从基因组DNA扩增UreB基因,克隆入PUCmT载体,检测UreB基因序列.经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定.通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-UreB转染COS-7细胞,Western印迹分析检测pIRES-UreB表达UreB蛋白的免疫原性.结果:扩增出长约1 700 bp的UreB基因,与基因库Hp UreB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实成功构建了含UreB基因的Hp核酸疫苗pIRES-UreB,并且Western 印迹分析检测到特异性的蛋白条带.结论:构建了具有免疫反应性UreB基因的Hp核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础.     

幽门螺杆菌疫苗的研究进展

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, HP）是引起胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡乃至胃癌的主要致病菌。近年来,HP感染呈上升趋势,有效疫苗的研制是根除HP的最简单、经济、快捷的手段。随着疫苗研究的深入,诸如灭活全菌疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、DNA疫苗及缓释疫苗等相继问世,其优、缺点也比较明显。本文对以上几种疫苗的研究进展作一综述。     

表达幽门螺杆菌过氧化氢酶的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其免疫保护作用的观察

目的 探讨表达幽门螺杆菌（Hp)过氧化氢酶（KatA)的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株在防御Hp感染中的作用。方法 构建表达KatA的重组质粒,用IPTG进行诱导表达,再将其转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261株中构建成口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,并以Hp翻尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和Hp定量培养对胃粘膜中的Hp进行检测。结果 SDS-PAGE凝胶电泳上显示一条相对分子质量约79000的新生蛋白带,占细菌总蛋白的19%,并能与抗谷胱甘肽-s-转移酶（GST）抗体发生特异性反应,动物实验结果显示;免疫小鼠能有效防御Hp的感染,结论 表达KatA的减毒沙门氏菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用。     

亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinantmaltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP)。用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验。方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性;直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度;蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度。结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57 kD,与预期结果一致;亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5%,浓度可达0.625 g/L。结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP。     

幽门螺杆菌阳性的十二指肠球部溃疡出血患者根除治疗对再出血的影响

目的探讨幽门螺杆菌（Hp）阳性的十二指肠球部溃疡（DU）出血患者根除Hp治疗与否对DU出血复发的影响。方法96例Hp阳性DU出血患者，随机分为治疗组（40例）与对照组（56例）。治疗组口服奥美拉唑20m（d＋丽珠胃三联1盒／d，共7d；对照组仅口服奥美拉唑20mg/d，共28d。治疗结束后1月复查内镜及Hp。随访2年。结果治疗组Hp阴转率95．0％（38／40），对照组35．7％（20／56），2组比较差异有统计学意义（χ^2=8．228，P〈0．01）；治疗组溃疡愈合率100．0％（40／40），对照组94．6％（53／56），2组比较差异无统计学意义（χ^2=0．035，P〉0．05）；2年内随访，治疗组再出血率5．0％（2／40），对照组32．1％（18／56），2组比较差异有统计学意义（χ^2=7．186，P〈0．01）。结论对Hp阳性的DU出血患者，Hp根除治疗后可有效预防再出血。     

幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒的构建及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌hpaA基因,并构建其真核表达质粒。方法　以HpNCTC11637基因组DNA为模板, PCR扩增hpaA基因,亚克隆至pMD18 T载体中,目的基因经酶切纯化后插入pTCAE,转化E.coliDH5α,酶切并测序鉴定正 确的重组质粒命名为pT hpaA。电穿孔法将pT hpaA转染CHO细胞,Westernblot检测HpaA蛋白的表达。结果　克隆重组 得到pT hpaA,将pT hpaA电穿孔法转染CHO后,培养上清经Westernblot检测,在相对分子量为30000条带处出现特异性抗 原抗体反应。结论　成功构建了幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒,体外CHO细胞转染和Westernblot实验证实了HpaA蛋 白的表达,为进一步的免疫实验奠定了基础。     

双亚型(H5/H7)流感病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性检测

目的：构建双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法： 构建共表达流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA的DNA疫苗,采用间接免疫荧光法(IFA)检测目的蛋白在幼仓鼠肾细胞(BHK cell)中的表达。分为pVAX1-H5-H7、pVAX1-H5、pVAX1-H7和pVAX1空质粒对照组4组（每组15只）进行小鼠免疫实验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,流式细胞术检测小鼠脾T淋巴细胞亚群数量。结果：所构建的双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗在BHK细胞中的表达产物可激发荧光抗体产生绿色免疫荧光,且对照pVAX1空载体转染BHK细胞无免疫荧光产生。使用双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗免疫小鼠后,小鼠产生了针对H5和H7抗原的血清特异性抗体,流式细胞术检测免疫组小鼠脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量显著高于对照组（P<0.05）。结论： 成功构建的双亚型（H5/H7）流感病毒 DNA疫苗可以诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

消化性溃疡患者焦虑抑郁与幽门螺杆菌的关系

目的探讨消化性溃疡患者焦虑抑郁情绪发生与幽门螺杆菌的关系。方法采用焦虑抑郁量表对537例幽门螺杆菌阳性的消化性溃疡患者和200例幽门螺杆菌阴性的正常人进行心理状况调查,消化性溃疡患者根除幽门螺杆菌前后自身比较。结果幽门螺杆菌阳性的消化性溃疡患者中,焦虑症状检出率为48.7%,抑郁症状检出率为35.7%。消化性溃疡患者根除幽门螺杆菌前后焦虑抑郁自身对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论消化性溃疡患者焦虑抑郁症状者显著高于正常人,根除幽门螺杆菌后其焦虑抑郁明显减轻。     

钩端螺旋体DNA疫苗pcD-flaB的构建及其免疫机制的初步研究

观察钩端螺旋本ＤＮＡ疫苗的保护效果,并探讨疫苗的免疫机制。方法：应用定向克隆的方法构建ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ,肌肉途径免疫豚鼠,观察豚鼠攻击感染钩体后保护率,以ＥＬＩＳＡ法检测特异性抗体ＩｇＧ工观察疫苗对豚鼠腹腔巨噬细胞分泌的ＴＮＦ活性的影响。结果该疫苗对同型钩体的保护率为１００％,特异性抗体水平在疫苗注射第６周达到高峰,ＴＮＦ的活性明显增高。结论：ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ对同型钩体感染有较