内质网应激关键因子PREK在应力加载下成肌细胞凋亡中的作用及机制

目的 研究周期性张应力对L6大鼠成肌细胞凋亡的影响,探讨蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)在这一过程中的作用及机制。方法 构建L6细胞力学刺激模型,加载参数为细胞拉伸形变率15%,频率10个循环/min,每循环包括3 s拉伸及3 s舒张,加力时间为2、6、12、24 h,以不加力组为对照组。应用DAPI染色观察各组细胞凋亡情况;应用实时荧光定量PCR检测各组PERK、CHOP mRNA的表达;应用Western免疫印迹检测各组PERK、p-PERK的表达变化。加入PERK抑制剂后重复实验,检测各组细胞凋亡情况,PERK、CHOP mRNA 的表达变化及p-PERK的蛋白表达变化。采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。结果 DAPI染色显示,L6大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生凋亡,24 h时达到凋亡最大值。PERK被抑制后,加力组的细胞凋亡程度与对照组无显著差别。RT-PCR 结果显示,随着加力时间的延长,CHOP mRNA 的表达逐渐增加;PERK mRNA 表达无差异。Western免疫印迹结果显示,p-PERK蛋白表达水平随加力时间延长而逐渐升高,总蛋白PERK的表达无明显变化;加入PERK抑制剂后,CHOP的mRNA表达与对照组无显著差异,p-PERK蛋白表达与对照组无显著差异。结论 内质网应激关键因子PERK参与了周期性应力条件下的成肌细胞凋亡,其作用机制可能与PERK磷酸化有关。     

内质网应激分子在慢性氟中毒大鼠成釉细胞中的表达

目的 研究不同浓度的氟化物对大鼠成釉细胞内质网应激分子表达的作用,探讨氟牙症形成的机制.方法 选择30只Wistar大鼠,随机分成A、B、C3组,并分别饮用氟浓度为0、75、150mg/L的自来水,8周后处死动物,并制备下颌切牙切片,通过HE染色、免疫组化、透射电镜、TUNEL检测等实验方法,观察3组大鼠成釉细胞内质网应激分子的表达及细胞凋亡情况.结果 随着氟浓度的升高,内质网应激分子GRP78 A组为阳性表达,B、C组为强阳性表达（F=27.42,P＜0.05）;XBP-1 A组为弱阳性表达,B组为阳性表达,C组为强阳性表达（F=139.7,P＜0.05）;Caspase-12 A组为弱阳性表达,B组为阳性表达,C组为强阳性表达（F=43.91,P＜0.05）;CHOP A组为阴性表达,B组为阳性表达,C组为强阳性表达（F=19.61,P＜0.05）;TUNEL检测显示氟浓度为150mg/L组成釉细胞凋亡数量显著高于75mg/L组和自来水组（F=124.02,P＜0.05）.利用MetaMorph显微图像分析软件对结果进行分析,用spss13.0软件包进行统计处理.结论 大鼠饮用高浓度的氟化水可激活内质网应激分子,导致成釉细胞产生内质网应激,并最终诱导细胞发生凋亡.     

软骨细胞中内质网应激信号通路的研究进展

内外环境多种刺激均可导致内质网中未折叠蛋白的积聚,引起细胞内的应激反应,改变细胞的功能和存活状态,这个过程称为内质网应激（ERS）。软骨细胞是关节软骨内唯一的细胞成分,低糖性损伤、白细胞介素-1β和一氧化氮以及一些药物均能使其发生ERS。ERS可引发蛋白激酶R样内质网调节激酶（PERK）、肌醇需酶（IRE）1和活化转录因子（ATF）6三条主要的信号通路构成未折叠的蛋白反应（UPR）。UPR中多种信号分子对软骨细胞的生长、程序性死亡以及软骨的炎症都有重要的影响,本文就ERS信号通路机制、PERK信号通路、IRE1信号通路和ATF6信号通路等研究进展作一综述。     

氟对大鼠切牙成釉细胞内质网伴侣分子表达的影响

目的：研究不同浓度氟化物对大鼠切牙成釉细胞的影响,探讨内质网应激在氟斑牙形成中的作用。方法：30只Wistar大鼠随机分为3组,建立氟斑牙动物模型。观察大鼠切牙成釉细胞的形态学和GRP78、XBP-1、CRT和caspase-12表达的改变,采用MetaMorph显微图像分析软件和SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：随着饮水氟离子浓度的升高,切牙逐渐出现氟斑牙症状。免疫组化结果显示,CRT(F=11.72,P<0.05)、GRP78(F=27.42,P<0.05)、XBP-1(F=139.7,P<0.05)、caspase-12(F=43.91,P<0.05)表达随氟离子浓度的升高而升高,且各组间均具有显著性差异。结论：成釉细胞在一定浓度的氟化物作用下,其CRT、GRP78、XBP-1和caspase-12 均过表达,表明成釉细胞处于内质网应激状态,且caspase-12是导致细胞凋亡的重要途径。     

异常咬合对小鼠髁突软骨细胞内质网应激性凋亡的影响研究

目的探讨异常咬合对小鼠髁突软骨细胞内质网应激性凋亡的影响。方法选取6周龄雌性C57BL/6J小鼠54只,随机分为4组,分别饲养1、3、7、11周,其中饲养1、3、7周的小鼠(各12只)再随机分为对照组和单侧前牙反(unilateral anterior crossbite,UAC)组,饲养11周的小鼠(18只)再随机分为对照组、UAC组和去冠组(UAC刺激7周后去除UAC刺激继续饲养至11周),每组小鼠均为6只。各组小鼠处死取材后对髁突软骨进行HE染色、糖相关蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12,Caspase12)免疫组织化学染色以及TUNEL染色。结果(1)HE染色结果显示:各饲养期对照组小鼠髁突软骨细胞层次鲜明,软骨内细胞排列整齐;UAC组小鼠髁突软骨内软骨细胞数目减少,排列紊乱,随着时间延长这些变化逐渐加重。与同饲养期对照组相比,UAC组小鼠髁突软骨细胞密度、软骨厚度均显著减小(均P<0.05);去冠组小鼠髁突软骨细胞分层情况明显改善,软骨细胞密度、软骨厚度较UAC组有显著增加(均P<0.05),而与同饲养期对照组相比,差异无统计学意义(均P>0.05)。(2)免疫组织化学染色、TUNEL染色结果显示:各饲养期对照组小鼠髁突软骨中GRP78阳性细胞在软骨浅层和深层均有分布,Caspase12阳性细胞主要分布在软骨深层,但数量均很少;UAC组小鼠髁突软骨中出现大量GRP78和Caspase12阳性细胞。UAC组小鼠髁突软骨GRP78、Caspase12和TUNEL阳性细胞率均高于同饲养期对照组(均P<0.05);去冠组小鼠髁突软骨GRP78、Caspase12和TUNEL阳性细胞率均显著低于UAC组(均P<0.05),而与同饲养期对照组相比,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论异常咬合促进髁突软骨细胞内质网应激性凋亡,从而加重髁突软骨的退行性变。     

内质网应激在牙周炎影响全身疾病过程 中的作用

牙周炎是发生在牙周组织的慢性感染性疾病,其发病机制及对全身系统疾病的影响一直是学术界关注的热点问题。许多学者认为,牙周炎不仅是一种常见的口腔疾病,更是全身疾病的潜在危险因素之一,但是目前关于牙周炎诱发全身系统疾病的具体机制尚不明确,可能与牙周致病菌、炎症因子及内质网应激等有关。近年来的研究发现,内质网应激是介导细胞凋亡的重要通路之一,并且与全身疾病密切相关。有研究显示,内质网应激在牙周炎诱导全身疾病过程中存在调控作用,但是目前关于内质网应激在牙周炎影响全身疾病过程中的作用研究较少,需要进一步探索。本文就内质网应激在牙周炎影响全身系统疾病中的研究进展进行综述,旨在探究牙周炎和全身系统疾病的内在联系,以期为牙周炎与其相关全身系统疾病的防治提供新的思路。     

体外周期性单轴压应力下髁突软骨细胞Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的动态变化研究

目的:探讨体外周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞的Raf激酶抑制蛋白(RKIP)及其mRNA变化的早期影响,以助于阐明力学引起细胞应答反应的分子机制。方法:利用四点弯曲细胞力学加载仪对第3代大鼠髁突软骨细胞进行体外周期性单轴压应力加载,力值为4000μstrain,时间为0、15、30、60、120、240min。采用实时荧光定量PCR技术和Western blot免疫印迹技术研究大鼠髁突软骨细胞在周期性单轴压应力作用下RKIP及其mRNA变化。结果:大鼠髁突软骨细胞RKIP mRNA和蛋白表达呈现几乎相反的趋势。RKIP mRNA的表达于30min上升(P<0.001),60min达到高峰后迅速回落,低于细胞的正常基态水平;而RKIP的蛋白表达30min开始下调(P<0.001),持续至120、240min时回升。结论:RKIP在髁突软骨细胞的早期力学应答机制中可能扮演着相当重要的作用,其蛋白和mRNA水平表达变化不同,转录水平的调控最终要影响蛋白水平的表达。     

不同静压力对新生SD大鼠髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨不同静压力对髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法：对培养到第3代新生SD大鼠髁突软骨细胞加载0、12、24、36kPa静压力1h后立即收集样本，用流式细胞仪检测细胞凋亡与增殖指数的变化。结果：随着压力的增加（0、12、24、36kPa），除24kPa外，细胞增殖指数和凋亡指数在加力结束时（0h）均减少（P〈0．05），其中，细胞增殖指数在36kPa加力结束时减幅最大，细胞凋亡指数则在12kPa加力结束时减幅最大。结论：在0、12、24、36kPa力值范围内，软骨细胞增殖、凋亡与应力值存在一定的关系，但这并非是简单的线性关系。     

氟对大鼠成釉细胞GRP-78和caspase-12表达的影响

目的研究GRP-78和caspase-12在氟致大鼠成釉细胞内质网应激和细胞凋亡中的作用,探讨氟所介导的内质网应激是否导致细胞凋亡。方法应用CCK8和流式细胞术观察不同浓度的氟对成釉细胞活性及凋亡数量的影响,以实时定量PCR和Western印迹法检测氟对内质网伴侣分子GRP-78和caspase-12基因和蛋白表达的影响,应用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果随着氟浓度的不断增加,大鼠成釉细胞活性呈逐渐下降趋势,流式细胞术同样显示发生凋亡的细胞数量逐渐上升;实时定量RT-PCR和Western印迹结果显示,GRP-78和caspase-12的表达量随着氟浓度增加而增加。结论过量氟介导了大鼠成釉细胞内质网应激,并且通过内质网应激,引起细胞凋亡。     

体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的分离、体外培养以及差异蛋白质组学观察

目的：观察体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的生物学活性和蛋白质表达谱。方法：对大鼠进行III类矫形力应力加载2周,观察髁状突大体形态和组织形态学;体外培养实验鼠和对照鼠软骨细胞,计数细胞收获数和细胞存活率,检测总蛋白质组学水平上差异。结果：压力刺激后的大鼠髁突软骨明显变薄,表面无光泽,缺乏弹性,重量降低（P＜0．01）;力学刺激后髁突软骨细胞收获率和存活率均下降（P＜0．01）,形态更加狭长;蛋白质组学结果主要为应激蛋白上调,信号转导蛋白活化,细胞骨架蛋白和细胞增殖代谢相关蛋白的下降。结论：经体内力学加载后,体外分离培养的关节软骨细胞形态、生物学活性以及在蛋白质水平均发生了明显的变化。     

缺氧对口腔癌细胞增殖和凋亡的作用

目的检测口腔癌细胞中缺氧情况及缺氧/复氧对口腔癌细胞增殖、凋亡的影响。方法设立对照组和不同时间缺氧/复氧6个实验组,采用细胞培养、缺氧探针、MTT法及流式细胞术等方法检测SCC15口腔癌细胞中缺氧情况及缺氧/复氧对口腔癌细胞增殖、凋亡的影响。结果对照组和实验组SCC15细胞均呈现缺氧状态,随着缺氧时间的延长,活细胞数减少,细胞形态呈现细胞凋亡改变。缺氧12h组、24h组、缺氧12h/复氧2h组、缺氧24h/复氧2h组细胞增殖被显著抑制,随缺氧时间延长,SCC15细胞生长抑制的比例逐渐加大(P0.01)。缺氧对不同实验组SCC15细胞均能促进细胞凋亡。随缺氧时间延长,SCC15细胞发生凋亡的比例逐渐增高。除缺氧4h组外,其它各组与对照组相比,差异具有统计学意义((P0.01)。结论缺氧与口腔癌细胞增殖和凋亡密切相关,缺氧程度影响着口腔癌细胞的生长。     

���Դ���ɹ�ϸ�����������·��ӱ��Ӱ���о�

目的观察不同质量浓度氟化物对大鼠股骨成骨细胞内质网伴侣分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）及半胱天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）表达的影响,探讨内质网应激在氟骨症形成中的可能作用。方法 2012年6月在中国医科大学附属口腔医院中心实验室将48只Wistar大鼠随机分成4组,对照组（A组）饮用常规自来水,染氟组（B、C、D组）分别饮用含氟化钠质量浓度为50、100、150 mg/L的自来水,建立氟中毒动物模型。观察大鼠股骨成骨细胞形态学改变及内质网伴侣分子GRP78及caspase-12表达情况。采用SPSS13.0软件包和Meta Morph显微图像分析软件进行统计学分析。结果实验组大鼠切牙出现不同程度氟牙症表现,其骨组织免疫组化结果显示,GRP78、Caspase-12呈阳性表达,随着氟浓度增加,其阳性表达均增加,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论大鼠股骨成骨细胞在一定质量浓度氟化物作用下,GRP78与Caspase-12均出现过表达,表明在高浓度氟作用下,成骨细胞出现内质网应激,进而导致细胞凋亡。     

Endoplasmic reticulum stress is involved in hydrogen peroxide induced apoptosis in immortalized and malignant human oral keratinocytes

Background: Although hydrogen peroxide may play an important role in the development of cancer, it can be an efficient inducer of apoptosis in cancer cells; the exact mechanism by which this action occurs is not completely understood in oral cancer cells. Method: In this study, the mechanisms by which H₂O₂ inhibited growth and induced apoptosis were differentially investigated using HPV‐immortalized human oral keratinocytes (IHOK) and oral cancer cells (HN4). Results: H₂O₂ treatment sensitively and dose‐dependently induced growth inhibition and typical apoptosis in IHOK and HN4 cells, as demonstrated by a decreased level of cell viability, an increased population of cells in the sub‐G₀/G₁ phase, ladder formation of the genomic DNA, chromatin condensation and accumulation of Annexin V⁺/PI⁺ cells. Furthermore, the expression of Bax, p53 and p21^WAF1/CIP1 increased, whereas the expression of Bcl‐2 decreased in immortalized and malignant keratinocytes that were treated with H₂O₂. In addition, cytochrome‐c from the mitochondria was observed in H₂O₂‐treated IHOK and oral cancer cells, and this was accompanied by the activation of caspase‐3 and ‐9. Additionally, H₂O₂ treatment induced upregulation of CHOP, GRP78 and several representative endoplasmic reticulum (ER) stress‐responsive proteins, including heme oxygenase‐1. Conclusion: Overall, these results suggest that H₂O₂ triggers apoptosis via the mitochondrial and ER stress pathway in IHOK and HN4 cells, and that increasing the cellular levels of H₂O₂ sufficiently may lead to selective killing of oral cancer cells and therefore be therapeutically useful.     

Mechanical stress enhances production of cytokines in human periodontal ligament cells induced by Porphyromonas gingivalis

Objective

We have previously reported that human periodontal ligament (hPDL) cells produced many kinds of cytokines as a result of bacterial stimulation, including stimulation with Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). However, the effects of mechanical stress on cytokine production in hPDL cells stimulated by periodontopathogenic bacteria are not clearly understood. In this study, we investigated the effects of mechanical stress on the production of inflammatory cytokines in hPDL cells induced by stimulation with P. gingivalis.

Methods

The hPDL cells were exposed to various levels of mechanical stress (1, 6, 10 and 50 MPa) and costimulated with mechanical stress and P. gingivalis for 24 h. Cytokine mRNA expressions were determined by RT-PCR. Cytokines in the culture supernatant were assessed by ELISA, and morphologic changes in hPDL cells were observed.

Results

The expressions of interleukin (IL)-6, IL-8 and tumor necrosis factor-α mRNA were observed in hPDL cells after exposure to mechanical stress. Moreover, the production of IL-6 and IL-8 increased significantly after exposure to mechanical stress ranging from 1 to 10 MPa. The amount of IL-8 in the culture supernatants of hPDL cells costimulated with P. gingivalis and mechanical stress was significantly higher than the expected additive amount. The morphology of hPDL cells did not change after exposure to 6 MPa, but these cells were partly detached from the Petri dish after exposure to 50 MPa.

Conclusions

These results suggest that local inflammation of the periodontal ligament may be induced mainly by periodontal bacteria, and mechanical stress may promote local inflammation.