二肽基肽酶-4通过CXCR4/mTOR信号通路介导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S自噬的机制研究

目的 探究二肽基肽酶-4（DPP-4）通过趋化因子受体4（CXCR4）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路介导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S自噬的机制。方法 体外培养小鼠肺泡巨噬细胞MH-S并分组转染。分别设置PBS组（PBS培养MH-S细胞）、LPS组（100 ng/mL LPS诱导24 h）、DPP-4组（DPP-4表达病毒转染）、si-DPP-4组（si-DPP-4病毒载体转染）、DPP-4 + BafA1组（DPP-4表达病毒转染+自噬抑制剂BafA1干预）及si-DPP-4 + BafA1组（si-DPP-4病毒载体转染+自噬抑制剂BafA1干预）。绿色荧光蛋白（GFP）检测转染效率，稳定转染后，酶联免疫吸附试验检测MH-S细胞上清液炎症因子水平，腺病毒检测MH-S细胞自噬流变化，实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞DPP-4、CXCR4、mTOR mRNA的表达，Western blottig检测CXCR4/mTOR通路蛋白的表达。结果 LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α、GFP、RPF、Merge数量，CXCR4 mRNA、mTOR mRNA和CXCR4蛋白、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量高于PBS组（P <0.05）；DPP-4组与LPS组IL-1β、IL-6及TNF-α水平比较，差异无统计学意义（P >0.05）；DPP-4组GFP、RPF、Merge数量，DPP-4 mRNA相对表达量高于LPS组（P <0.05），CXCR4 mRNA、mTOR mRNA、CXCR4蛋白、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量低于LPS组（P <0.05）；si-DPP-4组IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于LPS组（P <0.05），GFP、RPF及MergeMerge数量低于LPS组（P <0.05）；si-DPP-4组和DPP-4 + BafA1组IL-1β、IL-6、TNF-α水平、CXCR4蛋白、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量高于DPP-4组（P <0.05），GFP、RPF及Merge数量低于DPP-4组（P <0.05）；si-DPP-4组DPP-4 mRNA相对表达量低于DPP-4组（P <0.05），CXCR4 mRNA、mTOR mRNA相对表达量高于DPP-4组（P <0.05）；si-DPP-4 + BafA1组IL-1β、IL-6水平、CXCR4 mRNA、mTOR mRNA、CXCR4蛋白、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量高于si-DPP-4组（P <0.05），GFP、RPF、Merge数量低于si-DPP-4组（P <0.05）。结论 DPP-4能够调节小鼠肺巨噬细胞自噬作用，调控炎症反应，其作用机制可能与CXCR4/mTOR通路有关。     

穿心莲内酯靶向Akt信号干预HIV感染T细胞的效率研究

目的 探讨穿心莲内酯靶向Akt信号干预人类免疫缺陷病毒（HIV）感染T细胞的效率。方法 培养Jurkat T细胞,用WST-1试剂检测穿心莲内酯干预对Jurkat T细胞活性的影响。将Jurkat T细胞分为空白对照组、穿心莲内酯组、LY294002组（PI3K抑制剂）及穿心莲内酯联合LY294002组。各组药物分别干预24 h后,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞PI3K、Akt mRNA相对表达量,采用Western blotting检测各组细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量。制备HIV假病毒,用假病毒感染各组细胞,萤光素酶系统检测假病毒感染Jurkat T细胞的效率。结果 WST-1试剂检测结果显示,随着穿心莲内酯浓度增加,Jurkat T细胞活力降低（P <0.05）。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,穿心莲内酯降低Jurkat T细胞PI3K及其下游Akt mRNA相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量（P <0.05）。HIV假病毒感染实验结果显示,穿心莲内酯降低HIV假病毒感染Jurkat T细胞的效率,联合组比单独组的抑制效果更好（P <0.05）。结论 穿心莲内酯可能通过PI3K降低其下游Akt的活化,从而减少HIV假病毒在Jurkat T细胞间的传播及进入细胞的机会,降低其感染Jurkat T细胞的概率。     

达格列净对糖尿病大鼠血管内皮功能及PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响

目的 探究达格列净对糖尿病大鼠血管内皮功能及PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响。方法 将30只SPF级SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、达格列净组，各10只。模型组、达格列净组成功复制糖尿病模型后，达格列净组给予1 mg/（kg·d）达格列净灌胃处理，连续4周；模型组、对照组分别同时间灌胃等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。采用酶联免疫吸附试验检测血清内皮素1（ET-1）、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）水平；苏木精-伊红染色观察大鼠主动脉血管组织病理学变化；Western blotting检测大鼠血管内皮组织PTEN/PI3K/Akt信号通路蛋白的表达。结果 达格列净组大鼠一般情况好于模型组。达格列净组大鼠主动脉病理变化较模型组改善。与对照组比较，模型组、达格列净组大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平升高（P <0.05），但达格列净组大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平低于模型组（P <0.05）。与对照组比较，模型组、达格列净组大鼠血管内皮组织PTEN蛋白相对表达量降低（P <0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量升高（P <0.05）；但达格列净组较模型组大鼠血管内皮组织PTEN蛋白相对表达量升高（P <0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量降低（P <0.05）。结论 达格列净可能通过促进PTEN/PI3K/Akt信号通路活化，改善糖尿病大鼠血管内皮功能损伤，从而防治糖尿病及其并发症的发生。     

瑞芬太尼通过激活PI3K/Akt/eNOS通路减轻肾缺血/再灌注损伤

目的 探讨术中应用瑞芬太尼对肾缺血/再灌注损伤的作用及机制。方法 取雄性C57/BL小鼠50只,随机分为5组：假手术组、缺血/再灌注损伤组（I/R组）、缺血/再灌注损伤+磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002处理组（I/R+LY294002组）、缺血/再灌注损伤+瑞芬太尼处理组（I/R+RF组）、缺血/再灌注损伤+LY294002处理+瑞芬太尼处理组（I/R+RF+LY294002组）,每组10只。各组大鼠分别于手术结束6 h后取静脉血或肾脏组织,采用全自动生化分析仪测定静脉血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）水平,采用蛋白质印迹法检测肾脏组织PI3K/蛋白激酶B（Akt）/内皮型一氧化氮合酶（eNOS）通路相关蛋白的表达,H-E染色观察肾脏组织炎症细胞聚集情况,酶联免疫吸附试验测定肾脏组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10等炎性因子的表达,实时定量PCR测定肾脏组织中抗凋亡因子Bcl2和凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的mRNA表达。结果 与假手术组相比,I/R组小鼠静脉血BUN、SCr水平均升高,肾脏组织中PI3K表达及磷酸化Akt（p-Akt）/Akt、磷酸化eNOS（p-eNOS）/eNOS均降低,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10释放均增加,Bcl2 mRNA表达下降而Caspase-3 mRNA表达增高,差异均有统计学意义（P均<0.05）,并且肾脏组织中炎症细胞聚集增多。给予瑞芬太尼处理后,I/R+RF组BUN、SCr水平较I/R组降低,肾脏组织中PI3K表达及p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS均增高,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10释放均减少,Bcl2 mRNA表达上调、Caspase-3 mRNA表达下调,与I/R组相比差异均有统计学意义（P均<0.05）,炎症细胞募集也减轻。而使用PI3K抑制剂LY294002处理后,I/R+RF+LY294002组BUN、SCr水平升高,肾脏组织中p-eNOS/eNOS降低,IL-1β、L-6释放增加,Caspase-3 mRNA表达上调,与I/R+RF组相比差异均有统计学意义（P均<0.05）,炎症细胞募集也增加。结论 肾缺血/再灌注损伤时,瑞芬太尼通过激活PI3K/Akt/eNOS通路减轻肾脏组织炎症反应和细胞凋亡发挥肾脏保护作用。     

LncRNA UNC5B-AS1对胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响及与microRNA-199的关系

目的 探究长链非编码RNA UNC5B-AS1（LncRNA UNC5B-AS1）对胶质母细胞瘤（GBM）细胞增殖、迁移、侵袭的影响及与microRNA-199（miR-199）的关系。方法 体外培养GBM细胞系U251,分为对照组、空载组、抑制组及过表达组。对照组细胞不做处理;空载组、抑制组、过表达组分别采用空载质粒、si-LncRNA UNC5B-AS1、过表达LncRNA UNC5B-AS1载体转染GBM细胞系U251。qRT-PCR检测LncRNA UNC5B-AS1、miR-199的表达;CCK-8法、划痕实验、Transwell实验分别检测U251细胞增殖、迁移及侵袭能力;双萤光素酶法检测LncRNA UNC5B-AS1与miR-199的靶向作用;Western blotting检测PI3K/Akt通路蛋白的表达。结果 与对照组、空载组比较,抑制组LncRNA UNC5B-AS1降低（P <0.05）,miR-199升高（P <0.05）,过表达组LncRNA UNC5B-AS1升高（P <0.05）,miR-199降低（P <0.05）。与对照组、空载组比较,抑制组细胞活力指数、划痕愈合率、细胞侵袭数、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量降低（P <0.05）,过表达组细胞活力指数、划痕愈合率、细胞侵袭数、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量升高（P <0.05）。双萤光素酶实验结果显示,LncRNA UNC5B-AS1与miR-199-mimics基因上存在结合靶点。结论 LncRNA UNC5B-AS1在GBM细胞中高表达,抑制LncRNA UNC5B-AS1能够抑制GBM细胞的增殖、迁移、侵袭作用,其作用机制可能与靶向调控miR-199和调节PI3K/Akt通路有关。     

GPR30对大鼠椎间盘退行性病变的作用及其机制研究

目的 探讨G蛋白偶联受体30（GPR30）通过Nrf2/ARE信号通路抑制白细胞介素1β（IL-1β）诱导的大鼠椎间盘髓核细胞的凋亡、炎症反应和氧化应激。方法 使用IL-1β处理大鼠椎间盘髓核细胞复制体外椎间盘退变模型,将椎间盘髓核细胞分为空白对照（Control）组、IL-1β组、IL-1β+过表达GPR30阴性对照质粒（oe-NC）组、IL-1β+过表达GPR30质粒（oe-GPR30）组、IL-1β + oe-GPR30+干扰Nrf2表达阴性对照质粒（si-NC）组、IL-1β + oe-GPR30+干扰Nrf2表达质粒（si-Nrf2）组,IL-1β的处理浓度为10 ng/mL。实时荧光定量聚合酶链反应检测GPR30 mRNA表达;Western boltting检测GPR30、抗重组与合成蛋白（Nrf2）和抗醌NADH脱氢酶（NQO1）和抗血红素加氧酶1（HO-1）蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-6水平;使用ELISA法检测活性氧（ROS）、分光光度法检测超氧化物歧化酶（SOD）水平,比色法检测丙二醛（MDA）水平。结果 IL-1β组髓核细胞GRP30 mRNA、蛋白相对表达量较Control组降低（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30组较IL-1β + oe-NC组升高（P <0.05）。IL-1β组髓核细胞核中Nrf2蛋白相对表达量较Control组升高（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30组较IL-1β + oe-NC组升高（P <0.05）。IL-1β组Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量较Control组降低（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30组较IL-1β + oe-NC组升高（P <0.05）。IL-1β组髓核细胞Nrf2蛋白相对表达量较Control组降低（P <0.05）,IL-1β+ oe-GPR30组较IL-1β + oe-NC组升高（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30 + si-Nrf2组较IL-1β + oe-GPR30 + si-NC组降低（P <0.05）。IL-1β组髓核细胞凋亡率较Control组升高（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30组较IL-1β + oe-NC组降低（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30 + si-Nrf2组较IL-1β + oe-GPR30+si-NC组升高（P <0.05）。IL-1β组TNF-α、IL-6水平较Control组升高（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30组较IL-1β + oe-NC组降低（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30 + si-Nrf2组较IL-1β + oe-GPR30 + si-NC组升高（P <0.05）。IL-1β组ROS、MDA水平较Control组升高（P <0.05）,SOD水平较Control组降低（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30组ROS、MDA水平较IL-1β + oe-NC组降低,SOD水平较IL-1β + oe-NC组升高（P <0.05）,IL-1β + oe-GPR30 + si-Nrf2组ROS、MDA水平较IL-1β + oe-GPR30 + si-NC组升高,SOD水平较IL-1β + oe-GPR30 + si-NC组降低（P <0.05）。结论 上调GPR30表达激活Nrf2/ARE信号通路,能抑制IL-1β诱导的髓核细胞凋亡、炎症和氧化应激反应。     

右美托咪定对脓毒症小鼠认知功能及HSP70表达的影响

目的 探讨右美托咪定（Dex）对脓毒症小鼠认知功能及热休克蛋白70（HSP70）表达的影响，为其脑保护机制的研究提供参考。方法 将80只C57BL/6小鼠随机分为对照组（CON组）、单纯Dex组（Dex组）、脓毒血症组（LPS组）和Dex +脓毒血症组（D + L组），每组20只。首先，Dex组和D + L组腹腔注射Dex 25 μg/kg，CON组和LPS组腹腔注射等剂量的生理盐水；30 min后LPS组和D + L组腹腔注射5 mg/kg脂多糖（LPS）复制脓毒血症模型，CON组和Dex组腹腔注射等剂量的生理盐水。采用Morris水迷宫实验评估小鼠学习记忆能力，酶联免疫吸附试验检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平，化学比色法检测海马组织过氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）水平，苏木精-伊红染色观察海马CA1区病理变化，免疫组织化学染色和实时荧光定量聚合酶链反应检测海马HSP70蛋白、mRNA表达。结果 各组小鼠第1、2、3、4、5天逃避潜伏期比较，经重复测量设计的方差分析，结果 ①不同时间点的逃避潜伏期比较，差异有统计学意义（P <0.05）；②各组小鼠的逃避潜伏期比较，差异有统计学意义（P <0.05），LPS组较CON组延长，D + L组较LPS组缩短；③各组小鼠逃避潜伏期变化趋势比较，差异有统计学意义（P <0.05）。各组小鼠游泳速度比较，差异无统计学意义（P >0.05）。LPS组目标象限停留时间短于CON组（P <0.05），D + L组长于LPS组（P <0.05）；LPS组穿越平台次数少于CON组（P <0.05）；D + L组多于LPS组（P <0.05）。LPS组血清TNF-α、IL-1β水平较CON组升高（P <0.05），D + L组较LPS组降低（P <0.05）。LPS组GSH、SOD水平较CON组降低（P <0.05），MDA水平较CON组升高（P <0.05），D + L组GSH、SOD水平较LPS组升高（P <0.05），MDA水平较LPS组下降（P <0.05）。LPS组HSP70蛋白阳性表达率较CON组升高（P <0.05），D + L组较LPS组升高（P <0.05），Dex组与CON组比较，差异无统计学意义（P >0.05）。LPS组HSP70 mRNA相对表达量较CON组升高（P <0.05），D + L组较LPS组升高（P <0.05）；Dex组与CON组比较，差异无统计学意义（P >0.05）。结论 Dex能够降低脓毒症小鼠体内炎症和氧化应激水平，改善认知功能，其机制可能与上调HSP70表达有关。     

基于microRNA-92a-3p靶向SIRT1调控氧糖剥夺再灌注诱导脑微血管内皮细胞炎症反应的作用机制研究

目的 探讨基于microRNA-92a-3p（miR-92a-3p）靶向调控SIRT1氧糖剥夺再灌注（OGD/R）诱导小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）炎症反应的作用机制。方法 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定miR-92a-3p、SIRT1、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）mRNA的表达；Western blotting明确SIRT1、核转录因子-κB（NF-κB）p65、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）p65、TNF-α和IL-1β蛋白的表达；双荧光素酶报告基因验证miR-92a-3p与SIRT1靶向关系；划痕实验检测bEnd.3细胞的迁移能力。结果 OGD/R组miR-92a-3p相对表达量较对照组升高（P <0.05）。M_SIRT1 WT+mimics+TK组荧光素酶活性较M_SIRT1 WT+mimics NC+TK组低（P <0.05）。OGD/R组SIRT1蛋白和mRNA相对表达量较对照组降低（P <0.05），OGD+92a抑制剂组较OGD+92a抑制剂内参组升高（P <0.05）。miR-92a-3p模拟物组NF-κBp65/p-NF-κBp65蛋白较模拟物内参组高，SIRT1蛋白和mRNA表达较模拟物内参组低（P <0.05）。miR-92a-3p模拟物组IL-1β、TNF-α蛋白和mRNA相对表达量较模拟物内参组高（P <0.05）。miR-92a-3p模拟物组伤口愈合率较模拟物内参组低（P <0.05）。结论 miR-92a-3p通过靶向抑制SIRT1表达，促进OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞炎症反应。     

乌灵胶囊对卒中后抑郁大鼠海马P13K/Akt/mTOR通路和神经递质的影响

目的 探讨乌灵胶囊对卒中后抑郁大鼠海马P13K/Akt/mTOR通路和神经递质影响。方法 选取健康SD大鼠48只,随机分为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组,每组12只。采用改良Zea-Longa法复制大脑中动脉缺血大鼠模型（MCAO模型）,MCAO模型复制成功后皮下注射利血平复制卒中后抑郁模型。对照组和模型组给予等剂量双蒸水灌胃;低剂量组于模型复制成功后第2天给予40 mg乌灵胶囊;高剂量组于模型复制成功后第2天给予80 mg乌灵胶囊,1次/d。各组大鼠灌胃21 d。采用Western blotting检测大鼠海马组织海马组织PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量;高效液相色谱法测定海马组织NE、DA和5-HT含量。结果 模型组、低剂量组和高剂量组大鼠Zea Longa评分高于对照组（P <0.05）,海马组织PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）,海马组织NE、DA和5-HT含量低于对照组（P <0.05）;而低剂量组和高剂量组大鼠Zea Longa评分低于模型组（P <0.05）,海马组织PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量高于模型组（P <0.05）,海马组织NE、DA和5-HT含量高于模型组（P <0.05）。结论 乌灵胶囊可改善卒中后抑郁大鼠行为,且可调节海马P13K/Akt/mTOR通路,调节神经递质水平。     

曲美他嗪对重症肺炎大鼠的肺保护作用及其机制研究

目的 观察曲美他嗪（TMZ）对重症肺炎大鼠的肺保护作用，并探讨其可能机制。方法 45只SD雄性大鼠中，取35只大鼠复制重症肺炎模型，死亡5只，30只模型大鼠随机分为重症肺炎（SP）组、TMZ组、TMZ联合磷脂酸（PA）［哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激活剂］组，每组10只；余10只仅注射无菌生理盐水，设为对照组。TMZ组灌胃TMZ生理盐水溶液5 mL，剂量20 mg/kg，尾静脉注射生理盐水1 mL；TMZ联合PA组灌胃TMZ生理盐水溶液5 mL，剂量20 mg/kg，尾静脉注射PA生理盐水溶液1 mL，剂量1 mg/kg；对照组、SP组分别灌胃、尾静脉注射等体积生理盐水。4组大鼠均1次/d，连续干预6 d。检测外周血辅助性T细胞17（Th17）和调节性T细胞（Treg）细胞、肺功能指标、肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素-1β（IL-1β）水平；采用Western blotting检测肺组织蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表达。结果 对照组、SP组、TMZ组、TMZ联合PA组Th17/Treg、BALF中IL-1β水平、肺容积变换量、静息通气量、肺组织p-Akt/Akt比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）；与对照组比较，SP组外周血Th17/Treg、BALF中IL-1β水平、肺组织p-Akt/Akt升高（P <0.05），肺容积变换量、静息通气量减少（P <0.05）；与SP组比较，TMZ组外周血Th17/Treg、BALF中IL-1β水平、肺组织p-Akt/Akt降低（P <0.05），肺容积变换量、静息通气量增加（P <0.05）；与TMZ组比较，TMZ联合PA组外周血Th17/Treg降低（P <0.05），BALF中IL-1β水平、肺组织p-Akt/Akt升高（P <0.05），肺容积变换量、静息通气量减少（P <0.05）。结论 TMZ可改善重症肺炎大鼠肺功能及Th17/Treg平衡，减轻肺部炎症反应及病理变化，其作用可能通过抑制PI3K/Akt信号通路来实现。