多房棘球绦虫elp基因在真核细胞COS7中的表达

目的 构建中国四川株多房棘球绦虫elp基因真核表达载体，为核酸疫苗研究奠定基础。方法 应用RTPCR方法从多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA获得elp基因的编码序列，定向克隆于pGEM-11zf( )。经酶切鉴定及测序后将目的基因亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1( )。重组真核表达载体pcD-ELP鉴定后，纯化无内毒素的重组质粒电穿孔方法转染哺乳动物细胞COS7。RT－PCR，dot-ELISA和免疫组化方法鉴定目的基因在COS7细胞中的表达。结果 琼脂糖凝胶电泳，酶切及序列分析证实多房棘球绦虫elp基因编码区已成功地克隆于真核表达载体pcDNA3.1（＋）。RT－PCR，dot-ELSA和免疫组化证实，重组质粒在哺乳动物细胞（COS7中能够表达多房棘球绦虫ELP抗原。结论 成功地构建了中国四川株多房棘球绦虫elp基因的真核表达载体，该载体在COS7哺乳动物细胞中能表达ELP抗原，为多房棘球绦虫elp基因疫苗研究奠定了基础。     

四川株多房棘球绦虫elp基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的　实现多房棘球绦虫elp基因在原核中的表达 ,为进一步研究多房棘球绦虫ELP抗原的诊断及免疫保护性提供前提条件。方法　应用RT -PCR方法从中国四川株多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA获得elp基因编码序列 ,克隆测序后亚克隆于含有硫氧环蛋白 (Trx)基因的高效原核表达载体pET32a(+)。经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ELP/Trx融合蛋白。SDS -PAGE及Westernblot进行鉴定。亲和层析纯化ELP/Trx融合蛋白 ,用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果　酶切鉴定显示本研究已将elp基因编码序列插入 pET32a(+)的多克隆位点 ,成功地构建了pETrx -ELP融合蛋白原核表达载体。SDS -PAGE及Westernblot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了ELP/Trx融合蛋白。检测 10份包虫病人血清均阳性 ,10份肝吸虫病、10份乙肝病人和 10份健康人血清均为阴性。结论　中国四川株多房棘球绦虫elp基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达 ,初步实验结果显示该融合蛋白对包虫病具有诊断价值。     

多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗诱生免疫应答的实验研究

目的观察多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗免疫BALB/c小鼠引起的体液和细胞免疫应答。方法30只BALB/c小鼠随机分成3组:Ⅰ组,肌注空质粒(pcDNA3.1)100μg/鼠;Ⅱ组,肌注多房棘球绦虫elp基因真核表达重组质粒(pcD-ELP)100μg/鼠;NS组,肌注等体积生理盐水。每2周免疫1次,共3次。ELISA方法检测免疫后不同时间产生的特异性IgG1,IgG2a和IgG 2 b水平。双抗体夹心ELISA法检测免疫鼠脾脏单个核细胞(PMNC)在受到特异抗原刺激后,产生IL-4I、L-12和IFN-γ的能力,3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞的增值能力。结果首次免疫后4周,Ⅱ组小鼠血清可检测到特异性IgG1I、gG2a和IgG2b抗体,随免疫时间和免疫次数的增加3种特异性抗体的OD值逐渐增高,实验结束时(首次免疫后7周)3种特异性抗体OD值均最高。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾PMNC培养上清中IFN-γ浓度分别为50 pg/ml和55 pg/ml,受特异抗原刺激后分别为44 pg/ml和101.5 pg/ml。NS组IFN-γ及各组IL-4和IL-12均未检出。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾淋巴细胞增殖能力增高,其淋巴细胞CPM值分别为NS组的85倍和123倍,受到特异抗原或刀豆素刺激其淋巴细胞增殖更明显。结论多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗可刺激BALB/c小鼠同时产生很强的细胞免疫和体液免疫应答。     

巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

多房棘球绦虫疫苗研究进展

泡型包虫病 (Alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球绦虫 (Echinococcus multilocularis,Em)的续绦期幼虫寄生在人体肝脏引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病(Zoonosis)。健康教育是预防 AE的根本措施 ,早期或病灶较为局限的病例首选外科手术 ,但术后复发率较高 ,同时对人体损伤较大 ,不宜手术的病例可采用大剂量、长疗程的阿苯哒唑、甲苯咪唑、丙硫咪唑、苯硫氨酯或吡喹酮等药物进行化疗 ,临床发现这些药物存在一定的毒副作用 ,部分患者不能耐受 ,同时某些化疗患者可产生耐药性 ,这就需要研究更有效的防治措施。人们发现…     

多房棘球绦虫成虫的超微结构

本文报告了多房棘球绦虫成虫的超微结构。特别对微毛、精子和虫卵进行了观察。按照微毛分布的不同部位,其形态可分为3种类型。成熟节片中,睾丸内之精子具有9 ‘1’的单鞭毛形式。此外,还观察到虫卵胚膜及幼胚的超微结构,并对其相应的功能做了讨论。     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的　在体外真核细胞 COS7中表达重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87,为旋毛虫病 DNA疫苗的研究奠定基础。　方法　将重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87经脂质体 L ipofectamine介导 ,体外转染真核细胞 COS7,通过细胞免疫组化 ,细胞裂解物的 SDS- PAGE电泳和 Western- blot分析检测表达产物。　结果　重组质粒能够在 COS7中表达出约 38ku的目的蛋白 ,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。　结论　构建的重组质粒可在体外真核细胞 COS7中成功表达。     

几种常用线粒体基因在多房棘球绦虫虫种鉴定中的应用现状及进展

cox1、nad1等线粒体基因用于多房棘球绦虫虫种鉴定,克服了传统方法耗时、费力的缺点,并能保持较高灵敏性和特异性,还可承受大批量虫种鉴定工作,目前在多房棘球绦虫终宿主及中间宿主的感染筛查中应用广泛,本文通过介绍几种常用线粒体基因的结构特点、进化速度、相关研究结果,阐述研究现状及进展,探讨目前存在的主要问题。     

多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中的表达及其在免疫诊断中的初步应用

目的 实现多房棘球绦虫ELP蛋白在大肠埃希菌中的表达，制备高纯度、高特异性的重组抗原，为多房棘球绦虫感染的流行病学调查和临床诊断提供新的工具。方法 在建立了多房棘球绦虫elp基因克隆的基础上，应用亚克隆方法将目的基因插入原核非融合表达载体pQE30（＋）。经酶切鉴定，转化于大肠埃希菌，以IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。亲和层析纯化ELP蛋白，用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果 酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot分析证实，成功地构建了pQ-ELP原核非融合表达载体，该载体转化大肠埃希菌在IPTG诱导下能高效表达ELP蛋白。ELP重组抗原用于ELISA检测18份包虫病人血清均阳性，10份华支睾吸虫病、27份乙肝病毒感染者和10份健康人血清均为阴性。结论 多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中得到了高效非融合表达，初步实验结果显示该重组蛋白对包虫病具有较高的诊断价值。     

泡球蚴Em18重组蛋白的表达及其抗原性检测的研究

目的　构建泡球蚴18(Em18)基因的原核表达质粒,获得高效表达、有生物活性的Em18重组蛋白,为包虫病诊断试剂的研制奠定基础。　方法　用DNAman软件设计引物,分别在引物5′端和3′端添加EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切位点,以pMD18 T/Em18原核表达质粒为模板,PCR扩增Em18基因片断,经酶切,克隆入原核表达载体 pET 41a(+),构建原核表达质粒 pET41a Em18;转化大肠埃希菌BL21(DE3),酶切、PCR及测序鉴定其插入序列的正确性。经 IPTG诱导表达 rEm18 GST重组蛋白和GST重组蛋白,用谷光甘肽 Sepharose 4B亲合层析柱分别进行纯化,通过 SDS PAGE和Western blot试验分析鉴定。　结果　测序表明构建的 pET41a Em18 原核表达质粒均为正确连接,插入 Em18 基因片断为486 bp。SDS PAGE检测表明Em18基因以 rEm18 GST重组蛋白的方式得到成功表达,在相对分子质量单位 50ku处有表达条带;Western blot分析显示,rEm18 GST重组蛋白能被泡型棘球蚴病人阳性血清识别,具有良好的抗原性。　结论　成功构建了 pET41a Em18原核表达质粒,获得的 rEm18 GST重组蛋白具有生物活性和抗原性,有望应用于泡型包虫病诊断试剂的研制。     

丙硫苯咪唑治疗长爪沙鼠泡球蚴病的效果

腹腔接种多房棘球绦虫原头蚴感染长爪沙鼠２．５月后，用含０．２％丙硫苯咪唑（ＡＢＺ）药饵喂饲连续治疗２月（剂量２４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）．停药２月后剖杀结果：对照组泡球蚴平均湿重６．３±１．９ｇ，治疗组平均湿重０．９±０．２ｇ，明显低于对照组（Ｐ＜０．０１）。病理组织学检查显示治疗组泡球蚴囊泡明显塌陷、破裂、生发膜坏死脱落，原头蚴与子囊大片钙化．透射电镜检查发现生发膜结构完全破坏；残存原头蚴体细胞核膜断裂缺损，常染色质明显减少而异染色质显著增多成四块状；线粒体数目减少且肿胀、裂解；内质网与高尔基体明显肿胀、解聚、胞浆内可见大量球形空泡小体。表明ＡＢＺ对泡球蚴细胞有严重的破坏作用。     

四川与宁夏两地区泡球蚴基因组DNA酶切片段长度多态性的初步分析

本文应用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ完全消化四川、宁夏两地泡球蚴基因组ＤＮＡ，分析其酶切片段长度差异。经ＥｃｏＲⅠ酶切后四川泡球蚴的特有条带为７．９ｋｂ、６．８ｋｂ、５ｋｂ，宁夏泡球蚴的特有条带为８．９ｋｂ和７．１ｋｂ，表明两地泡球蚴重复ＤＮＡ核苷酸序列有明显差异。     

甘肃漳县多房棘球绦虫及其终宿主的发现

本文调查了甘肃漳县草滩地区多房棘球绦虫在家犬体内的自然感染情况。剖检59只家犬肠道发现6只阳性,感染率为10.2％。对获检的成虫标本做了形态学描述,并和国内其它地区的多房棘球绦虫形态特征进行了比较。对家犬在当地多房棘球蚴病流行病学中的作用进行了讨论。     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的 研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术，将真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2／B和空载体pcDNA3．1分别转染Hela细胞，400μg／ml G418加压筛选和200gg／ml G418维持筛选，获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和Western-blot方法对复合基因P30P22-CTXA2／B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示，重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku，Western blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3，1-P30-P22-CTXA2／B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白，为进一步动物实验提供了实验依据。     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B和空载体pcDNA3.1分别转染He-la细胞,400μg/mlG418加压筛选和200μg/mlG418维持筛选,获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和West-ern-blot方法对复合基因P30-P22-CTXA2/B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示,重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku,Western-blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白,为进一步动物实验提供了实验依据。     

青海省人与动物多房棘球绦虫的感染

本文报告 195 9～ 1998年青海高原人与动物多房棘球绦虫感染情况的研究结果。共手术治疗泡型包虫病人111例 ;男性 73例 ,女性 38例 ;其中肝泡球蚴病 10 0例 ,肺泡球蚴病 2例 ,脑泡球蚴病 7例 ,脾泡球蚴病 2例。年龄17～ 74岁 ,成年人最为常见。牧民和农民最多见 ,其他职业少见。普查 370 2人 ,B超诊断为肝泡球蚴病者 2 3人( 0 .6 2 % ) ,EM1 8血清学阳性者 30人 ( 0 .81% ) ,两种方法均符合者 13人 ( 0 .35 % )。调查中间宿主 7种 ,在家养动物牦牛肝脏和肺脏及藏绵羊肝脏发现泡球蚴感染 ,感染率分别为 4.0 9% ( 18/ 384)和 5 .36 % ( 31/ 5 78) ;野生动物黑唇鼠兔的肝脏和肺脏及灰尾兔的肺脏发现泡球蚴的感染 ,其感染率分别为 3.45 % ( 11/ 319)和 12 .5 0 % ( 1/ 8)。调查终宿主 5种 ,在藏犬和藏狐肠内均证实多房棘球绦虫感染 ,其感染率分别为 5 .0 8% ( 3/ 5 9)和 33.33% ( 4/ 12 )。提示青海高原存在多房棘球绦虫的藏犬、藏狐 /黑唇鼠兔、灰尾兔和藏犬、藏狐 /牦牛、藏绵羊两种类型的多房棘球绦虫生活史循环链     

新疆细粒棘球蚴95基因的克隆及同源性分析

目的　分析新疆地区细粒棘球蚴 95 (EG95 )基因结构特点。　方法　从新疆地区细粒棘球蚴原头节中提取基因组 DNA,以细粒棘球蚴原头节 DNA为模板进行 PCR扩增 ,获得 EG95基因 ,将其克隆至 p UCm- T载体 ,利用 DNAman软件及 Gene Bank/BL AST功能测序并对其进行基因全序列分析。　结果　测序显示新疆株 EG95 (EG95 - XJ)基因片段为 1191bp。 BL AST比对分析表明 EG95 - XJ基因与新西兰株 EG95基因家族成员同源性达 86 %～ 97% ,所有的碱基差异均发生于内含子区域。　结论　中国新疆地区的 EG95基因为 EG95基因家族成员之一 ,但其序列与新西兰株 EG95基因之间存在一定的差异。     

宁夏棘球属绦虫感染的调查研究

经过调查,在宁夏,家犬为细粒棘球绦虫自然感染的终末宿主,累计平均感染率为1.04％。羊、猪、马属动物,骆驼、牛等以及人是自然感染的中间宿主。在南部山区绵羊感染率为40～85.63％,山羊为21.0％,引黄灌区较低。红狐是多房型棘球绦虫自然感染的终末宿主,累计平均感染率为15％。家犬、家猫不是多房型棘球绦虫自然感染动物(0/385)。人工接种家犬较易感染,接种家猫较难成功(0/2)。达乌里黄鼠的累计平均感染率0.34％。中华鼢鼠(0.2％)和人是自然感染的中间宿主。