负载人骨形态发生蛋白-7基因的兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰对兔脂肪干细胞(ADSCs)成骨能力的影响. 方法 原代培养兔脂肪干细胞,免疫组织化学方法检测细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106的表达,对细胞进行鉴定;阳离子脂质体介导hBMP-7基因转染ADSCs,绿色荧光蛋白表达观察转染效率、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因hBMP-7的表达;ALP定量测定,Western blot检测Ⅰ型胶原、骨钙素的表达,以评价转基因ADSCs向成骨细胞分化的情况. 结果 从兔脂肪组织中分离出来的ADSCs CD44、CD49d表达呈阳性,CD106表达呈阴性.RT-PCR检测筛选后的ADSCs稳定表达hBMP-7.转染后7、10、14 d ALP定量测定转染组明显高于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);成骨标志物Ⅰ型胶原、骨钙素的表达转染组明显高于未转染组.结论 从脂肪组织中分离出的ADSCs是一种较好的组织工程种子细胞.hBMP-7重组质粒转染ADSCs后表达目的蛋白,并诱导ADSCs向成骨细胞分化.     

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的探讨将成人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法,并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定. 方法分离人骨髓,梯度离心并结合全骨髓法进行培养,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸.贴壁细胞传代,取第3代细胞鉴定其成骨特性;在倒置相差显微镜下观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原表达,原位杂交检测骨连接素(ON)、骨桥素(OP)表达,Von Kossa 染色检测钙结节形成. 结果第3代人MSCs呈典型的成骨细胞形态,可连续传代10次;ALP染色阳性率达85%;Ⅰ型胶原、ON和OP表达阳性;Von Kossa 染色可见钙结节形成. 结论成功地将人MSCs诱导分化为成骨细胞,所诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性.     

GSB中药血清对rMSCs定向诱导分化为成骨细胞的影响

目的观察GSB中药血清对大鼠MSCs定向诱导分化成骨的影响。方法将培养的rMSCs分为对照组（C组）[含10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的完全培养液]、诱导组（O组）[完全培养液,加诱导培养液（0.1μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠及50μg/ml维生素C）,加20%空白血清]和含药血清诱导组（G组）[完全培养液加诱导培养液诱导培养液中加入20%含药血清）。显微镜下观察细胞形态变化,生化法测定上清中Ca^2＋浓度,Gomori改良钙钴法进行ALP染色,Von Kossa法进行矿化结节染色,RT-PCR法测定Ⅰ型胶原（COLL1）和脂蛋白脂酶（LPL）的表达,放免法测定上清中骨钙素含量。结果O组和G组在加入诱导培养液3-4天后梭形细胞比例减少,细胞变形成多角形、乃至方形,部分区域细胞成多层生长;改良Gomori钙钻法碱性磷酸酶染色阳性细胞,Von Kassa染色发现钙盐沉积;培养9d后细胞Ca^2＋浓度开始升高,并随时间持续显著增长,且G组明显高于O组。自第15d后,O组和G组细胞ALP活性随时间延长而明显增高,且G组显著高于O组;培养的第14d,G组骨钙素分泌量明显高于O组。成骨诱导剂作用MSCs12d后,COLLⅠ mRNA表达阳性,LPL mRNA表达阴性,且G组比O组COLLⅠ mRNA表达更强。结论补肾填精中药GSB促进骨钙素分泌、增强ALP活性、促钙盐沉积,具有增强成骨诱导剂诱导rMSCs向成骨细胞分化,并促进成骨细胞成熟作用。     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。     

大鼠脂肪基质干细胞的培养及其向成骨细胞分化的研究

目的：研究大鼠脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠脂肪基质干细胞在体外向成骨细胞分化的能力。方法：取成年Sprague—Dawley大鼠腹股沟处脂肪组织，胶原酶消化分离．接种于自制基础培养基巾分离传代。于基础培养基中传至第二代时改换诱导培养基，诱导向成骨细胞分化，培养2-4周．用碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色鉴定成骨细胞分化能力。结果：大鼠脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪基质下细胞：经向成骨细胞诱导培养后，碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色阳性，证实细胞能够分化为成骨细胞。结论：大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪基质干细胞，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相似，能够向成骨细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

腺病毒介导的BMP-2基因诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞定向分化

目的探讨人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因通过腺病毒转染青山羊脂肪间充质干细胞(ADSCs)的可行性及其向成骨细胞定向分化的能力。方法取麻醉状态下青山羊腹股沟脂肪组织,经体外分离培养获得ADSCs,转染以腺病毒介导的人BMP-2基因。倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测ADSCs生长增殖情况,免疫细胞化学法对ADSCs细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,SABC法检测ADSCsⅠ型胶原的表达,通过RT-PCR、Western blot法检测BMP-2基因的表达水平。结果转染人BMP-2基因的ADSCs形态规则;细胞生长速度快,且随培养时间的延长逐渐增多(P0.05);成骨诱导后,转染组细胞ALP活性和Ⅰ型胶原表达强度明显高于未转染组(P0.05);转染组ADSCs BMP-2基因m RNA水平和蛋白含量均明显强于未转染组(P0.05)。结论经腺病毒介导的人BMP-2基因转染的青山羊ADSCs在体外诱导培养中可以向成骨细胞定向分化,并保持较强的增殖能力;转染后细胞BMP-2目的基因表达增高。     

人骨形态发生蛋白-2基因转染人脂肪源性基质细胞的异位成骨作用

目的探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(Adv-hBMP-2)基因转染人脂肪源性基质细胞(ADSCs)的可行性及其成骨作用。方法从人脂肪组织中提取间充质细胞，分别转染β-半乳糖苷酶(β-gal)基因和hBMP-2基因，通过X-gal染色明确转染效率．-免疫沉淀 Western blot法和ELISA法检测BMP-2表达，确定BMP-2表达量、表达时间及其相互关系，流式细胞仪观察基因转染对细胞凋亡的影响，并将转基因细胞注入裸鼠股部肌内行X线及组织学检查。结果X-gal染色显示转染效率达91％。免疫沉淀 Western blot法和ELISA法显示转染hBMP-2的ADSC具有较高且稳定的BMP-2的表达，20d内表达量无明显减退。流式细胞表明腺病毒转染后细胞凋亡率上升，但上升幅度不大。裸鼠肌内注射转基因细胞后2周即显示有异位骨形成，4周明显增多，对照组无骨组织形成。结论ADSC是较好的基因治疗载体细胞，转染hBMP-2后可以诱导裸鼠体内骨形成。．     

人骨形态发生蛋白2重组腺病毒载体的构建及其生物学活性检测

目的构建人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2),并检测其转染后的骨髓基质细胞hBMP-2表达以及成骨能力的改变。方法采用Cre-lox重组方法构建含有hBMP-2基因的复制缺陷型重组腺病毒,并利用原位杂交和免疫组化手段观察转染后的骨髓基质细胞hBMP-2mRNA和蛋白表达情况;通过Ⅰ型胶原原位杂交、碱性磷酸酶测定、透射电镜观察以及裸鼠肌袋试验评价Ad-hBMP-2转染对兔骨髓基质细胞成骨能力的影响。结果病毒培养上清液的聚合酶链式反应证实构建的重组腺病毒含有Ad-hBMP-2基因,重组腺病毒滴度达3·8×1010pfu/L;感染增殖率为100的Ad-hBMP-2转染兔骨髓基质细胞24h和48h后即可分别检测到显著的hBMP-2mRNA和蛋白表达,转染效率几乎达100%;Ad-hBMP-2转染可以明显刺激兔骨髓基质细胞Ⅰ型胶原mRNA表达、碱性磷酸酶分泌、细胞内蛋白质合成以及异位骨形成等。结论Ad-hBMP-2具有高效转染能力,并能够诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化,进而促进骨形成。     

脂肪基质干细胞培养及其定向分化为成骨细胞、软骨细胞特性的研究

目的研究脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠ADSCs在体外向成骨细胞、软骨细胞分化的能力。方法从成年SD大鼠腹股沟处无菌获取脂肪组织，胶原酶消化分离，培养出ADSCs。基础培养基传至第二代时改换诱导培养基，分别诱导向成骨、软骨细胞分化，培养2～4周，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Vonkossa染色鉴定向成骨细胞分化能力；阿新蓝染色鉴定向软骨细胞分化能力。RT—PCR检测成骨细胞、软骨细胞标志基因。结果大鼠脂肪能够分离培养出生长旺盛的ADSCs；向成骨细胞诱导，ALP、Vonkossa染色阳性，RT—PCR检测有ALP、Osteocalcin及Osteopontin表达；向软骨细胞诱导，阿新蓝染色阳性，RT—PCR检测有Ⅱ型胶原、X型胶原和Aggreean表达。结论大鼠脂肪组织可以分离培养出ADSCs，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）相似，能够向成骨细胞、软骨细胞分化，有希望成为组织工程理想的种子细胞来源。     

hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体的体外生物学活性研究

目的通过体外实验探讨hVEGF165和hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体外生物学活性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。方法分别采用rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的rAAV-IRES-GFP(对照组)转染体外培养的第3代兔BMSCs,于转染后1、2、3、7及14d应用ELISA法及转染后14d应用Western blot法鉴定两组hVEGF165和hBMP-7表达;转染后14d行细胞免疫荧光染色观察hVEGF165和hBMP-7表达一致性。应用第3代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管状血管形成实验检测hVEGF165蛋白活性。取第3代BMSCs行诱导成骨实验,Gomori钙钴法ALP染色及茜素红法钙盐染色检测hBMP-7蛋白活性。结果ELISA检测示随转染时间延长,两组hVEGF165和hBMP-7表达逐渐升高;实验组各时间点hVEGF165和hBMP-7表达量均明显高于对照组(P0.05)。Western blot检测示实验组可见hVEGF165和hBMP-7表达,对照组未见阳性表达。细胞免疫荧光染色观察示实验组hVEGF165和hBMP-7染色呈阳性,表达部位和强度具有较好一致性;对照组未见阳性表达。HUVEC管状血管形成实验示实验组HUVEC拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构;与对照组相比,管状血管数比较差异有统计学意义(P0.05)。ALP染色见实验组细胞出现深染颗粒,对照组细胞内浅着色;与对照组相比,矿化结节数比较差异有统计学意义(P0.05)。结论双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7体外具有良好的生物学活性。     

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究

目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法。方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红O染色鉴定。实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pc DNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的Ha Cat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs加入10%FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量。结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义。结论:转染EGF的Ha Cat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞生物学特性的影响

目的通过观察长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响,鉴定ADSCs作为组织工程种子细胞的优越性。方法通过流式细胞技术观察长期体外培养对人ADSCs表面抗原表达和凋亡的影响。通过碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及RT-PCR检测长期体外培养对人ADSCs成骨分化潜能的影响。结果原代ADSCs表面高表达间充质干细胞表面标记物,而不表达血源性细胞表面标记物,标记物不随传代次数变化。早期ADSCs凋亡率为1%～2%,随传代次数增多凋亡率逐渐增加．但幅度不大。碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色和RT-PCR检测显示ADSCs传至第8代时仍能保持成骨分化潜能。结论ADSCs生物学特性稳定,是较为理想的组织工程及再生医学研究的种子细胞。     

人血管内皮生长因子基因转染原代成人皮肤成纤维细胞研究

目的　将人血管内皮生长因子 (hVEGF)基因导入原代离体成人皮肤成纤维细胞 ,验证转基因细胞分泌hVEGF情况 ,探讨成人自体细胞基因修饰后移植的可行性。方法　采用酶消化法获取成纤维细胞 ,以杜氏改良培养基 (DMEM )传代培养。以脂质体转染法将pcDNA3 .1( ) /hVEGF12 1导入成纤维细胞 ,培养 48h后取细胞作逆转录 多聚酶链式反应 (RT PCR) ,上清行酶联免疫吸附反应 (ELISA)检测、MTT测定和Mile’s实验。结果　转基因细胞经RT PCR扩增出一条约 44 4bp条带 ,ELISA显示转基因细胞培养上清VEGF浓度约 (12 .3 2± 0 .3 9) μg/L ,MTT显示上清明显促内皮细胞增殖 ,Mile’s实验显示上清明显增加毛细血管通透性。结论　质粒 pcDNA3 .1( ) /hVEGF12 1成功转染成人皮肤成纤维细胞 ,转基因细胞能表达分泌有生物活性的VEGF12 1蛋白。     

hVEGF基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的实验研究

目的探讨hVEGF165基因修饰的BMSCs在SD大鼠急性牙周缺损模型中对牙周组织再生的作用。方法人工构建SD大鼠急性牙周缺损模型。设以下6组(36只SD大鼠,n=6):空白对照(A组);单纯e-PTFE膜(B组);BME+e-PTFE膜(C组);BMSCs+BME+e-PTFE膜(D组);空转BMSCs+BME+e-PTFE膜(E组);hVEGF165基因修饰的BMSCs+BME+e-PTFE膜(F组)。分别将转染hVEGF165基因的BMSCs与未转染的BMSCs接种于胶原膜BME-10X后,按各分组植入人工牙周缺损内,并以空白胶原膜和空载体为对照。4周后取材作病理切片,HE染色观察牙周组织再生情况,测量新生牙槽骨面积、新生牙骨质面积以及新生牙周膜宽度,结果进行统计学分析。结果各组均可见不同程度的牙周组织再生,A组、B组和C组三组新生牙槽骨面积(NB)、新生牙骨质面积(NC)和新生牙周膜宽度(NP)均无明显差别(P>0.05);与A组相比,D组、E组、F组的NB、NC均有显著增加(P<0.05);与E组相比,转染有hVEGF165基因组(F组)的NB、NC和NP均有显著增加(P<0.05)。结论 hVEGF165基因转染BMSCs与胶原膜复合物可促进大鼠牙周组织再生。     

大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究

目的:建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性。方法:取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪,I型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞,接种至含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养并适时传代,每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化,进行VonKossa染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化,进行油红O染色。结果:从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞,其在体外生长增殖迅速,呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强,可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,表现出成骨细胞特性,VonKossa染色出现矿化结节;在IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、吲哚美辛、胰岛素的诱导下,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论:成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛,具有多向分化能力,可以方便地保存,有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。在分离大鼠的脂肪干细胞时,NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略,地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的。     

吸脂组织中脂肪干细胞分离和定向分化的研究

目的探讨吸脂组织中的干细胞分离和体外诱导分化为表皮样细胞、成骨细胞及脂肪细胞的可能性。方法通过电动负压吸引获取1例行吸脂手术的30岁女性腹部脂肪组织,酶消化法获取脂肪来源干细胞,体外培养扩增,通过流式细胞仪检测表面抗原的表达。取生长良好的第3代人脂肪来源干细胞,分别应用成表皮诱导培养液（70％培养液A＋30％成纤维细胞培养基上清液＋10ng／L表皮生长因子）,成骨诱导培养基（DMEM／10％FBS,0．1μmol／L地塞米松,50μmol／L维生素C,10mmol／Lβ-甘油磷酸钠,100U／ml青霉素,100U／ml链霉素）和成脂肪细胞诱导培养基（DMEM＋10％FBS＋500μmol／L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤＋1μmol／L吲哚美辛）诱导20d后,分别对成表皮诱导组进行免疫组化检测CK19表达,成骨诱导组进行碱性磷酸酶检测,成脂诱导组进行油红O检测。结果流式细胞仪鉴定结果示,人脂肪来源干细胞CD44和CD49d为阳性,CD34为阴性。诱导20d后,成表皮诱导组示免疫组织化学鉴定结构显示有CK19的表达;成骨诱导组示细胞碱性磷酸酶染色阳性;成脂肪细胞诱导组示油红O染色,胞质内脂滴均被染成红色,证实为脂性液体。结论从吸出的脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞,在体外进行了脂肪干细胞的扩增和传代,所分离的脂肪来源干细胞具备多向分化能力。     

Choukroun’SPRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白Choukroun＇s PRF（Choukroun＇s platelct-rich fibrin）对体外培养人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响。方法：取吸脂术者自愿捐献的脂肪组织分离培养ADSCs,采用Choukroun法制备自体PRF备用,观察细胞生长情况。取第3代ADSCs分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。将第3代ADSCs分别采用含PRF的普通培养基（PRF组Ⅰ）和不含PRF的普通培养基（对照组Ⅰ）进行培养,观察细胞生长情况,培养1天、3天、5天、7天后采用CCK-8试剂检测细胞增殖活性。另外分别采用含PRF的成骨诱导培养基（PRF组Ⅱ）、不含PRF的成骨诱导培养基（对照组Ⅱ）及不合PRF的普通培养基（空白组）进行培养,第7天、14天、21天、28天行碱性磷酸酶活性（ALP活性）检测;诱导细胞培养后第7天、14天天各组分别行von Kossa染色观察钙结节形成情况。结果：第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形,向骨细胞、脂肪细胞、神经干细胞定向诱导鉴定均为阳性,流式检测鉴定CD29、CD90为阳性,CD45为阴性。CCK-8法示PRF组Ⅰ的0D值均大于对照组Ⅰ,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。ALP活性检测示PRF组Ⅱ第7天、14天、21天、28天细胞活性较对照组Ⅱ均大,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。PRF组Ⅱ成骨诱导7天后vonKossa染色阳性;14天后阳性细胞增多,对照组Ⅱ诱导7天未见钙结节,14天见少量阳性钙结节,空白组培养14天未见黑色钙结节。结论：Choukroun’sPRF明显促进脂肪干细胞增殖及成骨分化,为骨组织工程提供了新的技术。PRF与干细胞共同培养可能还有许多潜在的临床及生物工程应用价值,值得进一步研究。     

前列腺癌PC-3细胞条件培养液对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:探讨前列腺癌PC-3细胞条件培养液(PC-3-CM)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:从健康成人骨髓分离、培养、扩增hBMSCs。第3代(P3)hBMSCs用于该实验的研究。PC-3细胞培养至对数生长期时换液,继续培养24 h后收集培养上清液即PC-3-CM。hBMSCs分别在常规培养液(对照组)和含50%PC-3-CM的培养液(实验组)中培养,采用WST-8法检测PC-3-CM对hBMSCs增殖活性的影响。根据培养液的不同,将hBMSCs分为4组:常规培养液组(Ⅰ组,对照组),含50%PC-3-CM培养液组(Ⅱ组),成骨诱导剂组(Ⅲ组)和含50%PC-3-CM的成骨诱导剂组(Ⅳ组),通过碱性磷酸酶(ALP)染色、活性检测和Von Kossa钙染色、钙沉积定量来观察PC-3-CM对hBMSCs成骨分化的影响。结果:培养第1、3、5和7天,WST-8法检测显示,实验组细胞吸光度(A)值分别为0.437 0±0.028 5、0.798 0±0.021 3、1.909 0±0.061 2和2.302 3±0.061 0,对照组分别为0.406 0±0.022 3、0.664 3±0.007 5、1.372 7±0.017 6和1.794 7±0.011 5。两组间除第1天的A值无统计学差异(P>0.05)外,其余3 d实验组的A值均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。4组细胞ALP染色阳性率和染色强度依次增高,ALP活性分别为0.292 5±0.033 0、1.297 5±0.023 6、2.125 0±0.073 3和3.795 0±0.026 9,依次升高(P<0.01)。4组细胞钙结节数目依次增多,染色强度依次增强,钙沉积含量分别为0.039 0±0.006 4、0.435 0±0.049 2、0.977 5±0.035 2和1.271 3±0.035 2,依次升高(P<0.01)。结论:PC-3-CM可促进人hBMSCs增殖和成骨分化。