突变AS3Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析

目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞.方法:PCR 扩增法获得含有Sal I和Not I的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,Sal I、Not I双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES.重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞.结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达.结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一.     

人源核不均一核糖核蛋白E1真核表达载体在神经细胞中的表达CSCD

背景:人源核不均一核糖核蛋白E1功能广泛,可参与神经系统骨架蛋白的表达。目的:为深入研究其在神经细胞中的作用,构建其真核表达载体,观察其在神经细胞中的表达。方法:利用真核表达载体pcDNATM4/His C,通过亚克隆构建核不均一核糖核蛋白E1-pcDNATM4/His C重组质粒,经酶切、测序鉴定,通过转染神经细胞SH-SY5Y,采用western-blot,RT-PCR鉴定核不均一核糖核蛋白E1重组质粒的表达,并观察转染细胞的生长现象。结果与结论:成功构建了核不均一核糖核蛋白E1的真核表达载体,mRNA和蛋白水平上均证实了该质粒可在神经细胞SH-SY5Y中正确表达。SH-SY5Y细胞在转染核不均一核糖核蛋白E1后表现为加速生长。提示该蛋白对神经细胞的生长发育具有重要的作用。该载体为进一步研究核不均一核糖核蛋白E1在神经系统中的功能提供了前提条件。     

α-突触核蛋白各结构域与MN9D细胞线粒体的关系

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)各结构域与MN9D细胞线粒体的关系.方法 用PCR方法获得α-synuclein/1～65(N),α-synuclein/61～95(A)及α-synuclein/96～140(C)基因片段,克隆入真核表达质粒pLNCX2,经测序正确后以脂质体转染PT-67细胞,挑取单克隆并扩增,收集上清感染MN9D细胞,分别用Real Time PCR检测细胞基因表达水平,免疫组织化学染色检测蛋白表达,激光扫描共焦显微镜检测蛋白与线粒体共定位,流式细胞术检测细胞状态及线粒体膜电位状态.结果 成功构建了pLNCX2/N、pLNCX2/NAC及pLNCX2/C基因片段的重组真核表达质粒,获得了可稳定表达α-synuclein各基因片段的MN9D细胞株.通过激光扫描共焦显微镜观察,可见α-synuclein/N端与线粒体存在共定位关系;α-synuelein/NAC主要在核内聚集表达;α-synuclein/C端在胞质和胞核内均有表达.JC1染色流式细胞术检测显示,过表达α-synuclein/N实验组细胞线粒体膜电位降低.结论 α-synuclein的N端可能定位于线粒体,并参与调节线粒体功能;α-synuclein/NAC虽具有疏水性但却能穿过核膜,聚集在核仁周围;α-synuclein的C端定位于胞质和核内可能参与多种细胞功能.     

人防御素-5基因的克隆和真核表达载体的构建

目的对人防御素5(HD-5)基因进行克隆,构建真核表达载体HD5-pPICZαA。方法从人cDNA文库中PCR扩增HD-5基因片段,用EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA,用T4DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,然后转化到E.coli Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和序列鉴定。结果提取阳性克隆的重组质粒,EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后跑电泳获得预期条带;同时重组质粒经序列测定,证实HD-5基因正确插入pPICZαA中,插入位置、方向均正确。结论成功构建人防御素5基因的真核表达载体HD5-pPICZαA,为HD-5蛋白的真核真核表达奠定基础。     

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.     

人源核不均一核糖核蛋白E1真核表达载体在神经细胞中的表达

背景:人源核不均一核糖核蛋白E1功能广泛,可参与神经系统骨架蛋白的表达。目的:为深入研究其在神经细胞中的作用,构建其真核表达载体,观察其在神经细胞中的表达。方法:利用真核表达载体pcDNATM4/His C,通过亚克隆构建核不均一核糖核蛋白E1-pcDNATM4/His C重组质粒,经酶切、测序鉴定,通过转染神经细胞SH-SY5Y,采用western-blot,RT-PCR鉴定核不均一核糖核蛋白E1重组质粒的表达,并观察转染细胞的生长现象。结果与结论:成功构建了核不均一核糖核蛋白E1的真核表达载体,mRNA和蛋白水平上均证实了该质粒可在神经细胞SH-SY5Y中正确表达。SH-SY5Y细胞在转染核不均一核糖核蛋白E1后表现为加速生长。提示该蛋白对神经细胞的生长发育具有重要的作用。该载体为进一步研究核不均一核糖核蛋白E1在神经系统中的功能提供了前提条件。     

小泛素样修饰蛋白对α-突触核蛋白线粒体亚细胞定位及α-突触核蛋白经泛素系统降解的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白1(small ubiquitin-like modifier1,SUMO-1)化修饰对α-synuclein蛋白亚细胞线粒体定位及α-synuelein蛋白经泛素系统降解的影响.方法 构建野生型、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒.将野生型、A53T突变型和K96R突变型α-synuclein真核表达质粒分别转染HEK293细胞;在转染后48 h通过应用线粒体染色剂和激光共聚焦技术,观察野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白的亚细胞线粒体定位和蛋白聚集情况.在转染后48 h应用anti-ubiquitin抗体进行Western印迹分析,明确野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白泛素化程度有无差别.结果 将构建所得EGFP-α-synuclein-WT、EGFP-α-synuclein-A53T、EGFP-α-synuclein-K96R真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;激光共聚焦结果显示野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein蛋白均广泛分布于细胞质和细胞核中,以细胞质为主,野生型、A53T型细胞可见绿色荧光物质在胞质积聚,形成强荧光斑块,K96R型胞质内绿色荧光物质聚集少;野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein均与线粒体存在共定位,A53T突变型、K96R突变型α-synuclein在SUMO-1修饰或缺失的情况下对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响.Western印迹结果显示转染缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒组的细胞泛素蛋白的含量与转染空质粒组相比无明显变化,转染野生型、A53T突变型α-synuclein真核表达质粒组HEK293细胞中泛素蛋白的含量减少.结论 α-synuclein基因过度表达及致病突变A53T对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响;SUMO-1修饰对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位也无明显影响;SUMO-1对a-αsynuclein基因过度表达及A53T突变型α-synuclein细胞内泛素化蛋白数量产生影响.     

人多梳蛋白2不同功能片段真核表达载体的构建及表达

目的:构建HPC2不同截短功能片段的真核表达载体,并检测各片段在骨肉瘤U2OS细胞中的表达。方法:以质粒pcDNA3.2-V5/HPC2为模板,分别设计各片段PCR引物进行扩增,EcoR I酶切鉴定PCR产物,正确的PCR产物进行连接后转化到DH5α感受态细胞中并涂板筛选,从而得到带有V5标签的不同截短动能片段的表达载体,提取质粒并转染U2OS细胞,Western blot法鉴定目标蛋白的表达。结果:测序及酶切的结果均表明HPC2不同功能片段的真核表达载体构建成功,并能够在U2OS细胞中表达。结论:成功构建了HPC2不同功能域片段的真核表达载体。     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2（DAZAP2）真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框（ORF）.采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆人类泛素水解酶22(ubiquitin-specific processing enzyme 22,USP22)基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体.方法 利用RT-PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP-N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布.结果 测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEGFP-USP22构建无误,质粒转染后有80 %左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布.结论 成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础.     

β-淀粉样蛋白真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建β-淀粉样蛋白真核表达质粒,为进一步开展老年性痴呆DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR扩增β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)基因,用限制性内切酶KpnⅠ/XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3.1酶切,将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切初步鉴定后进行序列测定。结果特异扩增出Aβ1-42片段,大小为126bp,片段成功插入pcDNA3.1载体中。经双酶切及序列测定结果表明Aβ1-42目的基因正确重组入pcDNA3.1载体中。结论成功构建Aβ1-42真核表达质粒。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

Dynamitin真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pRe-dyn真核表达质粒,为研究dynein-dynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础.方法 RT-PCR扩增dynamitin基因片段后,将其克隆入真核表达载体pReceiver-M01a;通过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-dyn;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示胞浆中有dyanimtin蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe-dyn,为后续研究dynamitin在病毒感染过程中的作用积累了有价值的实验资料.     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究     

pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒的构建及在HePG_2细胞的表达定位

目的:构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HePG2中的表达和亚细胞定位.方法:采用PCR法从pET28b/LOC51255重组质粒中克隆得到LOC51255 cDNA全长序列, 并将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中.构建好的pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞株HePG2, 再用荧光显微镜直接观察LOC51255在其中的表达及定位情况.结果:经双酶切及DNA测序结果证实成功构建重组质粒pDsRed1-C3/LOC51255;荧光显微镜观察证实该重组质粒能在HePG2细胞中表达, 且LOC51255蛋白主要定位于HePG2细胞的细胞质.结论:成功构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒, 并在HePG2细胞中得到表达, 同时证实LOC51255定位于HePG2细胞的胞质, 为进一步研究人类LOC51255基因的功能奠定了基础.     

pDsRed1-C3/XAPC7真核表达载体的构建及细胞定位

目的:构建pDsRed1-C3/XAPC7真核表达载体并观察其在786-O、293T和Chang liver细胞株中的定位情况。方法:采用RT-PCR法从HBE135-E6E7细胞株中克隆得到XAPC7cDNA全长序列,将之与pMD18T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中。构建好的pD-sRed1-C3/XAPC7真核表达质粒经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染786-O、293T和Chang liver细胞株中,观察其在真核细胞中的表达。结果:pDsRed1-C3/XAPC7重组子经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功,转染该重组子的细胞株均可见红色荧光蛋白的表达,呈颗粒状分布。XAPC7主要定位于786-O细胞的胞质,胞核罕见,在293T细胞中,胞质和胞核均有分布,且两者间无明显差别,在Changliver细胞中,胞质和胞核亦均有分布,但以胞质为主。结论:成功构建pDsRed1-C3/XAPC7融合基因并进行真核表达,发现XAPC7在不同细胞中的细胞定位具有差异,为下一步研究XAPC7的肿瘤相关功能奠定基础。     

半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1的基因克隆真核表达及细胞定位

目的 构建带FLAG标签的半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1(CRP1)的真核表达载体,明确该融合蛋白在人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞和乳腺癌ZR75-1细胞中的表达及定位情况.方法 采用PCR技术从乳腺cDNA文库中扩增出人CRP1基因,并将其插入到pCMV-Tag2B表达载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞,Western blot法检测转染细胞的表达情况;荧光显微镜观察pCMV-FLAG-CRP1在人胚肾293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞中的定位.结果 双酶切和测序鉴定表明,pCMV-FLAG-CRP1真核表达质粒构建成功;Western blot法检测pCMV-FLAG-CRP1转染293T细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR75-1细胞后成功表达;荧光显微镜下观察,在293T、HepG2、ZR75-1细胞中,CRP1在细胞质和细胞核中均有分布,且胞质信号强于胞核.结论成功构建pCMV-FLAG-CRP1真核表达载体,CRP1可在不同细胞中的胞质和胞核表达.