人lrp-cDNA全长编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:扩增人lrp-cDNA全长编码区、并在大肠杆菌中表达和鉴定.方法:提取脂多糖刺激后HEK293细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出全长人lrp序列,将其克隆入原核表达载体pcTAT后转化大肠杆菌诱导表达,做SDS-PAGE分析;并用免疫印迹法鉴定6His-TAT-LRG融合蛋白表达.结果:测序结果表明,获得了全长人lrp-cDNA全长编码区,其序列与GenBank已经公布的不完全一致;SDS-PAGE分析表明,6His-TAT-Lrp融合蛋白在大肠杆菌中成功表达,表达量约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生阳性反应.结论:得到人lrp-cDNA全长编码区序列,并成功表达,为人lrp功能的深入研究奠定了基础.     

人白细胞介素—9cDNA的PCR扩增及其在大肠杆菌的表达

利用ＰＣＲ技术从人外周血Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出人ＩＬ－９的ｃＤＮＡ，将其连入大肠杆菌表达载体后，可大大肠杆菌高效表达出人重组ＩＬ－９融合蛋白，表达量占菌体蛋白的２５％左右，有明显的刺激正常人骨髓细胞集落形成的活性。     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

人骨桥蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建人骨桥蛋白(hOPN)表达载体,体外表达及表达产物的纯化.方法培养人脐静脉内皮细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此cDNA为模板经PCR合成插入片段,连接至载体pGEX-6P-1,转化到XL1-blue中进行诱导表达.表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,切下目的蛋白进行洗脱纯化.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA测序,证明所构建的质粒是pGEX-6P-OPN.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现该重组质粒经IPTG诱导后表达一种新的蛋白(表达量为16.7%),这种蛋白不存在于诱导后的pGEX-6P-1表达产物中,纯化后蛋白纯度为99%.结论成功构建了hOPN表达载体,并进行体外表达.     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

大肠杆菌表达人IL-21融合蛋白的纯化和抗原性分析

目的在大肠杆菌中表达人IL-21编码基因,并进行蛋白纯化和抗原性分析。方法以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA文库为模板,经PCR获得IL-21全基因片段。测序确认后,分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,经PCR获得IL-21成熟肽的编码基因。将此IL-21基因插入表达载体pGEX-4T-2,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达。经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用WesternBlotting作抗原性分析。结果SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带,并获得了与理论值相符的纯化条带,在进一步的Western Blotting分析中发现表达的蛋白能与IL-2的单抗产生结合反应。结论人IL-21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达,同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法,通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL-21蛋白与IL-2之间结构的相似性。     

大肠杆菌表达人IL-21融合蛋白的纯化和抗原性分析

目的 在大肠杆菌中表达人IL-21编码基因,并进行蛋白纯化和抗原性分析.方法 以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA 文库为模板,经PCR获得IL-21全基因片段.测序确认后,分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,经PCR获得IL-21成熟肽的编码基因.将此IL-21基因插入表达载体pGEX-4T-2,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达.经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用Western Blotting作抗原性分析.结果 SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带,并获得了与理论值相符的纯化条带,在进一步的Western Blotting分析中发现表达的蛋白能与IL-2的单抗产生结合反应.结论 人IL-21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达,同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法,通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL-21蛋白与IL-2之间结构的相似性.     

用PCR方法定量检测IL-6受体基因在前列腺癌中的表达

利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）定量检测了10例正常人前列腺、15例前列腺癌（PCa）及 PCa细胞系PC-3m中白细胞介素6受体(IL-6R）基因表达水平。结果发现,正常人前列腺组织中IL-6R基因呈低水平表达,PCa组织中IL-6R基因表达增强,明显高于正常组（P<0.01）,且73.3％（11/15）组织样本中IL-6R mRNA表达水平高于 PC-3m。而IL-6所介导的假单胞菌外毒素融合蛋白对该细胞系有强烈的杀伤作用。这表明IL-6及IL-6R与PCa的发生发展有关,并为PCa的生物学治疗的研究奠定了基础。     

人白细胞介素1受体拮抗基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 获得一株重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的高效表达菌株,为研究各种急慢性炎症疾病的发病机制以及拮抗IL-1的生物学效应奠定基础。方法 分离人外周血淋巴细胞,提取mRNA,反转录PCR获得人白细胞介素1受体拮抗基因（hIL-1ra),克隆人大肠杆菌表达载体。从而构建高效表达人IL-1ra的重组菌株。结果 成功构建了IKL-1ra的高效表达菌株（pLDH-hIL1ra),序列测定与文献报道一致12%SDS-PAGE分析显示此菌株所表达的目的蛋白产物相对分子质量为23ku,与预期结果相符,光密度扫描重组hIL-1ra蛋白质占细菌总蛋白的30%。结论 大肠杆菌中成功地表达了hIL-1ra基因。     

IL-21及其受体在银屑病患者外周血和皮损组织中的表达及意义

目的探讨IL-21及其受体在斑块型银屑病患者外周血PBMC和皮损组织中的表达情况及临床意义。方法采用流式细胞仪检测斑块型银屑病58例患者及20例健康对照者外周血PBMC中IL-21、IL-21R的表达;采用实时定量RT-PCR（quantitative real-time, RT-PCR）法检测25例银屑病和15例正常人外周血PBMCs和皮肤组织中IL-21、IL-21R mRNA的表达情况;采用Western印迹法检测皮肤组织中IL-21和IL-21R的表达情况;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测PBMC培养上清液中IL-21的分泌水平。结果流式细胞仪检测发现银屑病患者PBMC中IL-21和IL-21R占CD4+T细胞的百分率明显增加（P<0.01）;Real-time PCR发现IL-21、IL-21R mRNA在银屑病患者的PBMC和皮肤组织中表达均较健康对照者增高（P<0.01,P<0.05）;Western印迹法显示IL-21和IL-21R蛋白在银屑病患者的皮损中表达增高（P<0.01）;ELISA检测发现培养上清中IL-21分泌水平增加（P<0.01）。结论斑块型银屑病患者PBMC和组织中IL-21和IL-21R的表达水平均较健康对照者升高,IL-21可能参与了银屑病的发病过程,并可能成为一个潜在的治疗靶点。     

HSV—1包膜糖蛋白G原核表达克隆的构建和表达

①目的 构建人单纯疱疹病毒1型Stoker株包膜糖蛋白G编码基因（Us4）片段的原核表达克隆,并进行原核表达。②方法 通过PCR方法增扩HSV-1Us4基因的抗原决定簇编码区,目的基因与原核表达载体PGEX-4T-2分别比双酶切后连续,然后转化宿主菌Ecoli.BL21,IPTG诱导表达。③结果 获得了重组的原核表达质粒及重组蛋白。④结论 用限制性内切酶鉴定原核表达质粒构建成功,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达成功。     

急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义

目的 观察 Livin 基因在急性白血病(AL)病人白血病细胞中的表达及其临床意义.方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测41例不同时期AL病人白血病细胞Livin mRNA的表达水平,以10例健康人作为正常对照.结果 AL病人白血病细胞Livin mRNA 阳性表达率为53.7%.其中急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)病人Livin mRNA 阳性表达率分别为53.8%、53.6%,二者比较差异无显著性,但均高于正常对照组(10.0%)(P=0.035、0.017).初治和复发AL病人白血病细胞Livin mRNA 阳性表达率分别为52.4%、85.7%,明显高于对照组(P=0.025、0.004).缓解组病人Livin mRNA阳性表达率为15.4%,明显低于初治组和复发组(P=0.004、0.030),而与对照组相比差异无统计学意义.白细胞计数≥50×109/L的初治白血病病人Livin mRNA的阳性表达率(77.8%,7/9)明显高于白细胞计数＜50×109/L的初治病人(25.0%,3/12)(P=0.022),其表达水平也明显高于后者(T=6.50,P<0.05).结论 Livin mRNA过度表达参与了AL的发病,可作为AL的诊断、复发及预后判断的指标之一.Livin mRNA表达在AL细胞的增殖分化和(或) 抗凋亡过程中发挥了重要作用,可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一,可作为治疗的一个潜在靶点.     

上皮性卵巢癌多药耐药基因的表达及其临床意义

目的探讨上皮性卵巢癌多药耐药（ＭＤＲ１）基因的表达及其临床意义。②方法利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测３３例初治上皮性卵巢癌病人肿瘤组织ＭＤＲ１基因表达情况，同时用ＭＴＴ比色法检测肿瘤细胞对抗癌药的敏感性。③结果１０例（３０．３％）卵巢癌病人ＭＤＲ１基因表达阳性。体外试验表明，ＭＤＲ１基因表达阳性卵巢癌细胞对多种抗癌药耐药，ＭＤＲ１基因的表达与卵巢癌细胞分化程度有关，但与病人的年龄、组织学类型及分期无关。④结论ＭＤＲ１基因的表达可作为判断卵巢癌病人预后的一个指标     

乙型肝炎病毒重组e抗原在大肠杆菌中的高效表达及初步应用

为了获得重组表达乙型肝炎病毒 ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）。利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增和重组技术，在大肠杆菌中的高表达非融合型重组ＨＢｅＡｇ。结果：为模拟天然ＨＢｅＡｇ的结构，除第一个氨基酸为起始密码子ＡＴＧ所编码的甲硫氨酸外，共包括Ｐｒｃｅ－Ｃ区羧基端的９个氨基酸和ＨＢｃＡｇ Ｎ－末端的１４９个氨基酸残基、经诱导表达，其产物相对分子质量约为１７．５ × １０３，产量占细菌总蛋白的１１％。结论：用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析，本表达产物可与特异性的ＨＢｅＡｇ抗体反应。用斑点酶免疫法可以检测患者血清的抗ＨＢｅ。     

人IL-21cDNA的克隆及重组腺病毒表达载体的构建

目的：构建含人IL-21基因的重组腺病毒表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤研究奠定基础。方法：从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,将其连接到进入载体pENTR1A,然后经LR重组转入到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中,构建含IL-21基因的腺病毒载体（Ad-IL-21）,并进行测序鉴定和PCR鉴定。结果：Ad-IL-21表达载体测序结果与GenBank中IL-21基因序列一致,Ad-IL-21经PCR扩增出IL-21基因片段。结论：成功构建携带人IL-21基因的重组腺病毒表达载体。     

黑色素瘤抗原-1基因在胃癌组织中的表达

①目的检测黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因在胃癌组织中的表达，为应用MAGE-1基因产物对胃癌病人进行特异性抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。②方法用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测30例胃癌组织及相应癌旁组织中MAGE-1基因的表达，并对1例RT-PCR阳性扩增产物进行DNA序列测定。③结果30例胃癌组织标本中有14例(46．7％)表达MAGE-1基因，而相应的癌旁组织均不表达MAGE-1，两组比较差异有显著性(P=0．001)；DNA序列测定证实1例RT-PCR扩增产物中的目的基因片段为MAGE-1 cDNA序列。④结论MAGE-1基因在胃癌组织中有较高表达，这使得以该基因编码蛋白作为疫苗用于胃癌的免疫治疗成为可能。     

PAX-2基因的克隆化和在原核细胞中的表达

①目的　以RT PCR技术克隆PAX 2全长开放读框 ,构建重组原核表达载体 ,制备重组人PAX 2蛋白 ,为肾肿瘤免疫治疗打下基础。②方法　从肾癌手术标本中分离mRNA ,RT PCR扩增筛选PAX 2全长开放读框 ,扩增产物经过限制性酶切分析及DNA测序后 ,克隆入高效原核表达质粒 pTrcHis,构建重组载体 ,转化工程菌株JM10 9,经IPTG诱导表达及 6×His配体亲和层析制备原核表达重组人PAX 2蛋白。③结果　RT PCR扩增获得约 1.2kb大小的产物 ,经限制性酶切分析和DNA测序 ,证实为人PAX 2基因的完整开放读框。④结论　肿瘤组织总RNA经RT PCR一步法能够对PAX 2基因的开放读框进行完整有效的筛选。经重组技术及高效原核系统制备重组人PAX 2蛋白的效率和纯度满意。体外制备的重组人PAX 2蛋白对肾肿瘤特异性抗原的瘤苗制备和免疫治疗具有重要价值。     

多药耐药相关蛋白基因在急性白血病中的表达

（1）目的 探讨多药耐药相关蛋白基因（MRP）在急性白血病中表达的意义。（2）方法 应用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）。检测了48例不同病期的急性白血病病人骨髓及10例正常人外周血单个核细胞MRP信使RNA（mRNA)的表达。（3）结果 正常人外周血单个核细胞存在MRP的低水平表达;复发的急性白血病病人MRPmRNA表达明显增高,其对预后及复发的预测作用有待进一步研究。     

MAL基因在原发食管癌组织表达及临床意义

目的 探讨MAL基因表达下调与食管癌病理分期、组织学分级的相关性.方法 采用RT-PCR和半定量RT-PCR方法检测45例食管癌组织和癌旁食管黏膜组织中MAL基因的表达.结果 40例食管癌组织中MAL mRNA表达明显低于相应的癌旁食管黏膜组织(χ2=30.59,P<0.01);Ⅰ～Ⅱ期病人的MAL基因表达水平显著高于Ⅲ期病人(t=5.952,P<0.001),淋巴结转移阳性病人MAL mRNA表达水平显著低于淋巴结转移阴性病人(t=6.743,P<0.001).结论 MAL mRNA在食管癌组织中的表达与临床分期、组织学分级等临床病理因素有一定相关性,可作为判断食管癌恶性程度、转移潜能及预后的实验室指标.     

卵巢上皮性癌组织中PTEN mRNA的表达

①目的　探讨卵巢上皮性癌组织中PTEN基因的表达及其临床意义。②方法　应用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,分别检测 4 9例卵巢上皮性癌组织和 2 0例正常卵巢组织中PTEN基因外显子 5 8和 1 8mRNA的表达 ,同时结合临床病理资料进行分析。③结果　 4 9例卵巢上皮性癌组织中PTENmRNA相对表达水平外显子 5 8为 0 .83± 0 .17,外显子 1 8为 0 .78± 0 .14 ;2 0例正常卵巢组织中PTENmRNA相对表达水平外显子5 8为 1.4 2± 0 .2 9,外显子 1 8为 1.37± 0 .2 4 ,两者比较差异有显著性 (t=10 .93、12 .73,P <0 .0 5 )。卵巢上皮性癌组织中PTENmRNA表达水平的降低与卵巢上皮性癌的组织类型、淋巴结有无转移无关 (t =1.32、1.14 ,F =1.14、1.0 4 ,P >0 .0 5 ) ;但随临床分期和组织学分级的增高其表达水平明显降低 (t=2 .5 3～ 2 .99,P <0 .0 5 )。④结论　PTEN基因转录水平的异常在卵巢上皮性癌的发生发展中具有一定的作用。