尿液蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立及优化

目的 建立稳定的尿液蛋白质组学双向凝胶电泳技术体系.方法 对尿液蛋白质组双向电泳样品的收集保存、样品制备、上样量、水化方式、水化上样液成分、IPG胶条选择及电泳程序参数等进行了比较研究和条件优化.结果 双向电泳图谱清晰.检测到蛋白斑点数目为(849+18)个,匹配率达到81.26%.结论 建立了较稳定的尿液蛋白质双向凝胶电泳方法 ,可用于开展疾病的尿液蛋白质组学研究.     

蛋白质组双向电泳技术研究进展

双向电泳 (2 - DE)是蛋白质组研究的核心技术 ,本文重点介绍了 2 - DE的原理、样品制备及常用改善分辨率的方法 ,并对一向等电聚焦、二向十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳以及凝胶染色方法进行了简要介绍。     

肺组织蛋白质组双向电泳技术的建立

目的 对肺组织蛋白质组分析中的双向电泳(2-DE)技术进行质量控制。方法 通过多种条件的组合与优化,建立以物理和化学两种方法充分裂解组织细胞,并采用低温操作、加入蛋白酶抑制剂等防止蛋白降解,最后离心去除不溶性杂质的肺组织蛋白质组2-DE样品制备方法。第1向电泳为固相pH梯度等电聚焦、第2向电泳为垂直平板SDS-PAGE(T=13)。结果 通过对蛋白定量、样品制备、第1向和第2向电泳中的各个实验环节进行控制和优化,正常大鼠肺组织在18cm pH3-10L的胶上可分离720个点左右,蛋白点平均匹配率为72.2％。结论 建立了肺组织蛋白质组双向电泳技术,为后续工作奠定了基础。     

血清蛋白质组技术及其在预防医学中应用

随着生命科学进入后基因组研究时期,蛋白质组研究应运而生.而血清蛋白质组就是其中一个分支,它是在建立正常蛋白质表达图谱的基础上,寻找目标人群血清差异蛋白质点,研究与疾病相关蛋白质的结构和功能.这些研究将有利于阐明疾病发病机制,并可能发现与疾病特定状态相关的标志性蛋白质,为研究重大疾病病理生理学机制、早期诊断的特异性标志物、病程及疗效监测、药物作用靶点等开辟了新途径,在疾病诊断和防治方面有着广泛的应用[1-2].     

双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用进展

随着2001年2月15日人类全基因组序列草图的完成，也宣告人类将由基因组计划进入后基本组时代。基因组时代的研究发现，在揭示基因组精细结构的同时，也显示出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂性与多变性之间存在着巨大反差。这种反差的存在使人们认识到，要研究生命现象，仅仅研究基因组的结构是远远不够的，必须对生命活动的直接执行者一蛋白质的重要性有更深刻的了解，因此，一个以“蛋白质组”为研究重点的时代已悄然到来。“蛋白质组”一词的英文是PROTEOME，由PROTEins和genOME两个词组合而成，这一概念是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年提出的，是指基因组表达的全部蛋白质，广义上讲，蛋白质组是指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。作为研究蛋白质组的三大核心技术之一，（另外两种分别是计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术）。     

海马组织蛋白质双向电泳条件实验研究

目的优化大鼠海马组织蛋白质双向凝胶电泳分离(2-DE)的实验条件。方法分离并比较不同大鼠海马组织总蛋白的制备方法,pH 3～10非线性胶条(NL)、pH 4～7的2种不同pH梯度预制胶条,300、700μg不同质量蛋白上样量,保存2个月及保存1年的标本对2-DE效果的影响。结果本研究采用裂解液及样本制备方法所得蛋白适于2-DE,海马组织总蛋白等电点(PI)主要在4～8;与300μg相比,700μg蛋白上样量对于信噪比控制效果更理想;新鲜标本中影响聚焦的物质较少,凝胶横纹少。结论新鲜海马组织匀浆经多次低温重复离心制备的蛋白,采用pH 4～7预制胶条(24 cm)及700μg上样量获得的2-DE图谱更理想。     

慢性粒细胞白血病不同病期蛋白质组分析优化策略

目的比较不同分组方法处理慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)急变前后骨髓细胞蛋白的差异表达,筛选急变相关蛋白。方法应用双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分析技术,比较急变前后三种分组方法(混合标本组、随机标本组、个体标本组)时骨髓细胞蛋白质的差异表达,并进行质谱鉴定。结果急变前后蛋白图谱匹配率在混合标本组为70.0678%;随机标本组两两配对比较,匹配率在43.2604%~58.3477%之间;个体标本组为74.0988%。混合标本组和随机标本组的相同差异蛋白点为103个,采用χ2检验P>0.05。从三组共同表达的差异蛋白中选取了20个进行质谱分析,明确鉴定出15个蛋白质。结论蛋白质组学分析中,采用骨髓细胞混合标本分组策略可获得相关差异蛋白,且可有效消除个体差异,简化实验流程。     

人绒癌耐药细胞株JAR/MTX蛋白质组双向凝胶电泳图谱的建立

目的:建立人绒癌耐药细胞株JAR/MTX蛋白质组双向凝胶电泳图谱。方法:用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养JAR/MTX细胞,胰酶消化后收集细胞,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,离心后取上清液进行双向凝胶电泳和考马斯亮蓝染色,应用PDQuest图像分析系统进行凝胶图谱分析,从凝胶图中选取1个分离较好的蛋白质点,应用四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF-MS)和数据库搜索鉴定蛋白质。结果:获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱;在17cmpH3～10IPG胶条上可分离到(810±45)个重复性及分辨率均较好的蛋白位点,蛋白斑点的匹配率为80.2%;1个蛋白点通过质谱分析和数据库检索得到了初步的鉴定。结论:建立了人绒癌耐药细胞株JAR/MTX双向凝胶电泳参考图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。     

2D-DIGE蛋白质组技术的探讨及其在微生物研究中的应用

目的:探讨双向差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)的实验方法,分析比较其优缺点,概述其在微生物研究中的应用。方法:以两株不同血清型的副溶血性弧菌为样本,通过2D-DIGE实验,得到两组蛋白质荧光染色分布图,与银染的效果比较。结果:直观的看到两株细菌的蛋白质差异,且可分析样品丰度变化。结论:该方法有一定的局限性,但却是研究蛋白质组丰度变化的强有力工具。     

药物预处理兔心肌蛋白质组双向凝胶电泳分析

目的研究药物预处理对缺血再灌注心肌保护的相关蛋白的变化。方法将9只新西兰大白兔随机分为3组(n=3):心肌缺血再灌注对照组(C组)、腺苷A1受体激动剂2-氯环戊腺苷(CCPA)预处理组(A组)和异氟醚预处理组(I组)。各组均接受左冠状动脉前降支阻断40min,开放再灌注120min。在缺血前24h:C组静脉注射NS(1ml/kg),A组静脉注射CCPA(0.1mg/kg)、I组吸入1MAC异氟醚2h。再灌注结束即刻,分别取各组缺血区心肌进行二维凝胶电泳,利用ImageMaster2D软件分析实验结果。结果A组和C组对比,有16个蛋白表达发生了显著变化;I组和C组对比,有16个蛋白表达发生了显著变化。结论这些差异表达的蛋白可能在药物预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护中发挥作用。     

终末期肾病患者血清蛋白质组二维电泳图像与正常血清蛋白图谱比较研究

目的建立和优化终末期肾病患者血清蛋白质组研究的双向电泳及相关技术,并与正常血清蛋白图谱比较。方法以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,对终末期肾病患者血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条、等电聚焦等进行条件优化。质谱鉴定有差异表达的其中4个蛋白点。结果成功获得终末期肾病患者血清蛋白质组电泳图谱,与正常者相比存在表达有明显差异的蛋白点。结论成功建立了终末期肾病患者血清蛋白质组研究的双向电泳技术平台。     

Characterisation of adsorbed anthrax vaccine by two-dimensional gel electrophoresis

The current UK anthrax vaccine is an alum precipitate prepared from static culture filtrate of the avirulent, unencapsulated Sterne strain of Bacillus anthracis. Protective antigen (PA) is regarded as the major immunogen in the vaccine and production conditions are intended to maximize the PA content. However, the precise composition of the vaccine is unknown and there are concerns that the observed side effects of vaccination may be caused by residual enzymatically active toxin components. Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) was used to define the protein components of the current UK anthrax vaccine. Consistency of composition was assessed by examining batches spanning 14 years of vaccine production. The reproducibility of the 2DGE technique was assessed by repeated analysis of selected vaccine batches. For two recently produced batches, between 86.7 and 88.8% of the spots could be matched. However, for one older batch, reproducibility of the spot pattern was considerably less, with a mean similarity of 53.4%. This difference may be explained by a change in production or because of decay during storage. Variation between the recently produced batches ranged from 72.9 to 84.3%, whereas the similarity between these and old batches was comparatively low at between 30 and 59%. Our results demonstrate that, as expected, the major antigen present in the vaccine is PA. The 83 and 63 kDa species are dominant but there are numerous lower molecular weight fragments resulting from proteolytic cleavage. In addition, we have established the presence of the toxin components, oedema factor and lethal factor, and S-layer proteins, EA1 and SAP. Mass spectrometry has also enabled us to identify several bacterial cell-derived proteins present in the vaccine, including PA, enolase, fructose-bisphosphate aldolase, nucleoside diphosphate kinase and a 60 kDa heat shock protein. The use of proteomics can provide useful information on the antigenic make up of this vaccine and the consistency of vaccine production.     

副溶血性弧菌蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的:建立副溶血性弧菌蛋白质分离的双向电泳技术。方法:分析比较两种不同的副溶血性弧菌蛋白制备方法,样品纯化后,选择不同pH范围IPG胶条,双向电泳,蓝银染色,比较图片。结果:超声裂解法效果较好且操作简便快速,提取出来的蛋白质经过纯化处理后再进行双向电泳效果较好,该细菌蛋白质点主要集中在pH4.5～5.5之间,还有部分分布在pH6～7之间。结论:建立了副溶血性弧菌蛋白质双向凝胶电泳技术,为后续研究奠定了基础。     

乳腺癌组织蛋白质样品制备及双向电泳条件的改进

目的:采用合适的裂解液和沉淀方法提取乳腺癌组织蛋白质,获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱。方法:通过不同全细胞蛋白质裂解液和不同沉淀方法提取组织全蛋白的效果比较,设计了不同的蛋白质样品制备的方法,并对2-DE的条件进行优化。结果:确定了适合乳腺癌实体瘤组织的裂解液配方(LS IV),PEG沉淀的蛋白分布较完整,沉淀效率相对较高。结论:本方法可以应用到乳腺癌组织的蛋白提取,也可对其它组织蛋白质样品的制备和双向电泳提供借鉴。     

人外周静脉血血清蛋白质双向凝胶电泳条件优化

目的优化人外周静脉血血清蛋白质的双向凝胶电泳条件。方法血清总蛋白经去除白蛋白、IgG和丙酮沉淀去盐分处理后,固相pH梯度等电聚焦(IEF)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行蛋白质电泳,对蛋白质的上样量、固相pH梯度(IPG)胶条的pH值范围、凝胶浓度、水化上样液体积和IEF程序及其参数等条件进行优化。结果将50～100μg蛋白质溶解于终体积为350μl水化上样液,应用pH4～7的IPG胶条和浓度12%的SDS-PAGE凝胶进行双向电泳,经优化电泳电流、时间等参数后,建立了合适的双向凝胶电泳条件,得到比较理想的蛋白质二维图谱。结论优化了血清蛋白质双向凝胶电泳条件,为进一步开展血清差异蛋白质组学研究奠定基础。     

胎鼠肌组织蛋白质组的双向电泳分析

目的优化胚胎鼠肌组织蛋白质组双向电泳分析方法。方法以固相pH梯度胶条等电聚焦为第1向，以十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳为第2向，对孕21d大鼠胚胎胫骨后肌总蛋白进行双向电泳，经银染或考马斯亮蓝染色，并采用ImageMaster 5．0软件分析处理。在不同的3张胶上选一对应点进行质谱分析和网络数据检索鉴定。结果获得了分辨率及重复性均较好的二维图谱。对应点质谱数一致。结论通过条件优化双向电泳结果能满足胎鼠肌组织蛋白质点分析鉴定需要。     

单细胞凝胶电泳技术及其应用进展

单细胞凝胶电泳又称彗星试验 ,是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂和碱性不稳定位点的方法 ,具有敏感、稳定、快速的优点。近些年来 ,该方法广泛应用于DNA修复、遗传毒理、环境监测和细胞凋亡的研究。本文就彗星试验结合荧光原位杂交、检测DNA碱基氧化损伤、以及在染色、玻片储存和彗星图像分析方面的进展进行了综述     

布鲁菌脉冲场凝胶电泳图谱分型方法建立

目的 建立我国95株布鲁菌的染色体DNA脉冲场凝胶电泳图谱,进行布鲁菌的分子遗传学分类鉴定。方法 选择我国不同地区、不同时限分离的布鲁菌100株(包括19株标准布鲁菌株),应用SeaKem Gold琼脂糖胶块纯化布鲁菌完整的染色体DNA,限制性内切酶XbaI消化后,进行脉冲场凝胶电泳分离(PFGE)。结果 XbaI酶切布鲁菌基因组DNA后,可产生20~500kbp范围的15~25条酶切片段,并可以在PFGE凝胶上被很好的区分开。PFGE可在种的水平上区分布菌各种标准株,76株中国分离株可被分为39种PFGE类型,并聚为4大类。PFGE与传统分型方法比较,2者的一致性达63%。结论 脉冲场凝胶电泳图谱可对布鲁菌进行遗传学分类鉴定,在布鲁菌的分子流行病学研究中具有重要意义。     

沙门菌脉冲场凝胶电泳分型与血清型的对应关系

目的分析沙门菌脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)与血清分型之间的对应关系.方法选择中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络PulseNet China沙门菌监测数据中鼠伤寒(Typhimurium)、肠炎(Enteritidis)、德尔卑(Derby)、阿贡纳(Agona)及山夫登堡(Senftenberg)前五位常见血清型菌株共1230株,进行PFGE聚类分析,以血清分型作为参照进行比对.确定这5种血清型PFGE优势带型的共有条带.结果1230株菌株中,1149株经PFGE预测的血清型与实际血清型一致,PFGE预测血清型的准确率为93.4%.5种血清型经PFGE预测的血清型阳性预测值多在90.0%以上、阴性预测值均在95.0%以上.结论PFGE聚类对5种常见血清型沙门菌血清分型具有较好的提示及验证作用.