大连市“蜱咬”患者新布尼亚病毒(SFTSV)的检测分析

目的 通过对大连市一起“蜱咬”患者流行病学调查及病原体检测,探讨新布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV)在辽宁省南部沿海地区的流行范围。方法 采用ELISA方法对“蜱咬”患者急性期血清样本及同居住地的26份非患者血清样本进行SFTSV的IgM、IgG抗体检测;采用实时荧光定量RT-PCR方法检测“蜱咬”患者血液样本SFTSV核酸;采用VERO-E6细胞对“蜱咬”患者血液样本进行病毒分离并鉴定。结果 “蜱咬”患者急性期血清样本SFTSV的IgM抗体阳性、IgG抗体阴性;26份非患者血清样本中4份SFTSV的IgG抗体阳性;“蜱咬”患者血液样本SFTSV核酸阳性;从“蜱咬”患者血液样本和体表叮咬的蜱虫中各分离出1株病毒,经SFTSV的M片段全基因测序引物测序鉴定为SFTSV。结论 “蜱咬”患者血液分离株与蜱虫分离株均为SFTSV,同源性达99.7%,该病毒是导致患者发病的重要原因。本次分离到的2株病毒与我省东部(丹东、抚顺),北部(铁岭)山区分离株遗传距离相对较远。SFTSV在正常人群中存在隐性感染者。     

河南省信阳市动物中新布尼亚病毒感染情况调查

目的 了解河南省信阳市动物中新布尼亚病毒感染情况,为研究其传播途径和防治策略奠定基础。方法 在信阳市商城县和光山县采集动物血液,应用荧光RT-PCR方法检测血液标本中是否携带新布尼亚病毒核酸,采用双抗原夹心ELISA方法检测新布尼亚病毒总抗体。结果 在调查点采集到5种动物血清标本合计312份,结果均未检测到新布尼亚病毒核酸;141份动物血清检测到新布尼亚病毒总抗体,总体阳性率为45.19%,鼠、牛、羊、猪和狗分别为1.06%,100.00%、76.27%、3.57%和75.00%,5种动物的抗体阳性率有统计学意义。结论 河南省信阳市牛、羊、狗等家养动物中存在新布尼亚病毒抗体,可能为该病毒的储存宿主。     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用

目的探讨实时荧光逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)在流感病毒检测中的应用,并比较与常规细胞培养方法的差异,以确定两种检测方法各自更适合的应用领域。方法收集烟台市两所国家级哨点医院就诊的流感样病例(ILI)咽拭子标本,应用实时荧光RT-PCR检测流感病毒核酸,阳性标本用狗肾传代细胞(MDCK)培养、分离流感病毒,比较两种检测方法的灵敏度及相关性差异。结果在617份标本中,实时荧光RT-PCR检测阳性152份,阳性率为24.64%;MDCK细胞培养法分离流感病毒79株,阳性率为12.80%。两者的阳性率差异有统计学意义(χ2=28.38,P<0.01)。结论实时荧光RT-PCR和细胞培养方法检测流感病毒具有一致的特异性。实时荧光RT-PCR可作为一种快速有效的流感病毒核酸检测法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断;细胞培养法作为流感病原学监测的基础,用于核实暴发疫情的实验室诊断,对病毒进行抗原性和基因特性分析。     

南京都市圈肾综合征出血热疑似病例血清学检测及基因亚型分析北大核心CSCD

目的通过检测肾综合征出血热疑似患者血清标本中特异性抗体和病毒基因组RNA,了解其基因型别及序列特征。方法采用胶体金法、荧光定量PCR法、巢式PCR法进行样本检测,对巢式PCR扩增后的阳性产物进行双向测序获得M基因部分片段序列,与各亚型代表株对应序列进行同源性分析并构建系统进化树,确定其基因亚型。结果122份标本中,IgM阳性27份,阳性率22.1%,IgG阳性57份,阳性率46.7%;荧光定量PCR法检测汉坦病毒核酸阳性13份,阳性率10.7%;15份样本经巢式PCR扩增测序后获得目的片段,其中13株分别属于汉滩病毒H5、H6、H9亚型和汉城病毒S3亚型,另有两株病毒株已形成新的亚型。结论南京都市圈存在汉滩病毒和汉城病毒流行,其中汉滩病毒存在多种亚型。     

定量PCR检测HCMV-DNA结合细胞培养分离病毒法诊断小儿HCMV感染

目的探讨实时荧光定量PCR检测HCMV-DNA结合细胞培养分离病毒,对诊断小儿HCMV感染的价值。方法使用实时荧光定量PCR法检测尿液HCMV-DNA与细胞培养分离尿液HCMV二种方法检测。结果（1）该实时荧光定量PCR检测HCMV-DNA体系,与相关的三种病毒（I型单纯疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒）无交叉反应,20例正常幼儿皆为阴性。（2）40例临床患儿实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA,阳性10例。其中,唇腭裂组阳性6例（6/11）,肺炎组阳性4例（4/29）,两组检出结果比较,差异有显著性（χ2=5.06,P〈0.05）,唇腭裂组阳性检出高于肺炎组。（3）40例临床患儿细胞培养法HCMV分离检测,阳性8例,其中,唇腭裂组阳性4例（4/11）,肺炎组阳性为4例（4/29）,两组检出结果比较,差异无显著性（χ2=1.21,P〉0.05）。（4）40例临床患儿,实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA与细胞培养分离病毒结果符合度比较,差异无显著性（χ2=3.33,P〉0.05）。二种方法阳性检出比较,差异无显著性（χ2=0.38,P〉0.05）。结论实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA,与细胞培养法分离病毒联合应用可提高HCMV感染诊断阳性率。     

宁夏地区病毒性脑炎中新发博尔纳病病毒感染的研究

目的 研究宁夏地区新发博尔纳病病毒(BDV)在病毒性脑炎患者中的感染状况,分析病毒株的核酸序列、编码的氨基酸序列和病毒株的系统发生.方法 套式反转录实时荧光定量PCR检测60例病毒性脑炎患者血液标本;并对前期课题组检测的59例病毒性脑炎患者中BDV p24阳性样本和本实验PCR检测阳性标本使用ELISA法检测其对应脑脊液中p40抗体,对阳性标本进行连接测序,应用MEGA和DnaSP4.0软件对测序结果与国外标准株He/80、H1766、strain V等的核酸和氨基酸序列对比分析,构建病毒基因的系统发生树.结果 PCR检测119份血标本,发现有12份标本BDV p24阳性,阳性检出率为10.08%,7份BDV p40检测阳性,阳性率为5.88%;ELISA检测脑脊液核蛋白抗体,有2份阳性,阳性检出率为1.68%.基因聚合分析显示,7份BDV阳性的核酸序列中有6份与德国马源性的He/80株同源性达100%,1份仅有1个碱基发生同义突变;转录后的氨基酸对比分析显示,7份与He/80株完全一致;重构的基因系统发生树中可见宁夏病毒性脑炎患者BDV核苷酸序列与国外标准株形成一个中国(宁夏)-德国-日本的混合支系.结论 宁夏地区病毒性脑炎患者中可能存在BDV感染,其发生可能与动物的密切接触相关,病毒在种系发生中与德国马源性He/80株有极高的同源性,推断病毒有可能从国外传入本土,不排除病毒株变异的可能.     

实时荧光PCR法与ELISA法在发热伴血小板减少综合征病例检测中的比较

目的比较实时荧光PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)在发热伴血小板减少综合征病例检测中的差异。方法对143例2011年河南省发热伴血小板减少综合征监测病例的急性期血清,分别应用实时荧光PCR法和ELISA-IgM方法进行检测,结果进行统计学分析。结果 143例病例经实时荧光PCR法检测,阳性率50.35%,经ELISA-IgM法检测,阳性率为37.76%,两种方法的检测有统计学意义(P<0.05)。对于间隔时间超过1w的病例,两种检测方法无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光PCR法更适合于发热伴血小板减少综合征病例的早期实验室诊断,ELISA方法可对发病1w以上病例的实验室诊断。     

严重急性呼吸综合征病原体的检测方法探讨

目的 在实验室建立SARS病原学检测方法。方法 采集临床诊断为SARS患者、疑似病人漱口液、用细胞培养分离,荧光定量PCR方法检测。病原体用间接免疫荧光鉴定。结果 漱口液、咽拭子液样本57份作病原体分离,阳性数5份,阳性率8.8％尸解标本7份,其中肺部组织3份、气管黏液、淋巴液、肺积液、心包液各1份。结果细胞分离到7株病原体。阳性率100％。荧光定量PCR方法检测临床确诊SARS患者标本57份,检出阳性结果38份,阳性率为66.7％。密切接触者标本14份,检出阳性结果7份,阳性率为50.0％。疑似患者标本59份中检出阳性12份,阳性率为20.3％。两种方法的比较,统计学上有显著性差异(P<0.001)。结论用荧光定量PCR方法检测SARS患者病原体敏感性高,可靠性和重复性好,优于细胞病毒分离的方法,可以作为SARS临床早期诊断和流行病学调查的重要指标之一。     

慢性乙型肝炎患者HBV DNA载量与血清IL-2、IL-6、IL-8、IL-13水平的相关性研究

目的探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血浆HBV DNA载量与乙肝血清标志物的关系及与白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素13(IL-13)含量变化的相关性。方法选取60例慢性HBV感染者(疾病组),采用免疫发光法定量检测乙型肝炎标志物;实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HBV DNA载量,并以5.0×102copies/ml为临界点分为高载量组、低载量组;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-2、IL-6、IL-8、IL-13含量;并与20名健康对照者(正常对照组)比较。结果疾病组血浆HBV DNA载量5.0×102copies/ml时,以HBs Ag、抗-HBe、抗-HBc 3项指标升高为主要表现,阳性检出率为95%,IL-2、IL-6、IL-8、IL-13水平显著高于正常对照组(P0.05);血浆HBV DNA5.0×102copies/ml时,以HBs Ag、HBe Ag、抗-HBc 3项指标升高为主要表现,疾病组阳性检出率为70%,抗-HBe阳性检出率为30%;疾病组血清IL-2、IL-6、IL-8、IL-13水平显著高于对照组(P0.05),并显著高于血浆HBV DNA低载量组(P0.05)。结论 HBV DNA载量和细胞因子水平的变化可反应机体免疫活动状况,对临床观察疗效具有重要意义。     

海南省不明原因发热病人中钩端螺旋体病的实验检测结果分析

目的了解海南省不明原因发热病人中钩端螺旋体病的感染情况。方法分别用钩端螺旋体显微镜凝集试验(MAT)、酶联免疫试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)法,检测海南省2015年全省不明原因发热病人的血标本。结果共检测标本179份,其中显微镜凝集试验检出阳性标本40份,感染率为22.35%,男性感染率为21.65%(21/97),女性感染率为23.17%(19/82);菌群中有7个群能检出,分别是问号钩端螺旋体黄疸出血群、拜伦群、秋季热群、波摩那群、流感伤寒群、赛罗群、塔拉索夫群;酶联免疫试验检测阳性38份,阳性率为21.23%,其中IgM阳性6份,检出率为3.35%,IgG阳性32份,检测率为17.88%;血清学检测结果一致。PCR法检测结果均为阴性。结论海南省不明原因发热病人中存在钩端螺旋体的感染,主要型别以黄疸出血群为主。     

基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价

目的 建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法 根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本方法进行综合评价。结果 建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性,可检测出恙虫病东方体Gilliam、Karp、Kato和Kawasaki株。建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.99),灵敏度分析显示样品最低检出浓度为21.8拷贝/μL。批内及批间重复性实验变异系数均小于1.5%,显示本方法具有良好的重复性。对本实验室保存的82份临床标本进行检测,并与常规巢式PCR方法比较,本方法检测出26份阳性标本中的25份,检出率为96.15%。结论 本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床病人及暴发疫情的实验室快速检测。     

中国云浮口岸蚊媒病毒的首次调查

目的 掌握云浮国境口岸蚊类携带重要蚊媒病毒的现状,探讨提高口岸蚊媒病毒检测有效性的方法,为预防和控制口岸蚊媒传染病的发生提供科学依据。方法 于2011年5月~11月在云浮口岸捕捉活蚊,对蚊标本研磨液提取核酸后应用多重实时荧光RT-PCR技术快速筛查蚊类携带的登革热病毒、日本脑炎(乙脑)病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒。对实时荧光RT-PCR检测核酸阳性的标本进行PCR扩增和序列分析。结果 在云浮共采集39 254只蚊虫,鉴定后分为460组。经实时荧光RT-PCR检测,14组蚊虫乙脑病毒核酸阳性,其余病毒(登革热病毒、乙脑病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒)均为阴性。PCR扩增和序列分析显示云浮乙脑病毒属于基因Ⅰ型。所捕获的三带喙库蚊的最小感染率为0.937‰比中华按蚊的0.385‰稍高。结论 本研究首次在云浮口岸进行大规模系统的蚊媒病毒调查,云浮口岸的蚊虫很可能没有携带登革热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒,但有少数蚊虫携带乙脑病毒。此次调查检出的基因Ⅰ型乙脑病毒是广东省内的首次报道,为今后蚊媒病毒的媒介监测检测工作提供了有效方法。虽然蚊虫最小感染率的差别没有统计学意义,但是蚊媒病毒病的暴发和流行风险仍然存在。     

ELISA和Realtime-PCR筛检献血员HBV感染结果分析

目的比较ELISA与Realtime-PCR检测献血员HBV感染的差异,探索准确高效的献血员筛选方法,为提高临床血源质量服务。方法采集502例献血员血样,分离血清,分别采用ELISA与Realtime-PCR方法进行HBsAg和HBV DNA双盲检测,对两法检测结果不一致的献血员2个月后随访并抽血复检。结果502例献血员中,两法初检HBV感染的一致率为97.61%（490/502）（S=5.333 3,P=0.020 9）。2个月后对检测结果不一致的12例献血员复检,有7例2种方法检查均阳性。结论2种方法的初检结果有较好的一致性,均可用于HBV感染检测。Realtime-PCR的检测效果优于ELISA。     

牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒检测结果的比较

目的检测同一牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒(BDV)p24片段,比较两者阳性率的差异。方法采用改进的荧光定量套式RT-PCR,对新疆伊犁地区圈养的100只牧羊犬外周血单核细胞(PBMC)和脑组织(BT)同时进行BDV p24基因片段的检测,并对阳性标本采用GFP-p24、pMD-19扩增后电泳验证,排除质粒污染,并克隆测序,用Fisher精确检验和χ2检验分析两者阳性率的差异。结果牧羊犬外周血单核细胞和脑组织BDV p24检测的阳性率分别为5%和9%;PBMC组和BT组BDV p24检测阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论BDV在脑内持续感染,但以RT-PCR对外周血单核细胞BDV p24片段的检测有可能替代脑组织BDV检测,作为大规模流行病学调查的手段。     

山东省首例人禽流感病例的诊断过程分析

目的对2009年1月15日山东省济南市发生的1例人禽流感病例进行实验室诊断过程分析,探讨实验检测过程中遇到的问题。方法采集病人咽拭子和呼吸道吸取物标本,利用RT-PCR和real-time RT-PCR检测病毒核酸。结果第2次采集的咽拭子标本采用H5HA引物的RT-PCR扩增呈阳性;呼吸道吸取物分别用H5NA等3对引物进行RT-PCR均阳性,real-time RT-PCR阳性。结论该患者为人感染高致病性禽流感病毒（H5N1）实验室确诊病例。呼吸道吸取物是禽流感病毒核酸检测的合适标本。     

广东首例苏里南输入性寨卡病毒感染病例的实验室检测

目的对从广州白云国际机场口岸入境的一例自苏里南归国发热人员进行寨卡病毒实验室检测。方法采集发热人员的血液和唾液样本,同时使用两种寨卡病毒实时荧光RT-PCR试剂进行寨卡病毒核酸检测。RT-PCR扩增寨卡病毒部分基因片段,并进行序列测定和同源性比较。基于扩增片段构建系统进化树,分析输入性病例的来源。结果实时荧光RT-PCR结果显示,该病例血清样本寨卡病毒核酸弱阳性、唾液样本寨卡病毒核酸阳性。RT-PCR扩增出预期大小约1.5Kb片段,测序结果表明该片段与巴西寨卡病毒株(GenBank号KX197250)相应序列的同源性为99%。系统进化树显示该病毒属亚洲谱系。结论根据患者流行病学史、临床表现和病例标本核酸检测情况,确诊该病例为广东首例从苏里南地区输入性寨卡病例。     

Dengue outbreak in Swat and Mansehra,Pakistan 2013;an epidemiological and diagnostic perspective

Objective:To High light some epidemiological,clinical and diagnostic features of dengue fever during an outbreak and the role of different diagnostic techniques to achieve the highest level of accuracy in results.Methods:Blood samples(n=323) were collected along with epidemiological and clinical data from suspected dengue patients who visited different hospitals in Swat and Mansehra district of Pakistan between May-November 2013 during a dengue outbreak.Samples were tested for the detection of viral nucleic acid by real-lime PCR.non structural protein-1(NS1antigen and IgM antibodies by ELISA.Results:Out of 323 cases with clinical dengue infection,304 were positive by one or more diagnostic parameter:201 samples were positive by real-time PCR,209 were positive by NS1 ELISA and 190 were positive by IgM antibodies.Sensitivities of real-time PCR and NS1 F.LISA were comparable for early diagnosis of dengue virus infection.IgM antibody detection assay was found useful for the diagnosis in the samples collected later than day 5 of onset.Conclusions:The use of real-lime PCR or detection of non stnictural protein NS 1 by ELISA followed by IgM antibodies detection can be recommended for early diagnosis of dengue virus infection with a high level of accuracy.