我国恶性疟原虫Pfcrt和Pfmdr1基因多态性及与氯喹敏感性关系的研究

目的了解我国恶性疟原虫分离株Pfcrt基因K76T及Pf mdr1基因N86Y和D1246Y的点突变特征及发生率,并分析上述分子标志与恶性疟原虫对氯喹敏感性的关系。方法从我国恶性疟流行区云南和海南省采集恶性疟现症患者血样,根据恶性疟原虫Pfcrt基因和Pf mdr1基因序列设计巢式PCR引物,以血样中的恶性疟原虫DNA为模板,进行巢式PCR-RFLP分析,并对部分PCR产物进行测序验证。采用世界卫生组织制定的体外微量法测定同一批血样中恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果云南、海南省恶性疟原虫Pfcrt基因K76T的突变发生率分别为86.7%和64.3%;云南、海南省恶性疟原虫Pf mdr1 N86Y突变发生率分别为46.5%和3.4%。未发现云南、海南省恶性疟原虫分离株存在Pf mdr1 D1246Y突变。体外微量测定法显示Pfcrt 76T突变发生率氯喹抗性株与敏感株间差异有统计学意义（χ^2=24.70,P〈0.01）。Pf mdr1 86Y突变发生率氯喹抗性株与敏感株间差异无统计学意义（χ^2=0.20,P=0.65）。结论在云南省和海南省现场未发现恶性疟原虫Pf mdr1 D1246Y点突变,抗氯喹恶性疟原虫的Pf mdr1 N86Y突变发生率与敏感株间无显著差异。Pfcrt K76T作为分子标志在我国恶性疟原虫氯喹抗性监测中具有应用价值。     

云南恶性疟原虫氯喹抗药性基因76位点突变研究

目的研究云南恶性疟原虫氯喹抗药性基因（pfcrt）76位点突变的情况,以及与抗药性表现型的关系. 方法应用PCR和限制性酶切片段长度分析方法,检测现症病人干滤纸血样的恶性疟原虫pfcrt基因点突变. 结果 云南省恶性疟原虫pfcrt基因76位点的突变型很高,占85.0%（51/60）;野生型和混合型较少,分别占8.3%（5/60）和6.7%（4/60）.体内法测定的氯喹抗性和敏感样本均有pfcrt76突变型;体外法测定的17份氯喹抗性样本中,有13份带有pfcrt76突变型. 结论 云南省恶性疟原虫pfcrt基因氨基酸编码76位点突变频度很高.体内和体外法测定的氯喹抗性表现与pfcrt76突变型有较高的一致性.     

2018—2019年赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫抗药性基因多态性分析

目的　调查赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫多药耐药蛋白1（Plasmodium falciparum multidrug resistance protein 1, PfMDR1）、氯喹抗性转运蛋白基因（P. falciparum chloroquine resistant transporter, PfCRT）和Kelch 13基因（P. falciparum Kelch 13, PfK13）多态性,为当地疟疾防控策略制定提供参考。方法　采集2018—2019年赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫感染者外周血样本85份,提取基因组DNA。采用巢式PCR技术扩增PfMDR1、PfCRT和 PfK13基因,对扩增产物进行DNA测序,并对基因序列进行比对。结果　赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫PfK13基因不存在已知与青蒿素抗性相关的突变;PfMDR1基因和PfCRT基因均存在不同比例抗药性突变,其中PfMDR1_N86Y、PfMDR1_Y184F和PfCRT_K76T突变率分别为35.29%（30/85）、72.94%（62/85）和24.71%（21/85）。结论　赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫PfMDR1、PfCRT基因和 PfK13基因均存在不同程度突变。     

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的 测定我国恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸富集蛋白（GARP），丝氨酸重复抗原（SERA）和裂殖子表面蛋白1（MSA1）基因序列，并进行序列分析。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增GARP，SERA和MSA1基因片段，分别插入到测序载体上进行测序。应用DNAstar软件辅助分析3种抗原基因的结构及3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。结果 恶性疟原虫FCC1／HN株GARP基因全长2263bp，编码682个氨基酸残茯，谷氨酸占23．61％，包含5个典型的氨基酸重复序列；SERA基因全长3448bp，编码995个氨基酸残基，丝氨酸含量为10．65％，包含1个连续32个丝氨酸（S）残基的序列；MSA1基因全长5085bp，编码1694个氨基酸残基，MSWA1的氨基酸序列符合MAD20特征。恶性疟原虫FCC1／HN株与3D7，FC27株GWARP的序列差异主要集中于C－末端；FCC1／HN株与FCR3，3D7，FCBR，Hondulas-1株SERA的序列差异主要集中于N－端，FCC1／HN株与MAD2，3D7，HN1，HN2，FC27，RO－71RO－33，CAMP和Palo-alto株MSA1的同源性高，K1和WELLCOME株MSA1的同源性高，各分离株MSA1的序列差异主要处于第2至16分区。结论 了解了恶性疟原虫FCC1／HN株GARP，SERA和MSA1的初级结构及其编码基因结构。恶性疟原虫FCC1／HN株与其它分离株GARP和SERA的氨基酸序列差异集中于特定区段，FCC1／HN株MSA1不同分区的氨基酸序列与其它分离株MSA1的对应序列存在不同程度的差异。     

海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的 分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1（Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征， 为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。 方法 采用巢式PCR（nested-PCR）和限制性酶切片段长度多态性（RFLP）方法， 检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织（WHO）推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。 结果 检测的36份血样中， 28份成功扩增Pfcrt基因， 导致第76位氨基酸由赖氨酸（K）变为苏氨酸（T）的突变型占64.3%， 混合型占14.3%， 野生型占21.4%； 29份成功扩增Pfmdr1基因， 导致第86位氨基酸由天冬酰胺（N）变为酪氨酸（Y）的突变型占3.4%， 混合型占6.9%, 野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示, 72.2%(26/36)分离株存在抗性。 治疗前恶性疟原虫Pfcrt 76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义（P＜0.05）， 而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 恶性疟原虫Pfcrt 基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。     

疟原虫裂殖子表面蛋白4和表面蛋白5

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白4（MSP4）和5（MSP5）及其在鼠疟原虫中的同源蛋白4／5（MSP4／5）为膜内在蛋白,其基因含2个外显子和1个内含子,编码分子量约36kDa-40kDa的蛋白。在蛋白的两端为疏水的信号肽区和GPI样区,近C端有一个EGF样结构区,含3对链内二硫键。恶性疟原虫不同株的MSP4之间可能存在散在的点突变,而MSP5则显示出极高的相似性。这些蛋白的免疫原性依赖于二硫键维系的空间构像。     

恶性疟原虫FCC—1/HN株EBA—175和HRP─Ⅱ基因片段的体外扩增与克隆

目的构建恶性疟原虫FCC—1／HN株红细胞结合抗原（EBA—175）和富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP─Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法通过聚合酶链反应（PCR）对恶性疟原虫FCC—1／HN株的EBA─175和HRP─Ⅱ基因进行体外扩增,用HindⅢ／BamHI和BamHI／EcoRI分别消化扩增产物,定向克隆pcDNA3载体,转化至感受态大肠杆菌TG1,经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定。结果从恶性疟原虫FCC—1／HN株基因组DNA中扩增出EBA—175和HRP─Ⅱ两基因片段并定向插入PCDNA3载体构建重组质粒。结论所获重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ的基因片断。     

恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdr1、Cgl基因T—A克隆及序列分析

目的：将恶性疟原虫FCC1／HN株（CQS）Pfmdrl和Cgl全基因编码区克隆入测序载体，测定其序列，为以后研究其为疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法：利用PCR扩增技术，分3个片段从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中，特异扩增Pfmdrl全基因编码序列；分2个片段特异扩增Cgl基因编码序列。扩增产物经纯化回收后，T－A克隆入测序载体pMD18-T，转化大肠杆菌（E.coli)jm109，筛选阳性克隆，并进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果：CQS FCC1／HN株Pfmdrl基因序列与CQS Fc27株同源性高，全长4248bp，编码1415个氨基酸；测得Cgl基因全长为2820bp，编码939个氨基酸，存在串联α重复序列。结论：恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdrl和Cgl全基因编码序列的测定，为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。     

输入性恶性疟原虫Pfcrt基因76位点多态性分析

目的 目的 了解输入性恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因（Pfcrt基因）K76T点突变发生情况。方法 方法 采集 2008-2012年从非洲、 东南亚等疟疾流行区回国人员恶性疟现症患者血样, 根据恶性疟原虫Pfcrt基因序列设计巢式PCR引 物, 以血样中的恶性疟原虫DNA为模板, 进行巢式PCR?RFLP分析。结果 结果 92份输入性恶性疟现症患者血样中, 突变型Pf? crt基因50份, 占54.3%; 野生型Pfcrt基因42份, 占45.7%。采自非洲国家 （尼日利亚、 赤道几内亚、 利比里亚等9国） 回国人 员的70份血样中, 野生型Pfcrt基因37份, 突变型Pfcrt基因33份, 分别占52.9%和47.1%; 采自东南亚国家 （缅甸和印度尼西 亚） 回国人员的22份血样中, 野生型Pfcrt基因5份, 突变型Pfcrt基因17份, 分别占22.7%和77.3%。不同地区回国人员Pfcrt 基因突变发生率差异有统计学意义 （χ2 = 6.12, P < 0.05）。结论 结论 来自不同流行区的恶性疟原虫分离株Pfcrt基因突变发 生率也不同, Pfcrt基因K76T位点突变检测在输入性恶性疟原虫氯喹抗性监测中具有应用价值。     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列，比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因，并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后，用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp，编码442个氨基酸。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因；序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

套式PCR检测恶性疟原虫Pfcrt基因76号编码多态性及RFLP分析

目的 检测恶性疟原虫氯喹抗性转运基因（Pfcrt)76编码多态性及其用该多态性显示恶性疟原虫对氯喹反应性进行评价。方法 用套式PCR／RFLP技术检测现场采集的滤纸血滴上恶性疟原虫crt基因76编码的赖氨酸野生型多态性及苏氨酸突变型多态性,并对恶性疟原虫的氯喹反应性进行体内法测定。结果 34份滤纸血样中,32份的恶性疟原虫crt基因76号编码为苏氨酸（突变型）,突变型比例为94．12％;34份血样中21份做氯喹抗性体内观察,该21个病例中14份血样恶性疟原虫crt基因76号编码为突变型,体内法观察同样显示恶性疟原虫对氯喹有抗性,两种方法显示恶性疟原虫对氯喹有抗性的符合率为66．67％。结论 套式PCR／RFLP检测Pfcrt基因76号编码多态性,其方法简便、快速,但其多态性对氯喹反应性的提示尚需进一步评价。     

间日疟原虫对磺胺多辛?乙胺嘧啶抗药性 相关基因的研究进展

疟疾是一种严重威胁人类生命健康的寄生虫病。磺胺多辛?乙胺嘧啶可用于儿童和孕妇疟疾间歇性预防性治疗，同时其也作为以青蒿素及其衍生物为基础的联合疗法的一种复方成分而被用于疟疾治疗。恶性疟原虫对磺胺多辛?乙胺嘧啶产生抗药性与编码二氢叶酸还原酶（DHPS）和二氢蝶酸合酶（DHFR）的基因发生点突变相关，而药物选择压力亦可导致间日疟原虫上述两个基因发生突变。本文就抗疟药磺胺多辛?乙胺嘧啶的发现、应用、作用和间日疟原虫对其抗性机制及抗性相关基因研究进展作一综述，旨在为抗疟策略的制定提供参考依据。     

恶性疟原虫云南株环子孢子蛋白部分基因的克隆和序列分析

目的：测定我国恶性疟原虫环子孢子蛋白部分基因序列，了解我国虫株与其它虫株CS蛋白基因序列的差异。方法：采用PCR方法特异性扩增CS蛋白基因片段，并将该基因片段克隆于M13噬菌体，取3个阳性克隆制备M13－CSP单链DNA，用双脱氧链末端终止法测定该基因片段核苷酸序列。应用PCGENE软件对六个虫株CS蛋白基因序列进行了一系列比较分析。结果：我国恶性疟原虫云南株（PFD－3／YN）与T4、Welcome、NF54、3D7及7G8等虫株CS蛋白基因序列有不同程度的差异，其中一个有意义核苷酸突变发生在P．fTh／Tc抗原表位区。结论：云南株与其它虫株CS蛋白基因存在差异。     

间日疟原虫对磺胺多辛?乙胺嘧啶抗药性 相关基因的研究进展

疟疾是一种严重威胁人类生命健康的寄生虫病。磺胺多辛?乙胺嘧啶可用于儿童和孕妇疟疾间歇性预防性治疗，同时其也作为以青蒿素及其衍生物为基础的联合疗法的一种复方成分而被用于疟疾治疗。恶性疟原虫对磺胺多辛?乙胺嘧啶产生抗药性与编码二氢叶酸还原酶（DHPS）和二氢蝶酸合酶（DHFR）的基因发生点突变相关，而药物选择压力亦可导致间日疟原虫上述两个基因发生突变。本文就抗疟药磺胺多辛?乙胺嘧啶的发现、应用、作用和间日疟原虫对其抗性机制及抗性相关基因研究进展作一综述，旨在为抗疟策略的制定提供参考依据。     

境外输入性恶性疟原虫抗药性相关基因突变的检测

目的了解山东省输入性恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)抗药性相关基因(Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr和K13)的突变情况。方法采集山东省2014年自非洲劳务返乡的94例输入性恶性疟患者血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,分别根据恶性疟原虫Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr和K13基因序列设计引物,进行巢式PCR扩增和测序,并对测序结果进行序列比对分析各基因的突变情况。结果94例输入性恶性疟患者自18个非洲国家劳务返乡。提取94份患者血样中的恶性疟原虫基因组DNA,除1份血样的DNA Pfcrt基因PCR扩增失败外,其余均扩增成功,并测序。结果显示,94份患者血样的恶性疟原虫Pfcrt基因K76T突变型、Pfmdr1基因N86Y突变型和Pfdhfr基因S108N突变型分别占36.6%(34/93)、21.3%(20/94)和98.9%(93/94),3种基因的突变型所占比例的差异有统计学意义(χ2=127.5,P0.05)。未检测到K13基因C580Y的突变。6份患者血样(占6.5%)的恶性疟原虫同时携带K76T、N86Y和S108N突变,其中2例自利比里亚输入,4例分别自安哥拉、赤道几内亚、刚果和几内亚输入;28份血样(占30.1%)的恶性疟原虫同时携带K76T和S108N突变,14份血样(占15.1%)同时携带N86Y和S108N突变;44份血样(占47.3%)的恶性疟原虫仅携带S108N突变;1份血样的恶性疟原虫3个基因均未发生突变。结论 2014年山东省输入性恶性疟原虫Pfcrt、Pfmdr1和Pfdhfr基因均有不同程度的突变,其中Pfdhfr基因的S108N突变型所占比例最高,未检测到K13基因的突变。     

恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ基因片段的体外扩？…

目的 构建恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株红细胞结合抗原（ＥＢＡ－１７５）和富组氨酸蛋白Ⅱ（ＨＲＰ－Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）对恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株的ＥＢＡ－１７５和ＨＲＰ－Ⅱ基因进行体外扩增，用ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨＩ和ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ分别消化扩增产物，定向克隆ｐｃＤＮＡ３载体，转化至感受态大肠杆菌ＴＧ１，经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经ＰＣＲ和     

恶性疟原虫传播阻断抗原pfs25和pfs48／45基因编码序列的体？…

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原ｐｆｓ和ｐｆｓ４８／４５的基因序列，为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件，方法：特定寡核苷酸引物的设计，合成与纯化；恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株体外培养，利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株提取染色体ＤＮＡ；ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出编码ｐｆｓ２５和ｐｆｓ４８／４５基因序列，其，中     

多重PCR技术检测恶性疟原虫抗药性相关分子标志的方法研究

目的 建立恶性疟原虫5个主要抗药性相关基因的单管多重PCR扩增方法，用于恶性疟原虫抗药性分子标志检测。 方法 依据各基因参考序列，运用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件，设计5对特异性引物，采用Hot Start Taq DNA聚合酶，设置递增延伸温度，对恶性疟原虫标准株（3D7、Dd2和HB3）、分离株（FCC1/HN、 CMH/YN）、现场标本（来源于海南、 云南和缅甸）、 近缘虫种对照（间日疟原虫、 伯氏疟原虫、 食蟹猴疟原虫、 杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫）和空白对照（以H2O为模板）进行5个抗药性相关基因（包括恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因Pfcrt、多药抗性基因Pfmdr1、二氢喋酸合成酶基因Pfdhps、二氢叶酸还原酶基因Pfdhfr和三磷酸腺苷酶第6亚基基因PfATPase6）的单管多重PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，测定扩增产物序列，并与参考序列（3D7株）比对。 结果 经电泳，恶性疟原虫标准株、分离株和现场标本的多重PCR扩增产物均可见5条目标条带。测序结果与参考序列比对，高度同源，最低同源性为98.5%。模板DNA量达0.1 ng即满足扩增要求，近缘虫种对照和空白对照未见扩增产物。 结论 多重PCR技术实现了单管1次反应完成5个抗药性相关基因的扩增，该方法灵敏，特异性好，有助于提高恶性疟原虫抗药性分子标志的检测效率。     

恶性疟原虫云南株PFD-3／YN Pfs25基因的测序及同源性分析

目的 了解恶性疟原虫云南株ＰＦＤ－３／ＹＮ ｐｆｓ２５基因序列变异情况。方法 ＰＣＲ扩增恶性疟原虫云南株ＰＦＤ－３／ＹＮ株ｐｆｓ２５全基因，经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序和ＰｓｔＩ酶切鉴定，并与国外恶性疟原虫ＮＦ４株ｐｆｓ２５进行比较。结果 恶性疟原虫云南株ＰＦＤ－３／ＹＮ株ｐｆｓ２５基因与ＮＦ４株的ｐｆｓ２５基因其同源性为９９．２％。结论 ＰＦＤ－３／ＹＮ株与ＦＮ４株ｐｆｓ２５基因表现很高的同     

恶性疟原虫海南分离株pfcrt基因同氯喹抗性的相关性分析

目的探讨恶性疟原虫海南株pfcrt基因多态性同氯喹抗性的关系。方法采集确诊恶性疟患者血样42份，应用套式PCR方法体外扩增pfcrt基因含有编码第76和356位氨基酸的基因片段，并对扩增产物进行限制性酶切分析。结果1）76位点：22个氯喹抗性虫株中有18个发生K76T突变型（81．82％），20个氯喹敏感虫株中野生型和突变型各占50％；2）356位点：所有42个样本的356位点均为野生型。结论我国海南省恶性疟原虫pfort基因的K76T突变与氯喹抗性存在一定关联，而356位点可能与氯喹抗性无关。