粪肠球菌心内膜抗原efaA基因转化株的构建及其对生物膜形成的影响

目的构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株,探讨efaA基因在肠球菌生物膜形成及感染性心内膜炎致病中的作用。方法PCR扩增粪肠球菌efaA基因,构建pAT28-efaA重组子,经PCR、双酶切及测序鉴定,将重组子转化到eraA野生株S14做为转化株（S14-pAT28-efaA）;同时将空质粒pAT28转化到野生株作为对照株（S14-pAT28）;IPTG诱导efaA表达,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。微量滴定板法测定生物膜形成能力。将s14、S14-pAT28、S14-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37℃培养24h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部在595nm的0D值,比较efaA基因转化前后的生物膜形成能力。结果成功构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株;转化株的OD595值大于野生株及空质粒转化株,P〈0．05,空质粒转化株的OD595值与野生株比较差异无统计学意义,P〉0．05。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。     

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

粪肠球菌ace阳性和阴性菌株体外生物被膜形成能力比较

目的 比较粪肠球菌ace基因阳性、阴性菌株的生物被膜形成能力,探讨粪肠球菌ace基因是否有利于细菌生物被膜的形成。方法 微量滴定板法检测46株临床分离粪肠球菌的生物膜形成能力,PCR方法检测其ace基因,比较生物膜阳性组、阴性组粪肠球菌ace基因检出率;将粪肠球菌ATCC29212(ace⁺)、野生株U8-ace^-、空质粒对照株EU8-ace^-、转化株ZU8-ace⁺接种到96孔板,培养3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,结晶紫染色,测定OD₅₇₀,微量滴定板法比较ATCC29212(ace⁺)、U8-ace^-、EU8-ace^-以及ZU8-ace⁺的生物被膜形成能力;将ATCC29212(ace⁺)、U8-ace^-、EU8-ace^-、ZU8-ace⁺在含盖玻片的细胞培养皿内培养6 h~72 h,共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察比较ace⁺、ace^-粪肠球菌形成的生物膜平均厚度和密度。结果 生物膜阳性组粪肠球菌ace基因检出率为76.67%,高于生物膜阴性组31.25%的检出率,差别有统计学意义 (χ²= 9.04,P> 0.05);微量滴定板法显示不同时间点ATCC29212(ace⁺)以及转化株ZU8-ace⁺的OD₅₇₀值都大于U8-ace^-的OD₅₇₀值,P< 0.01,而EU8-ace^-与U8-ace^-比较,OD₅₇₀值无统计学差别,P> 0.05;CLSM观测的ace⁺ 粪肠球菌在不同阶段所形成的生物膜的平均厚度、密度均高于ace^-粪肠球菌,P< 0.01,空质粒对照株与野生株比较,生物膜的厚度、密度无统计学差别,P> 0.05。结论 粪肠球菌胶原黏附素ace基因或有利于肠球菌生物被膜的形成。     

肠球菌表面蛋白基因与生物膜形成关系的探讨

目的探讨肠球菌表面蛋白（esp）基因与生物膜形成之间的关系，以利临床采取预防措施和选药治疗。方法应用PCR方法检测145株临床分离肠球菌中esp的携带率．并用斑点杂交确证。用96孔聚苯乙烯板进行生物膜形成试验。结果96株粪肠球菌和49株屎肠球菌中esp的检出率分别为34．4％和36．7％；生物膜形成率分别为93．8％和91．8％；esp阳性的肠球菌生物膜形成率为100％。结论肠球菌普遍具有形成生物膜的能力，但生物膜的形成并不仅限于携带esp的肠球菌。     

临床分离粪肠球菌和屎肠球菌菌株的检测及耐药性研究

目的分析粪肠球菌、屎肠球菌对抗菌药物的耐药性及敏感性,为合理使用抗菌药物提供证据。方法运用Phonex 100全自动微生物鉴定/药敏系统对临床分离的菌株进行鉴定和药敏试验。结果 103株肠球菌耐药率最高的药物依次为红霉素（94.2%）、环丙沙星（85.4%）、利福平（81.6%）,对万古霉素（94.2%）和替考拉宁（93.2%）的敏感性最高。发现万古霉素耐药的粪肠球菌和屎肠球菌各3株。粪肠球菌和屎肠球菌对青霉素的耐药率分别为22%和71.7%,对氨苄西林的耐药率分别为16.7%和86.8%。结论 肠球菌属总体耐药率较高,红霉素、环丙沙星、利福平对肠球菌的敏感率较低,已检测发现VRE,临床上应加强监测,并根据药敏结果、感染严重程度合理选择适当的抗菌药物。     

粪肠球菌在酒精性肝病中的研究进展

酒精性肝病(ALD)是世界范围内最常见的慢性肝病之一,包括脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化和肝硬化不同阶段。粪肠球菌是医院常见获得性感染菌群,对于酒精性肝炎患者预后具有重要影响。本篇综述重点介绍了ALD的发病因素和粪肠球菌的致病机理,总结了粪肠球菌在ALD中的研究进展,简述了临床上对于粪肠球菌感染的检测和治疗方法。由于临床上感染溶细胞性粪肠球菌的ALD患者死亡率极高,因此深入认识粪肠球菌成为当下重要问题。     

粪肠球菌和屎肠球菌的医院感染分布及耐药性

肠球菌广泛存在于自然界,可寄生于人类的胃肠道和女性生殖道,是人和动物肠道正常菌群的一部分,是仅次于葡萄球菌的重要院内感染病原菌[1],较多出现在有严重基础疾病的老年人和免疫力低下的患者中,主要引起尿路、腹腔、盆腔感染,还可引起菌血症、心内膜炎、呼吸系统感染.由于其固有的耐药性,对头孢菌素类、克林霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、低浓度的氨基糖苷类抗生素即使在体外实验可表现出敏感,但临床治疗往往无效[2],所致感染治疗困难.肠球菌属中粪肠球菌和屎肠球菌占临床分离的绝大多数[3].本文就医院感染标本中分离出的粪肠球菌和屎肠球菌的来源和耐药性进行分析,以期为临床治疗肠球菌医院感染提供参考依据.     

粪肠球菌丝氨酸蛋白酶基因突变株的构建和致病性研究

目的 构建粪肠球菌丝氨酸蛋白酶基因（sprE）突变株，并研究sprE基因的功能。方法 用自杀质粒pTX4577构建粪肠球菌基因重组自杀质粒pCQ001，通过体内同源重组，筛选获得sprE基因的突变株，体外研究不同温度和氧化条件对突变株生长能力的影响，通过小鼠腹膜炎和兔心内膜炎模型来研究突变株的毒力下降情况。结果 经同源重组，利用卡那霉素抗性筛选，PCR、脉冲场电泳和Southern印迹进行鉴定获得sprE基因突变株，命名为＊sprE，突变株在40℃的生长能力及在氧化条件下的存活率均明显低于野生株。在小鼠腹膜炎模型中，存活率明显高于野生株，差异有统计学意义（P〈0．01），引起的兔心内膜炎也较野生株轻，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 sprE基因突变株＊sprEgg建成功，sprE基因在粪肠球菌致病中起重要作用，可能是粪肠球菌的毒力因子之一。     

粪肠球菌主要毒力因子研究进展

粪肠球菌为条件性致病菌,是许多国家医院内感染的主要病原菌,也是一种新的人畜共患病病原体。粪肠球菌感染和致死主要是由其毒力因子引起的,本文概述了粪肠球菌主要毒力因子尤其是溶血素的研究进展,为粪肠球菌致病机制的研究奠定基础。     

粪肠球菌溶血素cylL基因的原核表达

目的克隆表达粪肠球菌溶血素cylL基因,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增溶血素cylL基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET42a中,构建pET-cylL重组质粒。将pET-cylL质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经KpnI、XhoI酶切及测序鉴定,以IPTG诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果PCR体外扩增cylL基因产物约206bp,成功构建了重组表达质粒pET-cylL;SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为39.6kD。结论成功构建粪肠球菌溶血素cylL基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

日本血吸虫成虫自发荧光观察及共聚焦λ扫描分析

目的研究日本血吸虫成虫自发荧光现象及共聚焦λ扫描特点,丰富日本血吸虫生物学和光谱学信息。方法小鼠感染日本血吸虫尾蚴6周后剖杀,收集成虫于无菌生理盐水中并分离雌雄虫体。荧光显微镜下分别以紫外光、蓝光、绿光等不同激发光源激发观察虫体自发荧光;激光共聚焦扫描显微镜下分别以405nm、458nm、476nm、488nm、514nm、543nm、633nm等7种激发光激发雄虫口吸盘部做自发荧光λ扫描分析。结果不同激发光照射下日本血吸虫虫体能发出多种不同颜色的自发荧光,以蓝光激发的黄绿色荧光效果最佳,虫体大体结构清晰;λ扫描分别以405nm、488nm、514nm和543nm激发光激发样品,相应敏感的发射波长分别为490-510nm、550-570nm、560-580nm和590-600nm,其中488nm和514nm激发效果较好。458nm、476nm、633nm激发效果欠佳。结论荧光显微镜下可观察日本血吸虫成虫自发荧光,最佳模式是以蓝光激发观察黄绿色荧光;日本血吸虫雄虫自发荧光光谱较宽,主要分布于500-600nm;488nm和514nm为较适宜的激发波长。     

铜绿假单胞菌生物膜形成过程观察

目的观察铜绿假单胞菌实验室保存株与临床分离的菌株体外细菌生物膜的形成过程。方法通过FITC标记的刀豆球蛋白(FITC-ConA)和碘化丙啶(PI),结合激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)摄取生物膜形成阶段不同层面的图片。结果培养3 d后可观测到生物膜中的多糖开始形成,培养第7 d,多糖基质逐渐增多,细菌趋向化聚集,膜结构致密,其内部存在相互交通的间隙及孔道;CLSM结合FITC-ConA和PI标记,实现了对铜绿假单胞菌菌株生物膜动态形成过程的观察。结论铜绿假单胞菌生物膜可在体外支持物上形成并成熟;临床新分离株较实验室保存株更易形成生物膜。     

粪肠球菌感染抗菌药物联合应用的体外效应研究

目的　评价万古霉素、奈替米星、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星 6种抗菌药物分别与第一代头孢菌素头孢硫脒联合用药 ,对于临床分离的粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis,Ef)的体外联合抗菌效应。方法　采用棋盘法设计 ,微量肉汤稀释法测定。测定不同浓度组合的 6组抗菌药物对 30株临床分离的革兰阳性球菌的最低抑菌浓度 ,并计算FIC指数。FIC≤ 0 .5为协同作用 ,0 .5 2为拮抗作用。结果　头孢硫脒对粪肠球菌的MIC50 为 2～ 8mg L ,与万古霉素、奈替米星、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星联合应用后 ,其MIC50 分别显著地降低至 0 .1 2 5 ,0 .2 5 ,0 .2 5 ,0 .2 5 ,0 .2 5 ,0 .2 5mg L。FIC指数分布 :FIC≤ 0 .5占 50 %～ 86 .7% ;0 .5 2为 0。结论　 6种抗菌药物与头孢硫脒分别联合用药后 ,对粪肠球菌基本表现为协同作用和相加作用 ,并以协同作用为主 ,无关作用较少 ,无拮抗作用     

Effect of Bacillus subtilis,Enterococcus faecium,and Enterococcus faecalis supernatants on serotonin transporter expression in cells and tissues

BACKGROUND Bacillus subtilis(B.subtilis),Enterococcus faecium(E.faecium),and Enterococcus faecalis(E.faecalis)are probiotics that are widely used in the clinical treatment of irritable bowel syndrome(IBS).Whether the supernatants of these three probiotics can improve gastrointestinal sensation and movement by regulating the serotonin transporter(SERT)expression needs to be clarified.AIM To investigate whether B.subtilis,E.faecium,and E.faecalis supernatants can upregulate SERT expression in vitro and in vivo.METHODS Caco-2 and HT-29 cells were stimulated with probiotic culture supernatants for 12 and 24 h,respectively.A male Sprague-Dawley rat model of post-infectious irritable bowel syndrome(PI-IBS)was established and the rats were treated with phosphate-buffered saline(group A)and three probiotics culture supernatants(groups B,C,and D)for 4 wk.The levels of SERT were detected by quantitative PCR and western blotting.RESULTS The levels of SERT at post-treatment 12 and 24 h were significantly elevated in Caco-2 cells treated with B.subtilis supernatant compared with those in the control group(aP<0.05).Those levels were markedly upregulated in Caco-2 cells stimulated with E.faecium and E.faecalis supernatants at 24 h(aP<0.05).In addition,SERT expression in groups B,C,and D was significantly higher than that in group A in the 2nd wk(aP<0.05).Increased SERT expression was only found in group D in the 3rd wk(aP<0.05).However,there was no significant difference in SERT expression between the groups in the last week(P>0.05).CONCLUSION The supernatants of B.subtilis,E.faecium,and E.faecalis can upregulate SERT expression in intestinal epithelial cells and the intestinal tissues in the rat model of PI-IBS.     

利奈唑胺体外诱导粪肠球菌耐药株23S rRNA V区基因突变位点分析

目的阐明体外诱导利奈唑胺耐药粪肠球菌的核糖体23SrRNA V区基因位点变异特征。方法收集1株血流感染的粪肠球菌和1株粪肠球菌质控菌ATCC29212（编号分别为F3和F4菌株,均为利奈唑胺敏感株）,通过体外浓度倍增法诱导利奈唑胺耐药;挑取单克隆,经E-test条测定MIC值,获得各菌株的耐药浓度梯度;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增23SrRNA V区基因,扩增产物经测序后与野生株比较,获得V区的突变位点。结果经体外多步法诱导利奈唑胺耐药的不同MIC值粪肠球菌共13株。PCR测序分析2株母株均无变异位点,23SrRNA V区的突变位点主要是G2576U,此外还有T2504A、G2505A、C2610A、C2424U。结论体外多步法可诱导粪肠球菌利奈唑胺耐药,耐药机制与23SrRNA V区位点突变密切相关,突变位点随着MIC值的增高而增多。