MOLECULAR CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF THE IMMUNOGLOBULIN LIGHT CHAIN VARIABLE REGION GENE OF A MURINE ANTI-HUMAN C1-INH IgG

获得抗体的可变区基因是由鼠源性ＭｃＡｂ制备重组抗体的前提，本实验合成与轻链可变区（ＶＬ）ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出Ｆ７ＶＬ的ｃＤＮＡ片段，并将其克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两端进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＬｃＤＮＡ是由３０３个碱基组成，编码１０１个氨基酸残基。由国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现：Ｆ７ＶＬ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＬ基因特征，同源性为６０％～８０％。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＬ基因推导的氨基酸序列应归属于小鼠Ｉｇ的ＶＬ基因ＩＶ亚组，是由Ｖｋ－Ｊｋ１重排产生。ＣＤＲ３含有９个氨基酸残基，其中含３个不相同氨基酸残基，ＶＬ大多数的氨基酸变化集中在ＦＲ１和ＣＤＲ１区，Ｆ７ＶＬ符合ＩｇＶＬ氨基酸残基变化的基本特征。Ｃｙｓ２３和Ｃｙｓ８８残基位于Ｆ７ＶＬＣＤＲ１和ＣＤＲ３的起始点，与二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＬ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下了良好的基础。     

编码人分化抗原5C5全长cDNA的克隆及功能初探

目的 编码５Ｃ５分化抗原全长ｃＤＮＡ的克隆及功能探索。方法 构建人活化Ｂ细胞株３Ｄ５细胞的λｇｔ１１ ｃＤＮＡ文库，以核苷酸杂交法从ｃＤＮＡ文库中筛选阳性克隆、作核苷酸序列分析，编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ测５Ｃ５ ｍＲＮＡ转录本长度，用ＲＴ－ＰＣＲ检测５Ｃ５ ｍＲＮＡ在不同细胞株的表达，观察单抗５Ｃ５－Ｇ１对３Ｄ５细胞增殖的影响。结果 从人活化Ｂ细胞株３Ｄ５的λｇ     

人脑源神经营养因子基因cDNA的克隆

为研究人脑神经营养因子（ＢＤＮＦ）的生物特性，必须先着手克隆人ＢＤＮＦ基因。作者以人胎脑ｃＤＮＡ为模板，采用ＰＣＲ法得到ＢＤＮＦ基因ｃＤＮＡ探针，标记该探针进一步筛选人胎盘ｃＤＮＡ文库，获得１个１３３５ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆ＨＵＭＢＤＮＦＤ。序列测定和分析表明，该克隆含有全长ＢＤＮＦ基因ｃＤＮＡ，基编码区及３′端非编码区与已发表的３个人ＢＤＮＦ基因序列完全同源，而其５＇端非编码区的序列与后三者均有差异，推测可能与组织特异性有关。     

CLONING AND SEQUENCE CHARACTERIZATION OF THE RE-ARRANDED VH GENE FROM HYBRIDOMA CELLS SECRETING ANTI-HUMAN C1-INHIBITOR McAb

由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，合成与ＶＨ基因ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，以ＲＮＡ反转录合成的第一链ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ法克隆出Ｆ７ＶＨ基因的ＤＮＡ片段。将分离获得的目的ＤＮＡ片段亚克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两头进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＨ基因是由３３３个碱基组成，编码１１１个氨基酸残基。通过国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现，Ｆ７ＶＨＤＮＡ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因特征；同源性为６０％～８５％，应归属于Ｉｇ的ＶＨ基因。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＨ基因推导的氨基酸顺序属于小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因的Ⅱ（Ａ）亚组，是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３重排产生；其框架区的９和６７位点为脯氨酸（Ｐｒｏ）和赖氨酸（Ｌｙｓ）（非芳香族氨氨酸），符合Ⅱ（Ａ）亚组框架残基结构模式；其ＣＤＲ３区含有７个氨氨酸残基，表明Ｃ１－ＩＮＨ抗原表面结构并不复杂；ＦＲ２和ＦＲ３的２２和８９位点为半胱氨酸残基（Ｃｙｓ），与ＶＨ片段二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＨ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下良好的基础。     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1529bp cDNA的核苷酸序列分析

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－Ｋ５的大片段经直接自身环化，小片段与质粒载体ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ重组，构建测序用的亚克隆。用双链双脱氧末端终止法测各亚克隆的核苷酸序列，再拚接出全长为１５２９ｂｐ的３Ｄ５－５ｃＤＮＡ全长序列。与国际基因库资料比较，未见有相同的序列。此ｃＤＮＡ中有一个长４６５ｂｐ（从５４０ｂｐ－１００４ｂｐ）的ＯＲＦ，编码１５４个氨基酸的蛋白质。此蛋白质中有二个疏水区（第１～３４位氨基酸及第７９～１０９位氨基酸），提示它可能属Ⅰ类穿膜蛋白。     

用标记磁微粒技术克隆牛CD14基因

为获得牛ＣＤ１４ 的全长编码基因，以探讨牛ＣＤ１４ 基因结构与功能的关系，进一步阐明其作用机理，我们用抗牛ＣＤ１４ 的单克隆抗体（ｍＡｂ）ＣＣＧ３３ 标记的磁微粒作为探针，从转染有牛肺泡巨噬细胞ｃＤＮＡ文库的ＣＯＳ７细胞中进行筛选。并对获得的牛ＣＤ１４ ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。结果表明，牛ＣＤ１４ 基因全长为１１２２ ｂｐ，共编码３７３ 个氨基酸，其中含有信号肽序列和３ 个可识别的Ｎ连接糖基化位点，但缺少穿膜结构域及细胞内区。证实牛ＣＤ１４ 以糖基磷脂酰肌醇（ＧＰＩ） 锚定在靶细胞膜上；其氨基酸序列与人和小鼠ＣＤ１４ 的同源性分别为７３－５ ％ 和６１－４ ％ ，三者共有的保守序列约为５５％ 。     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1…

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌ ｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ的大片段经直     

中华鳖MHC Iα2链基因克隆及序列分析

目的：为了探明中华鳖ＭＨＣ的结构与功能和寻找该种群的分子标记，对中华鳖ＭＨＣｃｌａｓＩα２基因中由两个半胱氨酸形成二硫键的区域进行了克隆和序列分析。方法：根据人和动物的ＭＨＣＩａα２链中两个半胱氨酸侧翼的保守序列设计了混合型引物，采用ＰＣＲ法从中华鳖基因组ＤＮＡ中克隆了ＭＨＣＩα２链（ＴｒｓｉＢＸ１）。结果：经氨基酸序列的同源性分析，ＴｒｓｉＢＸ１存在抗原多肽结合位点（Ｔ１４３、Ｋ１４６、Ｗ１４７、Ｙ１５９）以及β２微球蛋白结合位点（Ｑ１１５、Ａ１１７、Ｄ１１９、Ｇ１２０、Ｄ１２２），并与人和动物的ＭＨＣＩａα２存在４１１％～６３９％同源性。结论：ＴｒｓｉＢＸ１属ＭＨＣｃｌａｓｓＩａ类基因，可作为中华鳖种群的分子标记。     

氧化低密度脂蛋白新基因OLRG-1的克隆及组织分布

用改进的差异显示反转录－ＰＣＲ技术，从血管内皮细胞中获得了一个氧化低密度脂蛋白诱导差异表达的ｃＤＮＡ片段。以此片段为探针，从人主动脉ｃＤＮＡ文库中筛选了一个新的全长ｃＤＮＡ。其核苷酸总长４１３７ｂｐ，编码６４２个氨基酸的蛋白质。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞后，该基因表达减低了３倍，基因定名为ＯＬＲＧ－１。ＯＬＲＧ－１为一多组织表达的基因，与人ＮＳ１－ＢＰ基因高度同源，氧     

B细胞活化基因的研究Ⅰ．人活化B细胞cDNA文库的构建

本文报导以人活化Ｂ淋巴细胞的３Ｄ５细胞的ｍＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ的第一链：按常规的自身引物法，以合成的第一链为模板合成ｃＤＮＡ第、二链；以及λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ噬菌体为载体，定向插入构建了人活化Ｂ细胞。ＤＮＡ表达文库。该文库的大小为２．５×１０６ｐｆｕ，插入片段长度大于１ｋｂ；用抗ＣＤ７１及ＣＤ９８单克隆抗体为探针，对所构建的文库进行筛选，均获得了阳性克隆，ＣＤ７１及ＣＤ９８均为人Ｂ细胞活化时才得以表达的分化抗原，从而证明，新构建的ｃＤＮＡ文库是人活化Ｂ细胞的ｃＤＮＡ表达文库。