三种细胞在脊髓灰质炎病毒检测中的特点观察

目的:运用RD、Hep-2及L20B细胞进行脊髓灰质炎病毒(简称脊灰)的分离鉴定.方法:使用WHO推荐的3种细胞对脊灰病毒分离鉴定.结果:L20B细胞对脊灰病毒具有良好的特异性,对非脊灰肠道病毒不敏感.在脊灰分离株和粪便悬液标本中脊灰病毒的检出率为100%,优于RD用Hep-2细胞.结论:L20B细胞对脊灰病毒有较强的特异性和敏感性.     

河北省2016—2021年脊髓灰质炎实验室细胞系质量监测与分析

目的 通过监测与分析河北省疾病预防控制中心脊髓灰质炎(简称“脊灰”)实验室2016—2021年使用的人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma, RD)细胞系和转人脊灰病毒受体基因的鼠肺细胞(mouse L cells expressing the human Poliovirus receptor, L20B)系质量,确保检测脊灰病毒和非脊髓灰质炎肠道病毒(non-polio Enteroviruses, NPEV)的敏感性,为维持无脊灰状态提供可靠的技术保证。方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)法对所用的RD细胞系和L20B系进行支原体检测(Mycoplasma detection);采用96孔微量培养板病毒滴定法对RD细胞系和L20B系进行细胞敏感性(cell sensitivity, CS)监测。结果 2016—2021年RD细胞系和L20B系支原体检测结果为阴性。与河北省脊灰实验室质量控制(laboratory quality control, LQC)株比较,RD细胞系和L20B系滴度波动范围为±0.5log...     

RD、Hep-2、L20B细胞用于脊髓灰质炎病毒学监测的实验研究

目的：观察RD、Hep—2和L20B用于脊髓灰质炎病毒学常规监测的实验结果，提高脊髓灰质炎病毒的检出率。方法：对RD、Hep—2和L20B用于脊髓灰质炎病毒监测进行了实验研究。用细胞培养法进行病毒分离。结果：L20B细胞对脊髓灰质炎病毒具有较强的敏感性和特异性，但非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)在RD细胞上呈选择性增值，可能会造成NPEV检出率下降。结论：RD、HeP—2和L20B细胞可用于脊髓灰质炎病毒学常规监测。     

青海脊髓灰质炎实验室2016-2017年细胞敏感性监测结果分析

目的通过对青海省脊髓灰质炎(脊灰)实验室2016-2017年两年的细胞敏感性(cell sensitivity,CS)监测结果进行分析,评估其在脊灰实验室检测质量控制中的重要作用。方法统一使用96孔微量板病毒滴定法在表达脊灰病毒受体的小鼠肺(Mouse Lung Cells that Express Receptors for Human Polioviruses,L20B)细胞和人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞上对Ⅰ型及Ⅲ型,两个型别的脊灰病毒的敏感性进行检测。结果 2016-2017年共开展8次常规CS监测并按时向国家脊灰实验室上报结果,CS监测结果显示青海省脊灰实验室的实验室质量控制(Quality control of laboratory,LQC)株滴度均在正常范围±0. 5logCCID50/0. 1 ml波动。结论青海省2016-2017年脊灰实验室所用的L20B和RD细胞对脊灰病毒敏感性处于正常范围内。CS监测作为中国脊灰实验室网络(Chinese Poliomyelitis Laboratory Network,CPLN)质量控制的重要指标,保证了实验室检测脊灰病毒的敏感性。     

河北省脊髓灰质炎疫苗免疫策略调整后急性弛缓性麻痹病例病原学监测分析

目的分析河北省脊髓灰质炎(简称脊灰)疫苗免疫策略调整后对急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例报告及病例粪便标本中脊灰病毒分离状况的影响,为制定科学合理的脊灰疫苗免疫策略提供科学依据。方法采用L20B、RD细胞对AFP病例粪便标本进行病毒分离,应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法对L20B阳性分离物进行型内鉴定(intratypic ifferentiation,ITD)及疫苗衍生脊灰病毒(vaccine-derived poliovirus,VDPV)筛查,脊灰病毒(PV)送国家脊灰实验室进行序列测定。结果 2017-2018年共报告488例AFP病例,采集967份粪便标本;14天内双份合格粪便标本采集率96.19%,14天内病毒分离结果及时报告率97.67%;7天内L20B阳性分离物ITD及时率100.00%。967份粪便标本中L20B阳性7份,经ITD检测均为PV,PV分离率为0.72%;967份粪便标本中非脊灰肠道病毒(non-polio enterovirus,NPEV)阳性100份,NPEV分离率10.34%。PV均进行VDPV筛查和VP1区核苷酸序列测定,均为脊灰疫苗类似株,但VP1区核苷酸序列显示均有不同程度变异。结论河北省2017-2018年脊灰疫苗策略调整后AFP病例中PV分离率有下降趋势,分离的PV以Ⅲ为主,VP1区核苷酸变异以低变异为主,均为疫苗类似株,未发现脊灰野病毒(wild poliovirus,WPV)、VDPV和Ⅱ型毒株,河北省继续维持无脊灰状态。     

宁夏回族自治区2000-2005年急性弛缓性麻痹病例病原学监测结果分析

目的了解宁夏2000-2005年急性弛缓性麻痹(AFP)病例及其他健康人群肠道病毒病原学监测结果。方法对采集的粪便标本利用L20B及RD细胞进行病毒分离,阳性标本用脊灰标准诊断血清定型。结果AFP病例及其他健康人群脊灰病毒(PV)分离率分别为8.33%和1.61%,非脊灰肠道病毒(NPEV)分离率分别为13.33%和15.20%。结论我区AFP病例的病原学监测结果运行良好。在所有人群中分离到的23例PV株经国家脊灰实验室进行型内鉴定均为疫苗株,表明我区未发现脊灰野毒株和疫苗衍生株病例。     

复方金钱草清热颗粒对柯萨奇病毒体外抑制作用的研究

目的：研究复方金钱草颗粒冲剂对柯萨奇B组病毒致人喉癌细胞（Hep-2）细胞病变是否有抑制作用。方法：①Hep-2细胞感染病毒的同时给药;②Hep-2感染病毒2h后再给药;③药物与病毒作用2h后再感染Hep2细胞。结果：复方金钱草清热颗粒对柯萨奇病毒段、B5致Hep-2细胞病变有抑制作用,同时对CBVs的抑制作用明显优于CBV3。结论：金钱草对柯萨奇病毒有体外抑制作用。     

湖南省2003年急性弛缓性麻痹病例病毒学监测结果分析

目的 总结分析湖南省急性驰缓性麻痹(AFP)病例病毒学监测结果，为我省维持无脊髓灰质炎状态提供科学依据。方法 采集AFP病例双份粪便标本，接种L20B、RD两种细胞进行病毒分离；阳性毒株采用微量中和实验进行型别鉴定；脊灰(PV)阳性毒株送国家脊灰实验室进行型内鉴别。结果 湖南省2003年共报告AFP病例199例，采集粪便标本199例，病毒分离阳性45例。其中脊灰病毒21例，非脊灰肠道病毒(NPEV)24例。所有PV毒株经国家脊灰实验室鉴定，除一株为I型疫苗变异株外，其余均为疫苗相关株。     

黄芩素对喉癌Hep-2细胞增殖的抑制作用

目的：探讨黄芩素对人喉癌Hep-2细胞的增殖抑制作用。方法：Hep-2细胞在含黄芩素（10~80μmol/L）的培养基中,分别培养24 h及48 h,用MTT法检测对细胞增殖的影响;用台盼兰染色法检测对细胞活力的影响;用吖啶橙染色法（AO染色法）检测对细胞形态的影响。结果：黄芩素呈时间-剂量依赖性的抑制Hep-2细胞的增殖,并可使细胞活力明显降低;AO染色法显示,黄芩素可诱导Hep-2细胞形态发生明显变化,呈凋亡形态。结论：黄芩素可抑制喉癌Hep-2细胞增殖,降低细胞活力,诱导喉癌Hep-2细胞呈典型的凋亡形态。     

天花粉蛋白诱导Syk(L)基因去甲基化抑制喉癌Hep-2细胞生长研究

目的 探讨天花粉蛋白通过全长型脾络氨酸激酶[full-length form of spleen tyrosine kinase,Syk（L）]基因去甲基化途径恢复Syk（L）表达对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭迁移的的抑制作用。方法 采用CCK-8法及Transwell实验检测不同浓度天花粉在不同时间点对Hep-2细胞增殖及处理72h后细胞侵袭迁移能力的影响;采用MS-HRM法、Q-RT-PCR及Western blot法检测不同浓度天花粉蛋白对Hep-2细胞Syk（L）基因甲基化水平及其表达的影响。结果 CCK-8结果显示,天花粉蛋白对喉癌Hep-2细胞的增殖有抑制作用,且呈浓度、结果时间依赖性;Transwell结果显示,天花粉蛋白能显著抑制Hep-2细胞的侵袭迁移能力;MS-HRM结果显示,天花粉蛋白可以逆转Hep-2细胞Sky（L）基因的高甲基化状态,恢复Syk（L）mRNA及蛋白的表达。结论 天花粉蛋白通过逆转Syk（L）基因启动子CpG岛的甲基化状态,使喉癌Hep-2细胞中Syk（L）基因表达活化,恢复Syk mRNA及蛋白的表达,最终发挥抑癌基因的作用抑制Hep-2细胞恶性生物学行为,具有开发并成为抗肿瘤药物的潜在价值。     

阿昔洛韦抗柯萨奇病毒B3作用的初步观察

目的观察阿昔洛韦抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用.方法通过活细胞计数评价阿昔洛韦对Hep-2细胞的细胞毒作用;通过观察病毒感染后的细胞病变效应计算病毒抑制率,评价阿昔洛韦在Hep-2细胞培养中的抗CVB3作用.结果阿昔洛韦对Hep-2细胞的半数细胞毒性浓度(TC50)在0.2mg/mL以上;CVB3的半数抑制浓度TC50为25μg/mL,治疗指数为8.4.结论阿昔洛韦安全性较高并能有效地抑制柯萨奇病毒B3在Hep-2细胞中的增殖.     

肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体与放、化疗联合应用诱导喉癌Hep-2细胞凋亡途径研究

 目的 探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TRAIL）诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的敏感性及其与放、化疗联用时的凋亡途径。方法 采用CCK-8法检测TRAIL、顺铂、紫杉醇作用下Hep-2细胞生长抑制率;流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡率;Western blot法检测Hep-2细胞内caspase蛋白表达变化。结果 Hep-2细胞对TRAIL诱导的凋亡不敏感,24 h IC₅₀为596. 92 μg/L;顺铂、紫杉醇、放射线与TRAIL联合应用时Hep-2细胞凋亡率显著高于单药应用（P＜0.05）;caspase-9抑制剂Z-LETD-FMK使TRAIL、顺铂、紫杉醇对Hep-2细胞的生长抑制率显著下降（P＜0.05）;联合用药组caspase-8,caspase-9表达量均有显著升高（P＜0.05）。结论 人喉癌Hep-2细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡不敏感,TRAIL通过内源性途径诱导Hep-2细胞凋亡;活化后的caspase-9、caspase-3通过环状反馈作用激活caspase-8,增强了Hep-2细胞对TRAIL的敏感性,是联合用药对Hep-2细胞发挥协同效应的机制之一。     

青海省2008-2010年AFP病例和健康儿童NPEV监测分析

目的对青海省2008-2010年急性迟缓型麻痹(AFP)病例和健康儿童非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)监测结果进行分析。方法按WHO规定的方法对青海省2008-2010年AFP病例监测系统报告的所有病例和393份健康儿童的粪便标本均采用RD、Hep-2和L20B细胞进行病毒分离,对分离到的NPEV进行型别鉴定。结果 3年共分离到86株NPEV,分别为柯萨奇B组病毒(COXB)12株、埃可病毒(ECHO)42株、不能定型32株。结论青海省2008-2010年分离到的NPEV主要为埃可病毒,未分离到柯萨奇A组病毒。     

雷帕霉素对缺氧条件下 Hep-2细胞增殖及 VEGF、HIF-1α表达的影响

目的：探讨雷帕霉素对缺氧条件下人喉癌Hep-2细胞增殖及VEGF、HIF-1α表达的影响。方法：在缺氧条件下,采用MTT法检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理12、24、36、48、60、72 h后Hep-2细胞的增殖活性,ELISA检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理24 h细胞培养上清液VEGF蛋白含量的变化,Western blot 检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理16 h细胞HIF-1α蛋白表达的变化。结果：缺氧条件下雷帕霉素对Hep-2细胞仍具有明显的增殖抑制作用,且呈浓度和时间依赖性（F浓度＝253．132,F时间＝213．945,P＜0．05）。缺氧条件下雷帕霉素可抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达（F＝7．045、16．218,P＜0．05）。结论：雷帕霉素可抑制缺氧条件下Hep-2细胞的增殖,其机制可能与抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达有关。     

水中脊髓灰质炎病毒细胞感染模型中病毒株与细胞株的筛选

目的：根据5种细胞系对脊髓灰质炎病毒1型（PV1）5个毒株的敏感性筛选适用于病毒消毒实验的病毒株和细胞系．方法：比较各毒株在不同细胞系中增殖3d～7d后的细胞病变作用（CPE）、半数组织培养感染里（TCⅡ）50）、蚀斑计数（PFU）及免疫印迹（DIBA）试验结果．结果：CPE与TCID）检测表明，同一细胞系Hep2和Hela中病毒感染细胞作用强弱为Henan，Hebei＞Brunhide，Mahony＞Sabin株；不同细胞系对同一病毒株的敏感性为Hep－2＞BGM＞Hela,Vero＞RD细胞．DBA检测提示，Henan株较Brun－hide更易检出．结论：Henan株及Hep－2细胞可作为PV消毒实验所用的病毒和细胞．     

2015年河北省急性弛缓性麻痹病例中脊髓灰质炎病毒监测结果分析

目的检测分析急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例及其密切接触者脊髓灰质炎(脊灰)病毒,为河北省继续维持"无脊灰野病毒状态"提供理论依据。方法收集2015年河北省15岁以下急性弛缓性麻痹(AFP)病例及其密切接触者粪便标本,采用L20B和RD细胞,按照《WHO脊髓灰质炎实验室手册第4版》操作规程进行脊灰病毒阳性检测,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增VP1区基因片段并进行核苷酸序列测定和分析。结果从采集的303例AFP病例中共检出脊灰阳性7例,分离率为2.31%,分离到非脊灰肠道病毒(non-polio enterovirus,NPEV)59株,分离率为19.47%。与Sabin株相比,脊灰病毒VP1区核苷酸发生0个变异的有3株,发生1个变异的有6株;NPEV的分离以6~9月较多,占全年总数的64.41%。结论 2015年河北省脊灰实验室各项监测指标均符合WHO认证要求,脊灰病毒型别以Ⅰ型为主,VP1区核苷酸以低变异为主,均为脊灰疫苗相关株,NPEV呈夏秋季感染高峰。     

海南省2005～2009年急性弛缓性麻痹病例病原学监测分析

目的分析海南省2005—2009年急性弛缓性麻痹（AcuteFlaccidParalysis,FP）病例及其密切接触者病原学监测结果,为维持无脊髓灰质炎（脊灰）状态提供病原学依据。方法按照世界卫生组织（WHO）规定的方法,用RDa和L20B细胞对AFP病例及其密切接触者的粪便进行病毒分离和鉴定。结果2005～2009年从AFP病例及其密切接触者966份粪便标本中分离到33株脊髓灰质炎病毒（PV）毒株,非脊灰肠道病毒（NPEV）196株;33株PV毒株中PVI型8株、PVⅡ型6株、PVⅢ型5株、PV混合型（Pmix）13株、PV＋NPEV混合株1株。所有PV毒株经中国疾病预防控制中心国家脊灰实验室进行型内鉴定,均为脊灰疫苗相关株。结论海南省2005～2009年AFP病例及其密切接触者中未发现脊灰疫苗衍生毒株（VDPV）,且脊灰实验室监测系统各项监测指标都达到WHO的标准,表明海南省AFP病例的病原学监测敏感、高效。     

下调53BP1基因表达对喉部鳞癌细胞放射增敏作用的研究

目的 利用RNA干扰技术下调喉部鳞癌Hep-2细胞株P53结合蛋白1基因（53BP1）的表达,观察其对肿瘤细胞周期及放疗敏感性的影响。方法 构建53BP1短发夹RNA（shRNA）重组质粒,然后转染Hep-2细胞株,构建稳定低表达53BP1的Hep-2细胞系,通过Western blot检测转染空载质粒的Hep-2细胞（NC）、野生型Hep-2细胞（未转染,Hep-2组）和稳定转染下调53BP1表达的Hep-2细胞组（P6组）细胞53BP1蛋白的表达水平,MTT法检测转染对细胞正常情况下增殖的影响,通过流式细胞术检测经放射线照射后的细胞周期分布,并采用克隆形成实验检测下调53BP1表达的Hep-2细胞系对放射的敏感性变化。结果 成功构建了稳定低表达53BP1的Hep-2细胞株P6,Western blot显示P6组Hep-2相较野生型Hep-2细胞中53BP1蛋白水平下降（P<0.05)。MTT结果示下调53BP1蛋白表达并未影响细胞正常的生长。P6组下调53BP1后,经不同剂量放射后G2/M期周期阻滞较NC组和野生型Hep-2细胞减弱（P<0.05）,周期阻滞比例随放射剂量增加而增加。在0、2、6、10 Gy剂量的照射后,P6组放射敏感参数（D0、N、Dq、SF2）均低于野生型Hep-2组和对照组（P<0.05)。结论 RNA干扰可下调53BP1表达的Hep-2细胞,减少G2/M周期阻滞,从而增强对放射的敏感性。     

硫链丝菌肽对人喉癌Hep-2细胞生长及FoxM1表达的影响

目的研究硫链丝菌肽(thiostrepton,TST)对人喉癌Hep-2细胞株增殖能力及FoxM1表达的影响。方法用MTT法测定TST作用于人喉癌Hep-2细胞48 h的增殖抑制率;通过流式细胞仪(FCM)检测不同浓度TST分别作用于Hep-2细胞48 h后对其细胞周期动力学的影响;采用免疫细胞化学法、RT-PCR和Western blot检测Hep-2细胞中FoxM1mRNA及蛋白表达,以及不同浓度TST作用于Hep-2细胞48 h FoxM1蛋白表达的变化。结果不同浓度(1、2、4、8、12、16μmol/L)TST作用于Hep-2细胞48 h后的增殖抑制率分别为5.27%、9.43%、20.25%、41.61%、67.96%、96.95%;浓度分别为2、3μmol/L的TST作用于Hep-2细胞48 h后,均使Hep-2细胞停滞于G1/G0期(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05);同时将TST作用于Hep-2细胞48 h后,经免疫细胞化学法、RT-PCR和Western blot均检测到FoxM1 mRNA及蛋白在Hep-2细胞中表达显著降低(P<0.05)。结论 TST对人喉癌Hep-2细胞株具有明显的增殖抑制作用,其可能机制是与降低肿瘤细胞中FoxM1蛋白表达有关。