ASPP1基因mRNA在肿瘤细胞株中的表达初探

目的 建立p53凋亡刺激蛋白基因(ASPP1)mRNA表达水平的RT-PCR测定方法;并应用该方法测定ASPP1 mRNA在正常人单核细胞与白血病细胞株Jurkat,HL-60、K562中的表达水平.方法 应用单核细胞分离液分离正常人血液单核细胞,用RPMI 1640培养液培养细胞株Jurkat、HL-60.K562,所得细胞用Tripure分离试剂提取总RNA,用RT-PCR扩增.取ASPP1基因和β-actin基因的扩增产物各10μl,行溴钇锭染色,在琼脂糖凝胶上进行电泳,检测AsfIP1 mRNA的表达水平.对ASPP1基因表达量与β-actin表达量的比值进行比较,从而计算ASPP1在各细胞株的相对表达量.结果 在正常人单核细胞和各自血病细胞株中均有ASPP1基因的mRNA表达,ASPP1与β-actin的比值在正常人单核细胞中为0.545±0.019,而在白血病细胞株Jurkat、HL-60、K-562中分别为0.155±0.081、0.199±0.016、0.191±0.015,可见ASPP1 mRNA在正常细胞中的表达水平比在白血病细胞株Jurkat、HL-60、K-562中的表达水平高(P＜0.01).结论 在肿瘤的发生、发展中,ASPP1与p53共同作用,形成ASPP-p53复合物作用于原凋亡基因启动子,能特异性增强p53结合DNA的能力,促进p53诱导细胞凋亡的作用.ASPP1的这种功能在抑制正常细胞恶性转化的过程中有重要作用.     

大鼠胚胎肺上皮细胞在肿瘤形成过程中伴发的p53基因突变及辐射敏感性的增

大鼠胚胎肺上皮细胞在肿瘤形成过程中伴发的ｐ５３基因突变及辐射敏感性的增强［英］／ＢｉａｒｄＤＳＦ．．．ＣａｎｅｅｒＲｅｓ．－１９９４．５４．－３３６１～３３６４实验选择４株来源于同一细胞群体，但代表肿瘤形成过程中不同阶段的细胞株（ＢＰ、ＢＰｗｔ、ＨＥ...     

Schlafen2基因在细胞中的表达及其生物学特性研究

目的:建立Schlafen2(Slfn2)基因稳定表达的细胞系以进一步研究其生物学功能.方法:构建pEGFP- Slfn2真核表达载体;瞬时转染pEGFP- Slfn2载体及其对照载体于NIH/3T3细胞,观察细胞中Slfn2基因的表达及分布;稳定转染pEGFP-Slfn2及其对照空载体于NIH/3T3细胞,G418筛选获得抵制的细胞株,用Northern印迹进一步鉴定Slfn2在各细胞株中的表达情况;利用细胞生长曲线和Transwell细胞侵袭实验检测Slfn2对细胞增殖及迁移能力的影响.结果:本研究获得了稳定表达Slfn2的细胞株,该基因表达的蛋白在细胞核及细胞浆均有分布;稳定表达该基因的细胞株的增殖及迁移能力均显著降低.结论:Slfn2基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基因.     

大鼠208F成纤维细胞株对辐射诱发凋亡的敏感性提高不影响其克隆存活的剂量响应

应用大鼠肺208F成纤维细胞株、转染人c-myc基因的RBM7细胞株及Ha-ras基因激活的T₁细胞株,观察同一组织来源的细胞对γ射线及结合于DNA的125I衰变粒子产生的细胞损伤引起细胞凋亡的反应情况。     

EMMPRIN基因表达对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨特异性小分子干扰（small interference,siRNA）抑制人脑胶质瘤U251细胞株内细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）基因的表达后,对U251细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建EMMPRIN基因小干扰RNA,转染人胶质瘤U251细胞株,运用半定量RT-PCR及Western blot的方法验证转染组及对照组的胶质瘤细胞EMMPRIN基因mRNA及蛋白的表达水平,通过MTT法观察转染48 h后对U251细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染48 h后U251细胞周期及凋亡的改变。结果 EMMPRIN基因的特异性siRNA转染U251细胞后,EMM-PRIN基因的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加。结论 EMMPRIN基因的特异性siR-NA能抑制胶质瘤U251细胞株的增殖,促进细胞凋亡。     

利用CRISPR/Cas9系统构建HeLa细胞Cdc25C基因敲除稳定细胞株

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C)基因,构建Cdc25C基因稳定敲除细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C敲除效果.最后用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响.结果 筛选出稳定敲除Cdc25C基因细胞株,且Cdc25C敲除显著影响G2/M期进程.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源Cdc25C基因敲除细胞株,为研究Cdc25C在细胞周期进程的功能以及相关癌症的发生奠定了基础.     

同源盒基因Lhx4在PC12细胞缺氧损伤保护中的作用

目的:转染并筛选Lhx4高表达的PC12细胞株,观察Lhx4基因对PC12细胞的缺氧保护作用.方法:①用RT-PCR检测PC12细胞缺氧培养后Lhx4基因的表达变化;②Lhx4基因连接至pLXIN逆转录病毒载体,收集病毒上清,感染PC12细胞,G418筛选阳性克隆,PCR鉴定,所筛选的克隆缺氧培养;③通过台盼蓝染色和培养液中乳酸脱氢酶活性的检测评价PC12细胞的存活状态.结果和结论:PC12细胞缺氧培养4 h后Lhx4基因的表达明显上调;缺氧8 h后Lhx4基因表达开始下调.所筛选的Lhx4高表达转染细胞株表现出明显的缺氧耐受性,相同的损伤条件下,细胞的存活数目及生存状态明显优于对照组.说明Lhx4基因在PC12细胞的缺氧损伤保护中具有重要的作用.     

逆转录病毒介导的基因转移方法的建立

将人促红细胞生成素（ｈＥＰＯ）、人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）、细胞程序死亡抑制基因（ＢＣＬ－２）重组逆转录病毒质粒ＤＮＡ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７后，经Ｇ４１８抗性筛选，其单克隆细胞株培养上清液均具有感染ＮＩＨ３Ｔ３及大鼠原代成纤维细胞、成肌细胞并形成Ｇ４１８抗性克隆的能力。其感染细胞的染色体ＤＮＡＰＣＲ鉴定结果均为阳性，表明其染色体中均成功地整合了目的基因；感染的靶细胞均能表达外源基因编码蛋白，表明已成功地建立了逆转录病毒介导的基因转移技术。     

Syk表达对乳腺肿瘤细胞侵袭迁移作用的影响

目的:探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)在人乳腺癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响.方法:RT-PCR法、免疫荧光法检测不同侵袭能力乳腺癌细胞株--MCF-7(低侵袭性)和MDA-MB-231(高侵袭性) Syk mRNA及蛋白的表达;采用脂质体介导的方法,将Syk基因导入Syk(-)乳腺癌细胞株,利用Transwell小室法检测Syk基因对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响.结果:Syk mRNA及蛋白在MCF-7细胞中呈中等程度表达,在MDA-MB-231中表达缺失;转染Syk基因的MDA-MB-231细胞与转染空载体及未转染MDA-MB-231细胞相比,侵袭及迁移实验中的穿膜细胞数(总迁移细胞数/5HPF)均明显减少(P＜0.05).结论:Syk表达可降低乳腺肿瘤细胞体外侵袭迁移能力.     

稳定转染小鼠IL-17全长基因的乳腺癌细胞株的建立及基因转染对4T1细胞的影响

目的建立稳定转染小鼠IL-17基因全长的小鼠乳腺癌4T1细胞株,并进行鉴定。方法脂质体法将携带小鼠IL-17基因全长的真核表达载体pcDNA3．1转染小鼠乳腺癌细胞4T1,经G418筛选出稳定表达IL-17的细胞株;镜下观察细胞形态,RT-PCR法、Western印迹和激光共聚焦法检测目的基因和蛋白的表达;收集转染和未转染IL．17的4T1细胞的培养上清,分别与巨噬细胞RAW264．7共培养,ELISA法检测RAw264．7细胞培养上清中IL-6水平;MTS法检测细胞的增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期、凋亡以及细胞表面MHCI、MHC11、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）等分子表达。结果获得1株稳定表达IL-17的4T1细胞,而且其培养上清可刺激小鼠巨噬细胞RAW264．7产生IL-6,证明该细胞可表达功能性IL-17。结论成功建立了稳定转染IL-17基因的小鼠乳腺癌细胞株。     

非编码基因MEG3稳定表达细胞株建立及其对p53转录活性的影响

目的构建人类长链非编码RNA母系表达基因3（MEG3）的真核表达载体,筛选MEG3稳定高表达的肝癌细胞株,分析MEG3过表达对p53转录活性的影响。方法根据GenBank中MEG3的基因序列设计合成特异引物,从肝癌细胞中扩增MEG3的cDNA序列,将其构建入pcDNA3.0真核表达载体中,得到pcDNA3.0-MEG3表达载体,转染肝癌细胞SK-Hep-1,用G418筛选稳定株,采用RT-PCR技术检测转染细胞中MEG3基因表达,采用荧光素酶报告基因技术分析MEG3过表达细胞中对p53介导的基因转录活性的影响。结果成功构建了MEG3真核表达质粒pcDNA3.0-MEG3,筛选获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,双荧光报告实验结果显示MEG3过表达能增强p53介导的转录激活作用。结论本研究获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,为深入分析MEG3的功能及其作用机制奠定了基础。     

人乳腺癌B7-H3分子的高表达及其抑制T淋巴细胞活化增殖作用的机制

目的探讨乳腺癌组织及细胞中高表达协同刺激分子B7-H3对T淋巴细胞作用的机制。方法 RT-PCR及流式细胞仪方法分析乳腺癌组织及细胞中B7-H3基因的高表达,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,采用脂质体法转染乳腺癌细胞株MCF-7,采用免疫荧光标记和流式细胞术分析在MCF-7细胞上的表达。继而,利用CCK8法和酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析B7-H3基因干扰细胞株对T细胞体外增殖和细胞因子的分泌。结果乳腺癌组织和细胞中高表达B7-H3分子,成功通过RNAi技术构建低表达B7-H3基因乳腺癌细胞株。体外生物学功能分析表明,与转染空载体的MCF-7/mock细胞相比,B7-H3表达干扰细胞能有效增强T细胞增殖以及对IFN-γ的分泌。结论乳腺癌中高表达协同刺激分子B7-H3能有效逃避T淋巴细胞对其的作用和杀伤。     

mag-1基因与肿瘤细胞转移的相关性研究

目的:探讨mag-1基因与肿瘤细胞转移的关系.方法:检测mag-1在人肺巨细胞癌高低转移细胞株PLA801D与PLA801C、肺癌高低转移细胞株A549与H1299及乳腺癌高低转移细胞株MCF-7与MDA-MB-231中mag-1的表达水平;检测构建的mag-1正反义真核表达载体转染细胞后mag-1表达水平的变化;将mag-1正义表达载体分别转染低转移细胞株PLA801C及MCF-7并筛选出稳定克隆;研究mag-1过表达对细胞形态、增殖、迁移、黏附及侵袭等生物学行为的影响.结果:高转移细胞株PLA801D中mag-1的mRNA及蛋白表达水平均显著高于低转移细胞株PLA801C中mag-1的表达水平,乳腺癌高低转移细胞株中mag-1的蛋白表达水平也有明显的差异;过表达mag-1细胞的形态及增殖能力没有发生改变,而细胞的黏附、迁移及侵袭能力增强.结论:mag-1可能促进肿瘤细胞的转移.     

实时荧光定量RT—PCR检测胃癌细胞中MRP2、MRP3及MRP5mRNA的表达

目的研究多药耐药相关蛋白2（MRP2）基因及MRP3、MRP5基因在正常胃细胞系GES-1、胃癌细胞株（BGC-823）及胃癌耐药细胞株BGC-823／ADM的表达差异,并探讨其在胃癌耐药中的意义。方法分别提取GES-1、BGC-823及BGC-823／ADM细胞的总RNA,逆转录cDNA,利用实时荧光定量PCR,根据标准品绘制标准曲线,检测MRP2、MRP3、MRP5基因的表达水平。结果MRP2基因在胃癌耐药细胞株BGC～823／ADM细胞中的表达量明显高于在胃癌细胞株（BGC-823）的表达,而与其在正常胃细胞系GES-1的表达没有显著性差异;MRP3、MRP5基因表达量在三种细胞中均有显著性差异。结论MRP2可能参与了胃癌的内在性耐药,而MRP3、MRP5可能与胃癌的获得性耐药有关,实时荧光定量方法是一种灵敏度高,特异性强,重复性好的定量检测方法。     

人MEPE基因稳定表达细胞系的建立及MEPE蛋白在DNA损伤应答中的功能初探

目的构建人MEPE基因真核表达载体,稳定转染人胚肾293T细胞,并建立稳定表达细胞株;初步探讨人MEPE蛋白在DNA损伤应答中的作用。方法将人MEPEcDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建重组质粒;分别将载体pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA转染293T细胞;经潮霉素B加压筛选阳性克隆;用RT-PCR和免疫印迹方法分别在RNA水平和蛋白水平鉴定稳定表达MEPE-HA融合蛋白的阳性细胞株;利用一定浓度的DNA损伤诱导剂喜树碱（camptothecin,CPT）处理细胞,通过MTT比色法检测不同时间点细胞存活率的变化,其趋势即可反映出不同细胞株对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果经酶切鉴定及序列分析,人MEPE基因真核表达载体pREP10/MEPE-HA构建正确,转染人293T细胞,筛选出MEPE表达较高的细胞株,并且发现该基因的高表达可以使细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性提高。结论成功建立了稳定表达人MEPE的293T细胞株,并对人MEPE蛋白在细胞中对DNA损伤诱导剂敏感性的影响进行了初步探讨,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。     

黑色素瘤细胞经太空环境诱变后致瘤性和基因表达变化

目的 筛选经太空环境诱变后B16细胞致瘤性改变的细胞株,观察其基因表达的改变,寻找与黑色素瘤发生及转移密切相关的基因.方法 将小鼠黑色素瘤B16细胞搭载于第20颗返回式卫星,返地后克隆化,随机选择5株克隆细胞株（1^#、5^#、6^#、7^#和8^#）,接种C57BL/6J小鼠,分别观察细胞致瘤性、荷瘤小鼠生存期及瘤体病理变化,用基因表达谱分析其中2株初筛致瘤性改变细胞株（1^#和8^#）的基因表达情况。结果 与对照组比较,1#细胞株接种小鼠后,肿瘤潜伏期延长（P＜0.05）,1^#和8^#细胞株移植瘤瘤体重量减小（P＜0.01）,且荷瘤小鼠生存期延长（P＜0.01）;病理诊断结果显示：1^#和8^#细胞移植瘤内血管不及对照组丰富,坏死区较少,瘤体内浸润淋巴细胞较对照组有不同程度的增多,瘤旁组织内有较多淋巴细胞;基因芯片分析结果表明：与对照B16细胞相比,2株诱变细胞（1^#和8^#）分别有145和125个基因表达水平发生改变（P＜0.05）,其中9个基因为共同变化基因,前列腺素D2合成酶基因在2株细胞中的表达均明显增高,与对照相比,差别在5倍以上。结论 1^#和8^#细胞株致瘤性减弱,且2株细胞的移植瘤肿瘤新生血管及癌旁浸润减少,癌旁组织中有较多淋巴细胞,推测可能与前列腺素D2合成酶等多种肿瘤相关基因表达的改变有关。     

人钠/碘同向转运体基因转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究

目的 在体外细胞实验中证明转染人钠/碘同向转运体(hNIS)基因介导放射性碘治疗胶质瘤是有效的.方法 以脂质体转染法、用重组质粒将hNIS基因转染至人胶质瘤细胞株U251中.经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIS-U251),然后进行体外摄125I实验、NaClO4抑制实验、体外125I外流和内流实验,并绘制时间-放射性曲线.对经3700 MBq/L 131I处理的hNIS-U251细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTY)分析和流式细胞仪测定分析.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(LSD法).结果 hNIS-U251细胞株可以摄取碘,其摄碘能力较U251细胞提高117倍左右[2种细胞所摄取125I分别为(50 469.88±997.29)和(432.92±89.28)计数·min-1].经131I处理后,hNIS-U251细胞株的细胞增殖活性低于U251细胞株,两者S期细胞比率(SPF)差异有统计学意义(t=35.5,P＜0.001);增殖指数(PI)差异有统计学意义(t=6.33,P＜0.05).结论 131I可以被hNIS-U251细胞摄取,而且可以有效地杀伤胶质瘤细胞.     

利用CRISPR／Cas9系统构建H22细胞GP73基因敲除稳定株及功能鉴定

目的：利用CRISPR／Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因,构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR／Cas9靶点设计原则,设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA,利用载体pX459质粒,构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染至H22细胞内,使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株,利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响,再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达;并且GP73被敲除后,H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR／Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒,并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株,从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。     

CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA-Lentivector载体连接得到LV-CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV-CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151 RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×108ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Slc35c1敲除细胞株及其抗蓖麻毒素效应研究

目的 构建稳定敲除小鼠Slc35c1基因的单克隆细胞株,为研究Slc35c1基因抗蓖麻毒素毒性效应奠定实验基础.方法 根据Slc35c1基因序列设计2对sgRNA插入载体lentiCRISPRv2中,构建lentiCRISPRv2-sgRNA质粒;慢病毒包装并感染NIH/3T3细胞,加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;T7E1酶切鉴定sgRNA切割效率;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行RT-qPCR检测及基因组PCR产物测序,确认Slc35c1敲除成功的细胞株;最后通过CCK-8试剂检测蓖麻毒素对野生型和Slc35c1敲除细胞对的抗毒效应差异.结果 测序结果显示sgRNA成功插入载体质粒中,T7E1酶切结果表明两对sgRNA均可高效切割基因组DNA.RT-qPCR及基因组PCR产物测序鉴定出Slc35c1敲除的纯合子细胞株.CCK-8实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除Slc35c1使毒素作用NIH/3T3细胞24 h的IC50值由0.45×10-10 mol/L升至2.1×10-10 mol/L.结论 利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除了NIH/3T3细胞中的Slc35c1基因并筛选获得纯合子细胞株,该细胞株可用于抗蓖麻毒素效应的研究.